СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы (популяции) относится к области гематологии и может быть применен в клинической лабораторной диагностике при экспресс-диагностике и определении интенсивности протекания патологических и физиологических регенераторных процессов в системе эритрона.

В современной гематологии для описания формы эритроцита млекопитающих животных используют математическую модель цилиндрического тела, в основе которой положены промеры диаметров клеток. Толщина, объем и площадь поверхности клеток вычисляются в соответствии с применяемой математической моделью.

Известен способ определения формы и размеров эритроцитов, принятый за прототип, основанный на прямом измерении среднего диаметра эритроцитов при помощи окулярного микрометра на сухих окрашенных по Крюкову-Паппенгейму мазках крови.

В каждом случае измерения диаметров промеряют не меньше 200 эритроцитов с вычислением среднего арифметического значения. В условиях нормоцитоза измеряют один из диаметров, в условиях мегалоцитоза или эллиптоцитоза измеряют продольный и поперечный диаметры. Определение объема эритроцита производят путем центрифугирования капли крови в капиллярах при скорости 16000 об/мин в течение 1 минуты, измеряют гематокрит (Ht), а в камере Горяева подсчитывают количество эритроцитов. Затем вычисляют средний объем эритроцита по Велькеру [1], основанный на отношении объемной массы эритроцитов в единице объема крови (Ht) к количеству эритроцитов в этом же объеме (RBC), то есть . Существует мнение, согласно которому объем эритроцитов, определенный при помощи гематокрита, завышается за счет не учитываемого межклеточного пространства [2].

Средний объем эритроцитов, определенный по вышеуказанным методикам, далее используется для вычислений индексов эритроцитов (толщина, сферичность, площадь поверхности). Вычисление средней толщины эритроцитов производят по формуле Бороса, принявшего для этого эритроцит за цилиндрическое тело: , где Т - толщина, V - средний объем эритроцита, R - средний радиус. Сферический индекс рассчитывают из соотношения толщины (Т) к диаметру . При расчете средней площади поверхности эритроцита чаще всего используют формулу А. Хуртадо , где V - объем; Т - толщина; R - средний радиус эритроцита.

Однако известно, что развитие различных патологических процессов у млекопитающих, как правило, приводит к существенной деформации формы эритроцитов в периферической крови, а у птиц и в физиологических условиях форма эритроцитов имеет более сложную, чем цилиндр конфигурацию и больше приближается к форме эллипсоида.

Вышеописанный способ не учитывает этих особенностей трансформации формы эритроцитов, связанной с видом и динамикой развития различных патологических процессов.

Кроме того, недостатком описанного способа является то, что количественная оценка качественной разнородности эритроцитарной популяции основывается только на промерах диаметров, при этом другие индексы эритроцитов, рассчитанные на основе экспериментально определенного объема клеток, выражаются средними значениями, что приводит к снижению достоверности полученных результатов и невозможности выделения субпопуляций эритроцитарной системы (микро-, нормо-, макроцитов).

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств определения морфометрических индексов путем создания способа идентификации субпопуляций эритроцитарной системы, основанного на том, что форма клеток ближе к эллипсу, чем к цилиндру, следовательно, для идентификации субпопуляций эритроцитов по морфометрическим индексам лучше использовать математическую модель эллипсоида вращения.

Для достижения названного технического результата в способе, включающем прямые измерения диаметра эритроцитов и подсчет среднего арифметического значения по 200 замерам, определяют объем эритроцитов путем измерения гематокрита и подсчета количества эритроцитов:

- вместо определения среднего арифметического значения диаметров для каждого эритроцита находят направление, совпадающее с его максимальным габаритным размером А (А - продольная ось) и поперечным габаритным размером В (В - поперечная ось эритроцита, совпадающая с направлением, перпендикулярным продольной оси) и осуществляют измерение этих габаритных размеров;

- для каждого эритроцита рассчитывают: коэффициент числовой эксцентричности формы , объем , толщину , площадь поверхности эритроцита , причем V_ij, S_ij, T_i определяют для тех эритроцитов, для которых ε_{пороговая}>0,

- идентификацию субпопуляций эритроцитарной системы осуществляют по попаданию значений рассчитанных индексов в непересекающиеся трехмерные области значений, определенных для каждой субпопуляции:

(микроциты);

(нормоциты);

(макроциты),

где А, В, С - области значений индексов для микро-, нормо- и макроцитов соответственно; - длинная полуось эллипса; b_i - короткая полуось эллипса, - средние значения объема, площади поверхности и толщины для микро-, нормо- и макроцитов соответственно, определенные в физиологических условиях, Δμ^м, Δμ^н, Δμ^М - параметры, определяющие границы непересекающихся областей в виде максимального и минимального отклонений, для каждой субпопуляции, от величины среднего значения морфометрических индексов, определенных в физиологических условиях;

- количество измерений выбирают исходя из заданной вероятности правильной идентификации субпопуляций эритроцитарной системы.

Предлагаемый способ позволяет получить более точные данные о размерах и форме каждой субпопуляции эритроцитов за счет исключения различных методологических подходов при определении морфометрических параметров клеток, сократить время исследования, исключив экспериментальное определение гематокрита и количественный подсчет эритроцитов в камере Горяева.

Предлагаемый способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы поясняется чертежом.

Отличительными признаками заявленного способа являются:

- применение для описания морфометрических параметров эритроцитов математической модели эллипсоида вращения;

- промеры максимальных продольного и поперечного габаритных размеров А (продольная ось) и В (поперечная ось) для каждой клетки;

- определение вместо сферичности коэффициента эксцентричности по формуле позволяющего получить более точную количественную характеристику качественной оценки формы клеток, т.к. в любом случае форма клетки ближе к эллипсу, чем к цилиндру. Числовое значение коэффициента эксцентричности позволяет идентифицировать в крови любую форму клетки - от сферы до эллипса: например при патологии клеток в случае микросфероцитоза ε=0, в случае эллиптоцитоза ε=0,47-0,74;

- расчет морфометрических индексов по следующим формулам: объем , толщина , площадь поверхности эритроцита

- идентификацию субпопуляций эритроцитарной системы осуществляют по попаданию значений рассчитанных индексов в непересекающиеся трехмерные области значений, определенных для каждой субпопуляции.

Использование предлагаемого способа способствует получению данных, не противоречащих друг другу, позволяющих при вычислении толщины, объема, площади поверхности субпопуляций эритроцитов учитывать особенности их формы.

Предлагаемый способ включает приготовление мазка крови, окрашивание его по Лейшману, измерение максимальных продольного и поперечного габаритных размеров А и В эритроцитов на анализаторе изображений “ВидеоТесТ”. Поскольку показатель сферичности не дает истинного представления о форме клетки, особенно патологически измененной, предлагается оценку формы клеток проводить на основании определения коэффициента конфигурации или числовой эксцентричности объем вычисляют по формуле , площадь поверхности вычисляют по формуле ; толщину вычисляют по формуле , где - продольная полуось эллипса, b_i - поперечная полуось эллипса, а идентификацию субпопуляций эритроцитарной системы осуществляют по попаданию значений рассчитанных индексов в непересекающиеся трехмерные области значений, определенных для каждой субпопуляции.

Пример способа идентификации субпопуляций эритроцитарной популяции у птиц.

Готовят мазки крови птицы, взятые в физиологических условиях и после воздействия экстремальных факторов, окрашивают их по Лейшману, промеряют продольные и поперечные оси каждого эритроцита, рассчитывают морфометрические индексы по следующим формулам: коэффициент конфигурации (числовой эксцентричности) , объем , площадь поверхности , толщину , где - продольная полуось эллипса, b_i - поперечная полуось эллипса. Идентификацию субпопуляций осуществляют следующим образом:

а) определяют средние значения морфометрических индексов в физиологических условиях для каждой субпопуляции. Например, у одной из исследуемых птиц:

(микроциты);

(нормоциты);

(макроциты);

б) для птиц определены следующие минимальные и максимальные значения морфометрических индексов в физиологических условиях:

микроциты

нормоциты

макроциты

Для наглядности приведено изображение трехмерной модели областей значений индексов (V, S, T) для каждой субпопуляции, где А, В, С - области значений индексов для микро-, нормо- и макроцитов соответственно (фиг.1);

в) задают величины отклонений Δμ^м, Δμ^н, Δμ^М исходя из заданной вероятности правильной идентификации, например для объема и площади поверхности Δμ^м=±2, Δμ^н=±3, Δμ^М=±3,1, для толщины Δμ^м=±0,01, Δμ^н=±0,008, Δμ^М=±0,008.

Полученную модель можно использовать для идентификации субпопуляций эритроцитарной системы при исследовании крови птиц в клинической диагностике. Принадлежность клетки к определенной субпопуляции устанавливают при попадании каждого индекса в непересекающуюся (не заштрихованную) область трехмерной модели, а если хотя бы один из индексов попадает в пересекающуюся (заштрихованную) область трехмерной модели, то такая клетка не может быть отнесена к соответствующей субпопуляции.

Предлагаемый способ позволяет оперативно выявлять качественные изменения эритроцитарных субпопуляций, происходящие при физиологической и репаративной (патологической) регенерации системы красной крови, что дает возможность прогнозировать развитие адаптационных процессов в организме.

Литература

1. Коржуев П.А. Гемоглобин. - М.: Наука, 1964. – 286 с.

2. Чижевский А.Л. Биофизические механизмы РОЭ. - Новосибирск: Наука, сибирское отделение, 1980. - 175 с.

Изобретение относится к области гематологии - клинической лабораторной диагностике. Способ включает приготовление мазка крови, окрашивание его по Лейшману, измерение максимальных продольных и поперечных габаритных размеров А и В, для каждого эритроцита определяют: коэффициент числовой эксцентричности формы , объем , толщину , площадь поверхности эритроцита , причем V_ij, S_ij, Т_i определяют для тех эритроцитов, для которых ε_{пороговая}>0, а идентификацию субпопуляций эритроцитарной системы осуществляют по попаданию значений рассчитанных индексов в непересекающиеся трехмерные области значений, определенных для каждой субпопуляции: где А, В, С - области значений индексов для микро-, нормо- и макроцитов соответственно, а_j - длинная полуось эллипса, b_i - короткая полуось эллипса, - средние значения объема, площади поверхности и толщины для микро-, нормо- и макроцитов соответственно, определенные в физиологических условиях, Δμ^м, Δμ^н, Δμ^М - параметры, определяющие границы непересекающихся областей, а количество измерений выбирают исходя из заданной вероятности правильной идентификации субпопуляций эритроцитарной системы. Это позволяет за счет выявления качественных изменений эритроцитарных субпопуляций более точно прогнозировать развитие адаптационных процессов в организме. 1 ил.

Способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы, включающий приготовление мазков, их окраску, промеры клеток и расчет основных индексов эритроцитов, отличающийся тем, что для каждого эритроцита находят направление, совпадающее с его максимальным габаритным размером А, где А - продольная ось, и поперечным габаритным размером В, где В - поперечная ось эритроцита, совпадающая с направлением, перпендикулярным продольной оси, и осуществляют измерение этих габаритных размеров, для каждого эритроцита определяют коэффициент числовой эксцентричности формы

морфометрические индексы: объем

толщину

площадь поверхности эритроцита

причем V_ij, S_ij, Т_i определяют для тех эритроцитов, для которых ε_{пороговая}>0, а идентификацию субпопуляций эритроцитарной системы осуществляют по попаданию значений рассчитанных индексов в непересекающиеся трехмерные области значений, определенных для каждой субпопуляции:

где А, В, С - области значений индексов для микро-, нормо- и макроцитов соответственно;

- длинная полуось эллипса;

b_i - короткая полуось эллипса;

- средние значения объема, площади поверхности и толщины для микро-, нормо- и макроцитов соответственно, определенные в физиологических условиях;

Δμ^м, Δμ^н, Δμ^М - параметры, определяющие границы непересекающихся областей,

а количество измерений выбирают, исходя из заданной вероятности правильной идентификации субпопуляций эритроцитарной системы.