СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С2 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента С2 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропланшета реагента R2 (сыворотки человека, лишенной компонента С2 с сохранением активностей остальных компонентов комплемента, получаемой, например, прогреванием ее в течение 30 мин при 50°С [2]) и анализируемой пробы, содержащей компонент С2 с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит формирование на сорбированном иммуноглобулине С3-конвертазы (C4bC2a) в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С2, а также активация этой конвертазой компонента C3 и ковалентное связывание последнего на молекулах сорбированного иммуноглобулина. Таким образом, количество связавшегося C3 зависит от количества С3-конвертазы, т.е. количества определяемого компонента С2. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C3, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С2 образовывать С3-конвертазу, количество которой определяется по количеству связавшегося в лунках активированного C3. Тем самым достигается определение функциональной активности С2 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Недостатком этого способа является трудность получения иммунохимически чистых препаратов иммуноглобулина G человека и плохое сохранение активирующей способности при хранении.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С2 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесения в лунки микропланшета реагента R2 (сыворотки человека, лишенной компонента С2 с сохранением активно-стей остальных компонентов комплемента, получаемой, например, прогреванием ее в течение 30 мин при 50°С [2]) и анализируемой пробы, содержащей компонент С2 с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит формирование на сорбированном иммуноглобулине С3-конвертазы (C4bC2a) в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С2, а также активация этой конвертазой компонента C3 и ковалентное связывание последнего на молекулах сорбированного иммуноглобулина. Таким образом, количество связавшегося C3 зависит от количества С3-конвертазы, т.е. количества определяемого компонента С2. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С2 образовывать С3-конвертазу, количество которой определяется по количеству связавшегося в лунках активированного C3. Тем самым достигается определение функциональной активности С2 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, реагент R2, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента С2, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования трудно выделяемого и плохо сохраняющего свою активирующую способность препарата иммуноглобулинов.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента С2. Растворяют аптечный препарат дерината в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, отмывают планшет тем же буфером, затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBS²⁺, содержащего 10 мкл реагента R2 (R2 - сыворотка крови человека, прогретая при 50°С в течение 35 мин) и анализируемую пробу, содержащую компонент С2 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т), и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С2 рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, реагент R2, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С2.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С2 с коэффициентом корреляции R²=0,996, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С2 описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Гузова В.А. Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека. 2000. Патент РФ 2195670. Бюл. №36. 27.12.2002.

2. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, C3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. №5. С.652-659.

Проводят сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия. Затем в лунки вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С2 с неизвестной активностью и раствор реагента R2 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С2). Проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 и субстрат этого фермента. Проводят расчет активности компонента С2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, реагент R2 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С2), субстратный буфер и стандарт с известной активностью С2. Способ позволяет достоверно определять компонент С2 с использованием в качестве активатора доступного и стабильного препарата деринат. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент С2 комплемента человека с неизвестной активностью, и раствора, содержащего реагент R2, инкубацию, выливание содержимого лунок, внесение конъюгата фермента с антителами против компонента C3 человека, а затем, после инкубации и удаления инкубационного раствора, внесение субстрата этого фермента, проведение расчета активности компонента С2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, реагент R2, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С2.