СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С3 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА ПО АЛЬТЕРНАТИВНОМУ ПУТИ АКТИВАЦИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/573 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание, как антигена. Тем не менее, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонента С3 комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1] определения активности С3, проявляющейся в активации системы по классическому пути, не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Компонент С3 является ключевым в активации альтернативного пути. Методы определения активности, проявляемой компонентом С3 комплемента человека в альтернативном пути, по-видимому, не описаны.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 системы комплемента человека в альтернативном пути активации на основе иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета активатора альтернативного пути комплемента, выбранного из ряда: иммуноглобулин A, G или смесь иммуноглобулинов А, G, М, компонент С3, липополисахарид, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент R3 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С3), и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С3, в результате чего происходит активация этой конвертазой С3 и ковалентное связывание последнею на сорбированном активаторе), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования таких плохо сохраняемых и трудно стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата С3. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - иммунохимически чистый IgA в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’-тетраукусную кислоту и 5 мМ MgCl₂ (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента R3 (R3 - сыворотка крови человека, обработанная полунасыщенным раствором КВr в течение 18 ч на холоде [1]) и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл нитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата С3 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности С3 в образцах с известным содержанием активного С3. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 2. Определение функциональной активности препарата С3 проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют иммуноглобулин G. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 3. Определение функциональной активности препарата С3 проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют КИП - комплексный иммуноглобулиновый препарат, содержащий иммуноглобулины G, А и М. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 4. Определение функциональной активности препарата С3 проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют препарат компонента С3 морской свинки. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 5. Определение функциональной активности препарата С3 проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют липополисахарид (ЛПС - препарат клеточной стенки бактерий, пирогенал). Полученные результаты приведены в таблице.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. №5. С.652-659.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека, и может быть использовано при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность изобретения состоит в том, что в лунках микропланшета сорбируют активатор альтернативного пути комплемента, затем вносят раствор, содержащий реагент R3, и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺ вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, расчет активности С3 проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 системы комплемента человека в альтернативном пути активации. 1 табл.

Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропланшета активатор альтернативного пути комплемента, выбранный из ряда иммуноглобулины A, G или смесь иммуноглобулинов A, G, М, компонент С3, липополисахарид, затем в лунки микропланшета вносят раствор, содержащий реагент R3, и анализируемую пробу, содержащую компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии ионов Mg²⁺ и в отсутствие ионов Са²⁺, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.