БИОКАТАЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК C12N11/04 C12N11/18 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов, включенных в матрицу гелевого носителя, которые способны осуществлять энзиматическую трансформацию соответствующих субстратов в периодических или непрерывных режимах.

Известно, что иммобилизация ферментов позволяет значительно повысить технологичность их применения, прежде всего из-за возможности перехода от одноразового к многократному использованию биокатализаторов [Иммобилизованные клетки и ферменты. // Под ред. Дж.Вудорда, пер. с англ. М.: Мир, 1988, с.12-29]. При этом одним из наиболее эффективных приемов иммобилизации ферментов является их включение в матрицу различных полимерных гелей за счет физического захвата или химического присоединения [Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов Ф.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. - М.: Высшая школа, 1987, с.47-96].

Известен биокатализатор, представляющий собой фермент липазу, физически включенную в частицы высококонцентрированного 30-50% желатинового геля [US Pat. №6280983 (1999) Enzyme immobilization in a gel containing 30 to 50 percent gelatin]. Способ получения этого биокатализатора предусматривает приготовление смеси водорастворимого фермента, желатина и воды при соотношении 8,8-88 мг липазы на 1,4 г желатина и 1,8 г воды (т.е. концентрация фермента находится в пределах от 0,275 до 2,75 мас.%), нагревание смеси до температуры, при которой растворяется желатин (обычно это температуры выше 40-50°С), а затем охлаждение полученного раствора ниже температуры гелеобразования желатина (от 30 до 5°С) и механическое измельчение полученного геля для получения частиц биокатализатора. Этот биокатализатор обладает липазной активностью и может быть использован в реакциях переэтерификации триглицеридов. Несмотря на простоту приготовления подобного биокатализатора, данное техническое решение имеет ряд недостатков:

а) Получение биокатализаторов такого типа ограничено только термостабильными ферментами, поскольку сначала необходимо нагревать смесь фермента с гелеобразователем - желатином для получения исходного раствора, желируюшего при последующем охлаждении; чувствительные же к нафеванию ферменты в этих условиях инактивируются.

б) С другой стороны, такой биокатализатор нельзя использовать при повышенных температурах из-за недостаточной термостабильности желатинового геля, который выше ~40°С расплавляется.

в) Кроме того, так нельзя иммобилизовать протеолитические ферменты, которые гидролизуют сам белковый носитель, т.е. нарушают целостность биокатализатора.

г) И, наконец, биокатализатор, сформированный по данному способу, является очень хрупким, т.е. его нельзя использовать с реакторах с интенсивным перемешиванием.

Известен биокатализатор и способ его получения [US Pat. №6303290 (2001) Encapsulation of biomatenals in porous glass-like matrices prepared via an aqueous colloidal sol-gel process], когда фермент (например, цитохром С, каталаза, рибонуклеаза и др.) физически включен в матрицу носителя - неорганический гель - силикагель. Данный биокатализатор получают путем смешения золя кремниевой кислоты с раствором фермента при рН от 6,2 до 8,2 и поддержанием необходимой ионной силы среды добавлением соли (например, NaCl) с последующим формованием системы и превращением золя в гель, который далее высушивают при температуре около 4°С. В зависимости от режима сушки получают материал с порами в диапазоне от 1 до 100 нм.

Недостатками этого технического решения являются:

а) Несмотря на высокую статическую механическую прочность матрицы неорганического носителя, он является очень хрупким материалом, легко подвергаемым абразивной эрозии в реакторах с перемешиванием.

б) Кремнеземные матрицы гидролитически нестабильны при щелочных значениях рН, т.е. соответствующий биокатализатор постепенно растворяется даже в слабощелочных средах, теряя свои эксплуатационные характеристики.

в) Силикагели обладают выраженными адсорбционными свойствами, что приводит к нежелательным эффектам неспецифической сорбции субстратов или продуктов ферментативных реакций материалом носителя.

Известен биокатализатор и способ его получения, когда иммобилизованный включением в гелевый носитель фермент - пенициллин-G-ацилаза - еще дополнительно связывается с полимерной матрицей химически [WO №04086 (1997) Penicillin G acylase immobilized with a cross-linked mixture of gelled gelatin and amino polymer]. Согласно этому техническому решению при включении указанного фермента в матрицу желатинового геля в исходный горячий (примерно 50°С) раствор, используемый для приготовления носителя, кроме желатина и фермента еще дополнительно вносятся аминосодержащий водорастворимый полимер (например, хитозан или полиэтиленимин) и химический сшиватель (например, глутаровый альдегид). В результате после охлаждения и завершения химической реакции получается ферментсодержащий смешанный желатинхитозановый гель, поперечно-сшитый альдиминовыми ковалентными связями. Такой биокатализатор проявляет высокую стабильность и синтазную активность при получении полусинтетических пенициллинов.

Недостатки этого технического решения:

а) Подобного типа биокатализаторы имеют весьма ограниченное применение, т.к. лишь очень немногие ферменты выдерживают такое сочетание неблагоприятных факторов как нагревание и присутствие глутарового альдегида.

б) Сшитый желатиновый гель обладает хрупкостью и быстро истирается в реакторах с интенсивным перемешиванием.

в) В случае образования осадка продукта энзиматической реакции (что часто имеет место даже при умеренных концентрациях таких полусинтетических пенициллинов, как бензилпенициллин) его растущие кристаллы разрушают (разрывают) сшитый гелевый носитель из-за микропористой структуры и недостаточной эластичности такого геля.

Известен биокатализатор [Yu.N.Belokon’, К.A.Kochetkov., F.M.Plieva, N.S.Ikonnikov, V.I.Maleev, V.S.Parmar, R.Kumar, V.I.Lozinsky. Enantioselective hydrolysis of a Schiff's base of D, L-phenylalanine ethyl ester in water-poor media through the reaction catalyzed with α-chymotrypsin immobilyzed in hydrophilic macroporous gel support. // Appl. Biochem.Biotechnol., 88 (1-3), 97-106 (2000)], в котором этот недостаток преодолен. Биокатализатор представляет собой фермент α-химитрипсин, ковалентно присоединенный к эластичному макропористому носителю - криогелю поливинилового спирта (ПВС) [Лозинский В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Усп.химии, 67 (7), 641-655 (1998)]. В случае использования такого биокатализатора в энзиматической реакции стереоспецифического гидролиза этилового эфира рацемического фенилаланина, проводимого в среде с низким содержанием воды, образующийся продукт - Л-фенилаланин выпадает в осадок, но его кристаллы не разрушают биокатализатор, т.к. матрица носителя является макропористой, т.е. имеется свободное пространство для роста кристаллов. Способ получения такого биокатализатора включает три основных стадии: формирование гелевого носителя, введение в его структуру реакционноспособных группировок (в частности, альдегидных групп, что осуществляется обработкой гранул геля 5-15% водным раствором глутарового альдегида при рН 1) и ковалентное присоединение фермента к активированной матрице.

Недостатком этого технического решения является довольно низкое содержание фермента - не более 5-10 мг белка на 1 г влажного биокатализатора, т.е. в процентном отношении емкость системы по активному началу составляет лишь 0,5-1,0 мас.%.

Известен биокатализатор, у которого матрица полимерного носителя также готовится из ПВС [H.Groeger, E.Capan, A.Barthuber, K.-D.Vorlop. Asymmetric synthesis of an (R)-cyanohydrin using enzymes entrapped in lens-shaped gels. // Organic Letters, 3 (13), 1969-1972 (2001): методика получения биокатализатора описана в дополнительных материалах к статье, имеющихся в открытом доступе на интернет-сайте данного журнала: http://pubs.acs.org]. Этот биокатализатор представляет собой фермент (R)-оксинитрилазу, ковалентный конъюгат которой с хитозаном физически включен в матрицу геля ПВС (так называемый LentiKat® gel).

Способ получения этого биокатализатора состоит из следующих стадий:

а) Сначала получают сшитый конъюгат фермента с полиаминосахаридом - хитозаном, для чего 1,5 г хитозана растворяют в 98,5 г 0,5%-ной водной уксусной кислоты, после чего с помощью 1 М раствора NaOH доводят рН раствора до 5,5. К 4,0 г полученного раствора прибавляют при перемешивании 7,9 г водного раствора ферментного препарата с концентрацией белка 7,6 мг/мл и удельной оксинитрилазной активностью 13,6 ед./мг белка, куда после перемешивания прибавляют 0,2 мл 50%-ного водного раствора глутарового альдегида. Затем перемешивают реакционную массу при 4°С в течение 16 ч. Сенергированную жидкость отделяют центрифугированием и получают сшитый конъюгат (R)-оксинитрилазы с хитозаном. Этот препарат содержит около 30 мг белка (или примерно 408 единиц ферментативной активности) на 1 г общего веса.

б) Далее проводят операцию включения полученного конъюгата в гель поливинилового спирта, для чего 2,07 г конъюгата смешивают с 7,9 г воды и 74 г раствора ПВС (общий вес раствора ~84 г, т.е. концентрация белка в нем составляет около 0,7 мг/мл или 0,07%), а затем наносят по каплям раствор полученной смеси на металлическую плиту, где за счет подсыхания на воздухе и протекающего при этом желирования ПВС каждая капля превращается в небольшую линзочку толщиной около 0,5 мм и диаметром от 3 до 5 мм (определяется степенью дегидратации при сушке). В принципе, каждую такую частицу можно рассматривать как маленькую полимерную пленку - хорошие пленкообразующие свойства ПВС широко известны [Мнацаканов С.С. Поливиниловый спирт. // В кн. “Энциклопедия полимеров”. М.: Советская энциклопедия, 1974, т.2, с.787-792]. В зависимости от влажности препарата ферментативная активность такого биокатализатора составляет от 8 до 40 ед./г или в пересчете на массу белка от 0,588 до 2,94 мг/г (0,059-0,294 мас.%).

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по природе полимерной основы носителя и физическому состоянию включаемого в полимерный гель биологически-активного действующего начала (фермента) принято за прототип.

Этот биокатализатор и способ его получения имеют ряд недостатков:

1. Используемый полимерный носитель - пленочный гель ПВС - имеет низкую термостабильность (нековалентные гели ПВС растворяются в водных средах при температурах всего 30-40°С [Роговина Л.3., Слонимский Г.Л., Гембицкий Л.С., Серова Е.А., Григорьева В.А., Губенкова Е.Н. Влияние растворителя на процесс студнеобразования поливинилового спирта. // Высокомолекул. соед., 15А (6), 1256-1265 (1973)], поэтому он не может быть использован для иммобилизации термостабильных ферментов, работающих при повышенных температурах.

2. Биокатализатор имеет низкое содержание фермента (не более 0,3 мас.%), т.е. обладает недостаточной удельной энзиматической активностью в расчете на вес или объем биокатализатора.

3. Биокатализаторы такого типа неэффективны для работы с высокомолекулярными субстратами, т.к. пленочный гель ПВС имеет поры размером меньше, чем полимерные макромолекулы, поэтому такие субстраты, как белки, нуклеиновые кислоты или полисахариды, не способны диффундировать в данный носитель иммобилизованных ферментов и не могут взаимодействовать с действующим началом биокатализатора.

4. Линзообразная форма биокатализатора не является оптимальной с точки зрения простоты отделения биокатализатора от реакционной среды фильтрованием, поскольку частицы такой формы способны распластываться на фильтрах, закрывая их вплоть до полного прекращения протекания фильтрата.

5. Способ получения биокатализатора не обладает универсальностью, т.к. включает иммобилизацию только исходно растворимого фермента с обязательным получением ферментхитозанового ковалентного конъюгата, другие варианты исходного фазового состояния иммобилизуемого фермента (коагулят, порошок, гель и т.д.) в способе-прототипе не предусмотрены.

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного биокатализатора с повышенной емкостью по иммобилизованному ферменту, увеличенной пористостью и термостабильностью, а также повышение универсальности способа получения биокатализатора в отношении исходного фазового состояния иммобилизуемого фермента.

Поставленная задача решается тем, что заявляемый биокатализатор является нерастворимым препаратом фермента или ферментов, включенным в матрицу геля на основе поливиниловою спирта, при этом нерастворимый препарат фермента или ферментов представляет собой или сшитый гель, или сшитый коагулят, или сшитые белковые кристаллы, или частицы, состоящие из ферментативно-неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно, а матрица полимерного геля представляет собой криогель поливинилового спирта, причем соотношение компонентов составляет, мас.%:

Нерастворимый препарат фермента 1-20

Поливиниловый спирт 8-16

Вода До 100

Способ получения заявляемого биокатализатора заключается в диспергировании указанного нерастворимого препарата фермента или ферментов в водном растворе поливиниловою спирта с последующим замораживанием полученной дисперсии при -5...-40°С в течение 4-48 ч и дальнейшим размораживанием со скоростью 0,001-0,2°С/мин.

Существенным отличием заявляемого изобретения является то, что биокатализатор представляет собой криогель поливинилового спирта (ПВС), в матрицу которого включен нерастворимый препарат фермента или смеси ферментов. При этом изобретение предусматривает следующие варианты нерастворимого препарата фермента, включаемого в матрицу криогеля:

- нерастворимый препарат фермента или ферментов в виде химически сшитого геля, получаемого как ковалентным сшиванием самого фермента или ферментов в растворе (пример №4), так и сшиванием фермента или ферментов в присутствии энзиматически-инертного вспомогательного растворимого полимера (примеры №1-3);

- нерастворимый препарат фермента в виде сшитого коагулята, получаемого введением осадителя(ей) в раствор фермента или ферментов с одновременным или последующим действием химического сшивателя (примеры №7, 8);

- нерастворимый препарат фермента в виде сшитых ферментных кристаллов (пример №6);

- нерастворимый препарат фермента или ферментов в виде частиц правильной или неправильной формы, состоящих из ферментативно-неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно (примеры №5, 9, 10).

Самому же биокатализатору может быть придана любая желаемая форма: сферических частиц, дисков, блоков, трубок, частиц неправильной формы и др.

В качестве фермента или их смеси заявляемое изобретение предусматривает использование любых ферментов или их препаратов совершенно разнородных по природе и типу энзиматической активности ферментов, например гликозидаз (примеры №1, 2, 8), протеаз (примеры №3, 4, 6, 7), липаз (пример №9), лиаз (пример №5), оксидоредуктаз (пример №10) и др.

Реализация заявляемого способа включает стадии диспергирования нерастворимого препарата фермента или ферментов в водном растворе ПВC (осуществляется обычным перемешиваем при положительных температурах), замораживание полученной дисперсии при -5...-40°С в течение 4-48 ч (для чего используются соответствующие морозильные камеры или бани с известными хладоагентами) и дальнейшее размораживание со скоростью 0,001-0,2°С/мин (эта последняя стадия обычно осуществляется с помощью программируемых криостатов, позволяющих проводит контролируемый нагрев замороженных объектов).

Конкретные варианты реализации заявляемого технического решения иллюстрируются примерами.

Пример 1. Биокатализатор на основе смеси амилолитических ферментов

К 10 г сухого препарата смеси амилолитических ферментов Амилосубтилин ГЗх (Омутнинский з-д ОАО "Восток", Россия), обладающего суммарной α-амилазной и β-глюканазной активностями, прибавляют 85 г 5%-ного водного раствора овальбумина, перемешивают до полного растворения сухого вещества, с помощью 1 N NaOH доводят рН раствора до 8,2-8,3 и вносят 5 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида. После 6-часовой выдержки при 15-18°С получается сшитый гель, который измельчают до частиц неправильной формы размером 40-250 мкм. Далее эти частицы диспергируют в 400 мл 16%-ного (мас.%) водного раствора ПВС, перемешивают до получения равномерной суспензии, а затем подвергают криогенной обработке (замораживанию-оттаиванию) при -10°С в течение 12 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,2°С/мин. Получают блок композитного криогеля ПВС, содержащего включенные частицы нерастворимого препарата фермента. Этот блок измельчают до частиц неправильной формы размером 2-4 мм. В результате получают биокатализатор с содержанием амилолитических ферментов 2 мас.% (по белку) и ПВС - 12,8 мас.%. Амилолитическая активность полученного биокатализатора (измерена в 0,1 М Na-цитратном буфере, рН 6,0; 45°С) составляет 85% от активности исходного препарата Амилосубтилин ГЗх в расчете на 1 мг белка.

Пример 2. Биокатализатор на основе глюкоамилазы

К 2,5 мл жидкого препарата Глюкаваморин Гх (Омутнинский з-д ОАО "Восток", Россия), обладающего α-глюкоамилазной активностью, прибавляют 1,5 мл нагретого до 40°С 14%-ного водного раствора желатина и быстро вносят 1 мл 0,5%-ного водного раствора глиоксаля. Выдерживают раствор 30 мин при 40°С и затем 18 ч при комнатной температуре. В результате получают сшитый гель, который измельчают до частиц неправильной формы размером 50-150 мкм. Далее эти частицы диспергируют в 6 мл 18%-ного водного раствора ПВС (мас.%), перемешивают до получения равномерной суспензии, которую помещают в цилиндрическую форму с кольцевым зазором шириной 5 мм, а затем подвергают криогенной обработке при -24°С в течение 24 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,02°С/мин. Получают композитный криогель ПВС в виде трубки с толщиной стенок 5 мм, содержащей включенные частицы нерастворимого препарата фермента. После промывки изделия в ванне с проточной водой получают биокатализатор с содержанием глюкоамилазы 3,2 мас.% (по белку) и ПВС - 9,7 мас.%. Глюкоамилазная активность полученного биокатализатора (измерена в 0,1 М Na-цитратном буфере, рН 4,5; 60°С) составляет 64% от активности исходного препарата Глюкаваморин Гх в расчете на 1 мг белка.

Пример 3. Биокатализатор с наполнителем на основе трипсина, сшитого в присутствии синтетического полимера

Трипсин (препарат фирмы Spofa, Чехия) в количестве 0,15 г и чередующийся сополимер N-винилпирролидона с виниламином в количестве 0,4 г растворяют в 3 мл 0,01 N НСl, а затем доводят рН полученного раствора до 7,2 с помощью 1 N NaOH. Далее раствор охлаждают в ледяной бане, вносят 0,01 г водорастворимого карбодиимида, перемешивают и инкубируют при 4-6°С в течение 15 ч. К полученному клейстерообразному препарату прибавляют 3 мл 22%-ного (мас.%) раствора ПВС в 0,1 М NaSCN и гомогенизируют полученную смесь в измельчителе биологических тканей. Затем помещают гомогенат в кольцевидную форму и подвергают криогенной обработке при -15°С в течение 48 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,1°С/мин. Получают композитный криогель ПВС, содержащий включенный нерастворимый препарат фермента; композит имеет форму кольца с внешним диаметром 32 мм и внутренним диаметром 22 мм. Полученный биокатализатор содержит 2,5 мас.% трипсина и 11 мас.% ПВС. Ферментативная активность полученного биокатализатора при гидролизе п-нитроанилида Nα-бeнзoил-DL-apгининa (измерена в 0,3 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0; 25°С) составляет 81% от активности исходного препарата трипсина в расчете на 1 мг белка.

Пример 4. Биокатализатор с наполнителем на основе частиц сшитого трипсина

Трипсин (препарат фирмы Fluka, Швейцария) в количестве 0,15 г растворяют в 4 мл 0,01 N НСl, затем доводят рН полученного раствора до 7,2 с помощью 1 N NaOH и добавляют воды до общего объема 4,5 мл. Раствор охлаждают в ледяной бане и при интенсивном перемешивании вносят 0,5 мл 0,05%-ного водного раствора глутарового альдегида. Перемешивание на холоде продолжают в течение 5 ч, в результате чего получается суспензия гелевых частиц сшитого трипсина. Частицы имеют неправильную форму и размеры от 0,1 до примерно 1,5 мм (определено с помощью световой микроскопии). Нерастворимый продукт отделяют фильтрованием, промывают на фильтре водой до отсутствия запаха глутарового альдегида. Этот материал диспергируют в воде и измельчают в гомогенезаторе Поттера до частиц размером не более 50 мкм. После отделения воды центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин 2 г полученного влажного препарата сшитого трипсина (содержание белка в препарате 0,7 г/г) смешивают с 8 мл 17%-ного (мас.%) водного раствора ПВС. Тщательно перемешивают смесь до получения равномерной суспензии, из которой затем известным методом монодисперсного гранулирования [Пат. РФ №2036095 (1992). Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем] формируют гранулы композитного криогеля ПВО диаметром 2-3 мм. Замораживание проводят при -40°С в течение 4 ч, гранулы оттаивают со скоростью 0,03°С/мин. В результате получают гранулированный биокатализатор с содержанием трипсина 14 мас.% и ПВС-13,6 мас.%. Ферментативная активность полученного биокатализатора при гидролизе п-нитроанилида Nα-бензоил-DL-аргинина (измерена в 0,3 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0; 25°С) составляет 75% от активности исходного препарата трипсина в расчете на 1 мг белка.

Пример 5. Биокатализа тор на основе L-тирозин-декарбоксилазы

20 г обезжиренной овечьей шерсти (очес - отходы производства шерстяной пряжи) помещают на 30 мин в жидкий азот, а затем измельчают до фрагментов длиной не более 1-2 мм. Далее 2 г полученного материала диспергируют в 20 мл 0,01 N NaOH, вносят 0,1 мл дивинилсульфона и перешивают 2 ч при комнатной температуре. Нерастворимый продукт промывают дистиллированной водой и диспергируют в 10 мл раствора (3 мг белка в 1 мл 0,05 М Na-фосфатного буфере, рН 6,8) L-тирозин-декарбоксилазы (Sigma, США). Суспензию перемешивают 18 ч при 4-6°С (при этом происходит ковалентное присоединение фермента к волокнам шерсти, модифицированной дивинилсульфоном), а затем отделяют нерастворимый материал центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин. Получают 4,2 г влажного нерастворимого препарата фермента, который диспергируют в 8 мл 17%-го (мас.%) водного раствора ПВС. После тщательного перемешивания полученную суспензию помещают в плоскую четырехугольную металлическую форму (поддон) размером 10×4×0,3 см и подвергают криогенной обработке при -30°С в течение 8 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,01°С/мин. Получают композитный криогель ПВС в виде листа, содержащего включенные частицы нерастворимого препарата фермента. Этот лист разрезают на квадраты размером 1×1 см, которые используют в биодатчике для определения L-тирозина. Полученный биокатализатор содержит L-тирозин-декарбоксилазу в количестве 2,2 мас.% (по белку) и ПВС - 16 мас.%. Декарбокислазная активность биокатализатора (измерена в 0,01 мМ растворе НС1, рН 5,5; 37°С) составляет 72% от активности исходной L-тирозин-декарбоксилазы в расчете на 1 мг белка.

Пример 6. Биокатализатор на основе субтилизина

К 50 г 10%-ного (мас.%) водного раствора ПВС прибавляют 5 г сухого препарата сшитых кристаллов субтилизина Карлсберга (коммерческий препарат ChiroCLEC-BL - продукт фирмы Altus Biologics, США; размер частиц 5-10 мкм). Тщательно перемешивают смесь до получения равномерной суспензии, из которой затем известным методом (см. пример 4) сформируют гранулы композитного криогеля ПВС диаметром 1,0-1,2 мм. Замораживание проводят при -18°С в течение 18 ч, гранулы оттаивают со скоростью 0,08°С/мин. В результате получают гранулированный биокатализатор с содержанием фермента (субтилизин Карлсберга) 9,1 мас.% и ПВС - 10 мас.%. Энзиматическая активность полученного биокатализатора в реакции гидролиза п-нитроаналида N-пироглутарил-аланил-аланил-лейцина (0,05М Трис/НСl буфер, содержащий 1,5 мМ CaCl₂, pH 8,3; 20°С) составляет 92% от активности исходного препарата ChiroCLEC-BL в расчете на 1 мг белка.

Пример 7. Биокатализатор на основе щелочных микробных протеаз

100 мл жидкого ферментного препарата на основе щелочных микробных протеаз из Bacillus licheniformis (фирменное название Deterzyme L-600; ENDE Industrial Inc., США) помещают в мешок из целлофана и диализуют при комнатной температуре против деионизованной воды до отсутствия сульфата аммония в диализате. В результате белковые компоненты, содержащие целевую энзиматическую активность, выпадают в осадок (коагулят), который отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Получают 12 г влажного уплотненного коагулята, который диспергируют в 50 мл 0,01 М растворе NaHCO₃, а затем прибавляют 2 мл 0,2% водного раствора янтарного альдегида и перемешивают 18 ч при 20°С. Нерастворимый продукт отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин, промывают 100 мл дистиллированной воды и вновь отделяют центрифугированием в тех же режимах. Полученный нерастворимый препарат фермента диспергируют в 12%-ном (мас.%) водном растворе ПВС при соотношении указанных компонентов 1:3 по массе. Полученную суспензию разливают в дисковые формы диаметром 15 мм и высотой 2 мм, а затем подвергают криогенной обработке при -20°С в течение 36 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,06°С/мин. В результате получают биокатализатор в виде дисков с содержанием фермента 20 мас.% и ПВС - 8 мас.%. Казеинолитическая активность полученного биокатализатора (измерена в 0,1 М Na-карбонатном буфере, рН 10,3; 50°С) составляет 74% от активности исходного препарата Deterzyme L-600 в расчете на 1 мг белка.

Пример 8. Биокатализатор на основе лизоцима

Готовят 100 мл 2%-ного раствора лизоцима куриных яиц (Merck, Германия) в 0,2 М Na-бикарбонатном буфере (рН 8,7). куда при постоянном перемешивании небольшими порциями прибавляют 40%-ный водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 1200 до образования мелкодисперсного коагулята белка. Далее дисперсию охлаждают на ледяной бане, вносят 0,1 г трихлортриазина и перемешивают на холоде 20 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин и трижды промывают водой центрифугированием при тех же режимах. Получают 5,1 г влажного сшитого белкового коагулята с содержанием белка 0,37 г на 1 г препарата. Этот нерастворимый препарат фермента диспергируют в 6 мл 20%-ного раствора ПВС. Полученную суспензию помещают в дисковые формы и подвергают криогенной обработке при -8°С в течение 15 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,005°С/мин. В результате получают биокатализатор в виде дисков с содержанием фермента 17,2 мас.% и ПВС - 10,9 мас.%. Энзиматическая активность биокатализатора при расщеплении п-нитрофенильного производного β-D-N,N’,N’’-триацетил-хитотриозы (измерена в 0,1 М трис-глициновом буфере, рН 6,5 при 25°С) составляет 59% от активности исходного препарата лизоцима в расчете на 1 мг белка.

Пример 9. Биокатализатор на основе панкреатической липазы

К 45 г 3-аминопропилированного силикагеля (Silasorb A, Chemapol, Чехия; размер частиц 5 мкм) прибавляют 80 мл 2,5%-ного водного раствора терефталевого альдегида и энергично перемешивают на лабораторной качалке в течение 2 ч при комнатной температуре. Модифицированный таким образом силикагель, содержащий привитые альдегидные группы, отфильтровывают, промывают на фильтре водой до отсутствия альдегида в промывках и диспергируют в 60 мл 0,5%-ного раствора панкреатической липазы (Fluka, Швейцария) в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Суспензию перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре, затем отфильтровывают твердую фазу, промывают ее последовательно тем же буфером (3×50 мл) и дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок в промывках. Получают нерастворимый препарат липазы, присоединенной ковалентно к силикагелю. Содержание фермента в этом препарате составляет по данным аминокислотного анализа 20,9 мг белка на 1 г сухого препарата. К 80 мл 9,5%-ного (мас.%) водного раствора ПВС прибавляют 40 г полученного нерастворимого ферментного препарата и перемешивают систему до получения равномерной суспензии, из которой затем известным методом (см. пример 4) формируют гранулы композитного криогеля ПВС диаметром 0,7-0,9 мм. Замораживание проводят в течение 20 ч при -22°С с последующим оттаиванием гранул со скоростью 0,15°С/мин. В результате получают биокатализатор в гранулированном виде с содержанием фермента 1 мас.% и ПВС - 9,3 мас.% (без учета массы силикагеля). Энзиматическая активность полученного биокатализатора в отношении гидролиза п-нитрофенилпропионата (измерена в 0,2 М Na-фосфатном буфере (рН 7,9) при 37°С) в расчете на 1 мг белка составляет 98% от активности нерастворимого препарата липазы после ее присоединения к силикагелю.

Пример 10. Биокатализатор на основе алкогольдегидрогеназы

Порошок микрокристаллической целлюлозы (размер частиц 10-20×0,3-0,5 мкм), содержащей привитые фенилглицидильные группировки (~40 мкмоль/г), в количестве 1 г диспергируют в 5 мл 0,2%-ного раствора дрожжевой алкогольдегидрогеназы (Worthington Biochemical Corp., США) в 0,05 М Na-пирофосфатном буфере (рН 8,8) и перешивают в центрифужной пробирке при комнатной температуре 8 ч (при этом происходит адсорбция фермента на производном целлюлозы). Фазы разделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, супернатант сливают, а осадок при охлаждении в ледяной бане суспендируют в 5 мл 0,1%-ного раствора глиоксаля в таком же буфере и перемешивают на холоде 30 мин, что приводит к сшиванию адсорбированного фермента. Фазы разделяют фильтрованием, осадок промывают буфером до отсутствия глиоксаля в промывках. Получают нерастворимый препарат фермента с содержанием белка 35 мг на 1 г сухой целлюлозы. К 0,5 г (в расчете на сухой вес) этого препарата прибавляют 1 г 14%-ного (мас.%) раствора ПВС, тщательно перешивают ишредиенты, помещают полученную суспензию в лоток с полуцилиндрическими желобками (диаметр 6 мм) и затем подвергают криогенной обработке при -5°С в течение 12 ч с последующим размораживанием со скоростью 0,001°С/мин. В результате получают биокатализатор в виде полуцилиндров с содержанием фермента 1,7 мас.% и ПВС - 13,7 мас.% (без учета массы целлюлозы). Энзиматическая активность полученного биокатализатора в отношении окисления этанола (измерена при 25°С с помощью стандартного набора реагентов фирмы Worthington Biochemical Corp., США; содержит раствор этанола, НАД и желатина в 0,05 М Na-пирофосфатном буфере (рН 8,8)) в расчете на 1 мг белка составляет 83% от активности исходной алкогольдегидрогеназы.

Оказалось, что такой ранее неизвестный состав и неизвестное сочетание технологических операций, т.е. приготовление нерастворимого препарата фермента с последующим его включением в матрицу криогеля ПВС, приводит к получению биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. Заявляемое изобретение позволяет получать биокатализаторы, содержащие значительно большее по сравнению с аналогами и прототипом (до 680 раз) количества иммобилизованного фермента или ферментов, эффективных при работе как с низкомолекулярными (примеры №2-6, 8-10), так высокомолекулярными (примеры №1, 7) субстратами.

2. Включение фермента или ферментов в матрицу криогеля в виде нерастворимого препарата, находящегося в одном из перечисленных физических состояний: сшитый гель, сшитый коагулят, сшитые белковые кристаллы, частицы правильной или неправильной формы, состоящие из энзиматически неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно, существенно повышает универсальность заявляемого технического решения по сравнению с аналогами и прототипом, каждый из которых предусматривает только одно из физических состояний иммобилизуемого фермента.

3. Заявляемое техническое решение обладает широкой универсальностью также в отношении классов иммобилизуемых ферментов, в частности, примеры иллюстрируют приготовление биокатализаторов на основе совершенно разнородных по природе и типу энзиматической активности ферментов: гликозидаз (примеры №1, 2, 8), протеаз (примеры №3, 4, 6, 7), липазы (пример №9), лиазы (пример №5), оксидоредуктазы (пример №10).

4. Кроме того, заявляемое техническое решение обладает универсальностью в отношении того, в каком виде нерастворимый препарат фермента или ферментов включается в матрицу гелевого носителя: как индивидуальный фермент (примеры №3-6, 8-10) или их смесь (примеры №1, 2, 7), что позволяет получать широкий набор биокатализаторов.

5. Биокатализатор обладает не только необходимой энзиматической активностью, но при этом обеспечивается и надежное удерживание фермента или ферментов в пределах частиц носителя.

6. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала - криогеля ПВС, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет применять соответствующие биокатализаторы не только в колоночных реакторах со стационарным слоем насадки, но и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно ускоряет скорость массообменных биокаталитических процессов.

5. Благодаря более высокой, по сравнению с прототипом, термостабильности матрицы носителя, т.е. криогеля ПВС в противовес пленочному гелю ПВС, появляется возможность получать заявляемым методом биокатализаторы не только на основе “обычных” ферментов, функционирующих при физиологических температурах (примеры №3-6, 8-10), но и на основе термостабильных ферментов, работающих при повышенных температурах (примеры №1, 2, 7).

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе ферментов, включенных в матрицу гелевого носителя, которые способны осуществлять энзиматическую трансформацию соответствующих субстратов в периодических или непрерывных режимах. Заявленный биокатализатор является нерастворимым препаратом фермента или ферментов, включенным в матрицу полимерного геля на основе поливинилового спирта, при этом нерастворимый препарат фермента или ферментов представляет собой или сшитый гель, или сшитый коагулят, или сшитые белковые кристаллы, или частицы, состоящие из ферментативно-неактивного материала, к которым фермент(ы) пришит(ы) ковалентно, а матрица полимерного геля представляет собой криогель поливинилового спирта, соотношение исходных компонентов составляет, мас.%: нерастворимый препарат фермента - 1-20; поливиниловый спирт - 8-16; вода - до 100. Способ получения заявляемого биокатализатора заключается в диспергировании нерастворимого препарата фермента в водном растворе поливинилового спирта с последующим замораживанием полученной дисперсии при -5...-40°С в течение 4-48 ч и дальнейшим размораживанием со скоростью 0,001-0,2°С/мин. Изобретение позволяет получать активные, стабильные и механически прочные биокатализаторы, содержащие значительно большее по сравнению с аналогами и прототипом (до 680 раз) количества иммобилизованного фермента, эффективные при работе как с низкомолекулярными, так и высокомолекулярными субстратами. Изобретение обладает широкой универсальностью и позволяет применять биокатализаторы в различных реакторах. 2 н.з.ф-лы.

1. Биокатализатор на основе иммобилизованного фермента или ферментов, нерастворимый препарат которого или которых включен в матрицу полимерного геля на основе поливинилового спирта, отличающийся тем, что нерастворимый препарат фермента или ферментов представляет собой или сшитый гель, или сшитый коагулят, или сшитые белковые кристаллы, или частицы, состоящие из ферментативно-неактивного материала, к которым фермент или ферменты пришиты ковалентно, а матрица полимерного геля представляет собой криогель поливинилового спирта, причем соотношение исходных компонентов составляет, мас.%:

Нерастворимый препарат фермента 1-20

Поливиниловый спирт 8-16

Вода До 100

Нерастворимый препарат фермента 1-20

Поливиниловый спирт 8-16

Вода До 100

в водном растворе поливинилового спирта с последующим замораживанием полученной дисперсии при (-5)-(-40)°С в течение 4-48 ч и дальнейшим размораживанием со скоростью 0,001-0,2°С/мин.