Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, в частности к получению проинсулина Lyspro человека, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета.
Строгий контроль уровня глюкозы в плазме больных диабетом необходим для предотвращения тяжелых осложнений этого заболевания. У здоровых людей уровень инсулина в плазме после приема пищи достигает максимума после 30-40 мин и медленно снижается в течение последующих 2-3 ч. Начало действия препаратов обычного инсулина после подкожной инъекции наступает медленно и продолжительность его действия значительно выше соответствующих параметров, характерных для инсулина, образующегося в организме здоровых людей после приема пищи, богатой углеводами [Heinemann L., Starke A.A.R., Hohmann A., Berger M. // Horm. Metab. Res., 1992, v.26 (Suppl), p.137-139]. При использовании препаратов обычного инсулина возникает опасность возникновения ранней послеобеденной гипергликемии, сопровождаемой гипогликемией перед следующим приемом пищи. В этой связи имеется необходимость в создании препаратов инсулина, для которых были бы характерны более быстрые начало и прекращение действия после введения в организм больного.
Аналог инсулина Lyspro, у которого в положениях 28 и 29 полипептидной цепи находятся остатки Lys и Pro вместо Pro и Lys соответственно (фиг.1), является первым быстродействующим аналогом инсулина, внедренным в мировую клиническую практику в 1996 году. В отличие от природного для инсулина Lyspro характерны пониженная способность к образованию агрегатов и, как следствие, быстрая абсорбция, более высокий уровень содержания в плазме, а также меньшая продолжительность времени действия [Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. // Diabetes, 1994, v.43, p.396-402]. Такие замены аминокислотных остатков не затрагивают домен молекулы инсулина, связывающий рецептор, и, как следствие, кинетические параметры взаимодействия аналога инсулина Lyspro с рецепторами соответствуют таковым природного инсулина. Действие инсулина Lyspro начинается через 15 мин после подкожной инъекции, достигает максимальных значений приблизительно через 1 ч и прекращается спустя 2-4 ч [Torlone Е., Fanelli С., Rambotti A.M., Kassi G., Modarelli F., Di Vincenzo A., Epifano L., Ciofetta M., Pampanelli S., Brunetti P. // Diabetologia, 1994, v.37, p.713-720]. В настоящее время инсулин Lyspro широко используется для лечения инсулинозависимого диабета в мировой клинической практике [Hanaire-Broutin Н., Melki V., Bessieres-Lacombe S., Tauber J.P. // Diabetes Care, 2000, v.23, p.1232-1235; Jehle P.M., Aisenpreis U., Bundschu D., Keller F. // Fortschr. Med., 1999, v.117, p.41-42].
Известен способ получения инсулина Lyspro, в котором последовательность нуклеотидов, кодирующая А-цепь инсулина, была синтезирована химически и клонирована в экспрессирующем плазмидном векторе под контролем промотора гена триптофансинтетазы E.coli (trp LE’) в виде гибридного гена, включающего 5’-концевую часть гена β-галактозидазы и соответствующую инсулиновую последовательность. Рекомбинантную плазмиду вводили с помощью трансформации в бактериальный штамм, где после индукции промотора происходил синтез гибридного белка следующей структуры: β-gal-Met-A-цепь (где β-gal - N-концевая часть β-галактозидазы E.coli, a Met - метиониновый линкер). Наличие линкера позволяло производить расщепление химерного полипептида бромистым цианом в очищенных “тельцах включения”, с последующей хроматографической очисткой А-цепи. В-цепь инсулина, содержащую требуемую последовательность Lys(B28)-Рro(В29), получали твердофазным синтезом. Далее очищенные цепи инсулина объединяли in vitro и осуществляли окисление сульфгидрильных групп, что приводило к образованию дисульфидных связей между цепями. На конечных этапах проводили очистку полученного таким образом инсулина Lyspro [EP №0383472, МКИ С 07 К 7/40, 1990].
Способ имеет ряд недостатков, в частности высокую трудоемкость, низкий выход конечного продукта, что не дает возможность использования их в технологических целях.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм-продуцент, в котором ген проинсулина человека, содержащий на N-конце два избыточных аминокислотных остатка Met-Tyr, клонировали в экспрессирующей векторной плазмиде под контролем промотора pL и температурочувствительного репрессора сI857 фага λ. В качестве селектируемого маркера использовали ген устойчивости к тетрациклину tetR. После термоиндукции рекомбинантного гена повышением температуры до 40°С, образующийся рекомбинантный проинсулин накапливался в клетках E.coli в тельцах включения, из которых проводили его дальнейшую очистку. На первом этапе, используя катепсин С, отделяли избыточный дипептид Met-Tyr, на втором - С-пептид проинсулина отщепляли трипсином и карбоксипептидазой В с последующей очисткой образовавшегося аналога инсулина Lyspro [пат. США No 5514646, МКИ, 1996].
Необходимость использования термоиндукции для достижения регулируемой экспрессии проинсулина Lyspro в бактериальных клетках является существенным недостатком обсуждаемого штамма-прототипа E.coli. Известно, что во время инкубации бактериальных клеток при повышенных температурах происходит индукция синтеза белков теплового шока, которые в том числе участвуют в деградации белков с нарушенной пространственной структурой (претерпевших неправильный посттрансляционный фолдинг или денатурировавших во время теплового шока) [Gottesman S. // Annu. Rev. Gene., 1996, v.30, р.465-506; Baneyx F. // Curr. Opin. Biotechnol, 1999, v.10, p.411-421]. Кроме того, высокая температура, при которой проводили выращивание бактериальных клеток, способствует агрегации рекомбинантных белков в цитоплазме [Clark E., De Bernardez // Curr. Opin. Biotechnol, 1998, v.9, p.157-163]. Все это приводит к образованию фрагментов полипептидной цепи проинсулина, усиливает агрегацию его молекул и уменьшает выход нативного рекомбинантного белка. Действительно, выход рекомбинантного проинсулина Lyspro в обсуждаемом штамме-прототипе составляет ~2% от суммарного клеточного белка.
Задачей изобретения является конструирование плазмиды, детерминирующей синтез гибридного рекомбинантного белка, в котором единственный IgG-связывающий домен белка А соединен через пептидный линкер Hys6AspGlyArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, то есть содержащего в положениях 28 и 29 полипептидной цепи остатки Lys и Pro, и создание высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать инсулин Lyspro с высоким выходом и по упрощенной технологии.
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pPL-3-1, кодирующей гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер His6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащей HindIII/ВаmHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген β-лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую последовательность аминокислот домена В белка A S. aureus, содержащую синонимическую замену С→Т в положении 3 третьего кодона GAC, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His6GlySerArg, и НindIII/ВаmHI-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Lyspro человека, сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI - 1, NcoI - 217, ВаmHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI - 4792, а также штамма Escherichia coli TG-1/pLP-3-1 - продуцента гибридного полипептида с последовательностью проинсулина Lyspro человека.
Исходной плазмидой для конструирования является плазмида pPINS07, кодирующая гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка A Staphylococcus aureus, пептидного линкера His6GlySerArg и проинсулина человека, гибридный tac-промотор и терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli [патент РФ №2144957, МКИ, опубл. 2000]. Как уже упоминалось выше, инсулин Lyspro отличается от обычного инсулина последовательностью аминокислот в положениях 28 и 29 его В-цепи. Для введения соответствующей мутации в ген нормального проинсулина человека используют полимеразную цепную реакцию (ПЦP) с перекрывающимися праймерами. Для этого вначале на матрице исходной плазмиды синтезируют ПЦР-продукты А и В (ПЦР 1, фиг.2) с помощью пар праймеров 1-4 и 2-3. Праймеры 3 и 4 содержат некомплементарные матрице нуклеотиды, соответствующие последовательности Lyspro гена проинсулина человека (обозначены звездочками). Полученные ПЦР-продукты электрофоретически очищают на ДЭАЭ-мембране и используют в качестве матрицы во второй реакции ПЦР (ПЦР 2) в присутствии праймеров 1 и 2. Образовавшийся в итоге ПЦР-продукт С содержит требуемую мутацию, а также уникальные сайты рестрикции ВаmHI и HindIII на своих концах. ПЦР-продукт С инкубируют с рестриктазами ВатHI и HindIII и клонируют в предварительно подготовленном векторе, который представляет собой исходную плазмиду, содержащую рекомбинантный ген гибридного полипептида без последовательности проинсулина человека, удаленной с помощью тех же рестриктаз. Отбор рекомбинантных клонов проводят по элиминации одного из сайтов рестрикции МboII в ПЦР-продукте, полученном в результате амплификации соответствующих участков рекомбинантных плазмид с использованием праймеров 1 и 2. Элиминация сайта рестрикции является следствием изменения с помощью проведенного направленного мутагенеза последовательности нуклеотидов гена проинсулина исходной плазмиды, приводящего к появлению в В-цепи измененной последовательности аминокислотных остатков Lys(B28)-Pro(B29) (фиг.1). Плазмиды отобранных клонов, которые отвечают требуемым свойствам, очищают щелочным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press], и последовательность нуклеотидов клонированного фрагмента ДНК определяют методом Сэнгера с использованием дидезоксирибонуклеотидных производных в качестве терминаторов синтеза ДНК термосеквеназой и флуоресцентной метки, на автоматическом секвенаторе. Полученную последовательность сравнивают с последовательностью исходной плазмиды, определенную тем же методом. Итогом работы является получение рекомбинантной плазмиды pLP-3-1, обладающей требуемыми свойствами. Плазмиду pLP-3-1 вводят с помощью электропорации в компетентные клетки E.coli TG-1, что приводит к созданию рекомбинантного штамма-продуцента гибридного проинсулина Lyspro - E.coli pLP-3-1/TG-1. Исследование уровня экспрессии гибридного проинсулина Lyspro в полученном рекомбинантном штамме показывает, что содержание рекомбинантного полипептида в бактериальных клетках после завершения индукции с помощью ИПТГ составляет не менее 25% от суммарного клеточного белка.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pLP-3-1, кодирующая гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью аналога проинсулина Lyspro человека, характеризуется следующими признаками:
имеет молекулярную массу 3,3 МДа (5051 т.п.о.);
кодирует гибридный белок, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А с С-концевым гексагистидиновым линкером соединена через трипептид GlySerArg с последовательностью проинсулина Lyspro человека;
состоит из НindIII//ВаmHI-фрагмента плазмиды pPINS07, содержащего синтетический tac-промотор транскрипции, ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость клеток бактерий к ампициллину, область инициации репликации плазмидной ДНК (ori)1 терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, a также включающего часть искусственного гена, кодирующую IgG-связывающий домен белка А из S. aureus, содержащую синонимическую замену С→Т в третьем положении третьего кодона GAC 5’-концевой части, улучшающую эффективность трансляции мРНК искусственного гена рибосомами, и гексагистидиновый домен, соединенный с трипептидом GlySerArg, а также ВаmHI//НindIII-фрагмента, кодирующего проинсулин Lyspro человека, содержащий последовательность LysPro в положениях 28-29 последовательности его В-цепи, уникальные сайты рестрикции имеют следующие координаты: EcoRI - 1, NcoI - 217, ВаmHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalI - 4513, ClaI - 4792.
Преимуществом полученной плазмиды pLP-3-1 перед известными плазмидами является то, что она кодирует полипептид проинсулина Lyspro под контролем синтетического tac-промотора, индуцируемого изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ). Это позволяет индуцировать и осуществлять синтез проинсулина при обычной для E.coli температуре 37°С, что значительно повышает выход рекомбинантного белка и облегчает его дальнейшую очистку. Дальнейшее повышение выхода рекомбинантного проинсулина Lyspro достигнуто введением синонимической замены нуклеотида в 5’-концевой части экспрессирующейся кассеты рекомбинантных последовательностей нуклеотидов. Кроме того, в отличие от плазмиды-прототипа сконструированная плазмида содержит ген β-лактамазы в качестве селектируемого маркера.
Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином Lyspro человека рекомбинантную плазмиду pLP-3-1 вводят с помощью электропорации в компетентные клетки E.coli TG-1.
Полученный штамм Escherichia coli/pLP-3-1, названный E.coli LP31, характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1×3,5 мкм, подвижные.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.
Физико-биохимические признаки: клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.
Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколу (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLP-3-1 и эписомной ДНК штамма-хозяина соответственно.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Получение фрагмента ДНК, кодирующего проинсулин Lyspro человека.
100 нг плазмидной ДНК pPINS07, содержащей ген природного проинсулина человека, используют в качестве матрицы для синтеза фрагмента А (фиг.2) в полимеразной цепной реакции (ПЦР), добавляя к 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 20 мМ Трис-НСl, рН 8,8, 67 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, по 0,2 мМ dATP, dCTP, TTP и dGTP каждого, 0,05 ед. Taq-ДНК-полимеразы и по 1 мкМ каждого из праймеров CAGGATCATCACCATGGATCCCG и CACGACGGGTCGGCTTGGTGTAGAAG (праймеры 1 и 4 соответственно на фиг.2, подчеркнута мутантная, мутагенизирующая последовательность). Амплификацию соответствующего участка плазмиды осуществляют, проводя 22 цикла ПЦР (94°С, 20 с; 50°С, 20 с; 72°С, 20 с). Синтез фрагмента В (фиг.2) проводят в тех же условиях и в той же реакционной смеси, но в присутствии праймеров CCGCCAAGCTTACTAGTTGCAGTAG и ACACCAAGCCGACCCGTCGTGAAGC (праймеры 2 и 3, фиг.2). Синтезированные фрагменты А и В электрофоретически в 3% агарозном геле переносят на кусочки ДЭАЭ-мембраны NA-45 (Schleicher&Schuhle) и элюируют в центрифужных микропробирках на 1,5 мл 200 мкл буфера, содержащего 1,5 М NaCl, 10 мМ ЭДТА в течение 40 мин при 65°С. К буферу добавляют тРНК Е.соli до конечной концентрации 100 мкг/мл и синтезированные фрагменты осаждают 2,5 объемами 96% этилового спирта. Осадок собирают центрифугированием на микроцентрифуге “Эппендорф” при максимальных оборотах в течение 15 мин, супернатант отбрасывают, осадки промывают 1 мл холодного 70% этилового спирта, подсушивают при комнатной температуре и растворяют в 50 мкл деионизованной воды. Сборку полного фрагмента С (фиг.2) осуществляют с помощью ПЦР в 25 мкл вышеописанной реакционной смеси, однако в отличие от нее содержащей по 1 мкл очищенных перекрывающихся фрагментов А и В в качестве матрицы, а также праймеры CAGGATCATCACCATGGATCCCG и CCGCCAAGCTTACTAGTTGCAGTAG (праймеры 1 и 2 на фиг.2). Для получения липких концов синтезированный фрагмент С инкубируют с эндонуклеазами рестрикции HindIII и BamHI (Fermentas, Латвия). По окончании инкубации фрагмент С, содержащий липкие концы, осаждают 96% этиловым спиртом, как описано выше, но не добавляя тРНК, промывают 70% спиртом, подсушивают и растворяют в 20 мкл воды.
Пример 2. Подготовка экспрессирующего вектора для клонирования синтезированного фрагмента С.
3 мкг плазмиды pPINS07 инкубируют с эндонуклеазами рестрикции HindIII и ВаmНI, как описано выше, и фрагмент векторной ДHК, далее использованный для конструирования экспрессирующей плазмиды, очищают электрофоретически с использованием легкоплавкой агарозы. Для этого фрагменты, образовавшиеся после рестрикции, разделяют электрофорезом в 1,5% агарозе, требуемый фрагмент с помощью электрофореза переносят в лунку, заполненную легкоплавкой агарозой, и выделяют из агарозы фенольным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Фрагмент осаждают и промывают спиртом, как описано выше, в присутствии тРНК в качестве носителя и растворяют в 20 мкл деионизованной воды.
Пример 3. Получение плазмиды pLP-3-1, экспрессирующей ген гибридного проинсулина Lyspro человека и штамма-продуцента гибридного проинсулина Lyspro.
10 мкг большого фрагмента плазмиды pPINS07, содержащего липкие концы HindIII/ВаmHI, лигируют с 50 мкг очищенного фрагмента С с теми же липкими концами [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Продукты реакции осаждают и промывают этиловым спиртом, как описано выше, и растворяют в 10 мкл воды; 5 мкл продуктов лигирования используют для трансформации компетентных клеток E.coli TG-1 методом электропорации в стандартных условиях. Суспензию трансформированных клеток (200 мкл) высевают на LB-агар, содержащий ампициллин (100 мкг/мл) в качестве селектирующего агента. Среди выросших колоний бактерий с помощью ПЦР в присутствии праймеров 1 и 2 (фиг.2) отбирают клоны, содержащие вставку клонируемого фрагмента С. Для этого образовавшиеся продукты ПЦР инкубируют с эндонуклеазой рестрикции МboII (Fermentas, Латвия) и образовавшиеся фрагменты ДНК анализируют электрофорезом в 5% агарозе. При наличии в анализируемой плазмидной ДНК мутации Lyspro в результате рестрикции образуется только три фрагмента ДНК, так как один из трех сайтов рестрикции (центральный, фиг.2) содержащихся в этой части исходной плазмиды pPINS07, элиминируется под действием введенной мутации. Из клонов, содержащих требуемую мутацию, выделяют плазмидную ДНК стандартным фенольным методом [Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press] и последовательность нуклеотидов гена проинсулина Lyspro определяют по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе (Amersham&Pharmacia) с использованием флуоресцентно меченых праймеров. На заключительном этапе работы среди клонов, содержащих ген проинсулина Lyspro, отбирают спонтанно возникший мутантный клон E.coli pLP31, плазмидная ДНК которого содержит синонимическую замену С→Т в положении 3 третьего кодона GAC 5’-концевой последовательности искусственного гена, кодирующей IgG-связывающий домен белка A S. aureus, которая, не изменяя последовательности аминокислот гибридного полипептида, приводит к повышению уровня его экспрессии в бактериальных клетках, возможно за счет увеличения стабильности его мРНК.
Пример 4. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином Lyspro человека.
В 20 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, вносят индивидуальную колонию клеток E.coli pLP-3-1/TG-1, содержащих плазмиду pLP-3-1, и выращивают при 37°С на качалке при 180 об/мин в течение 4 ч до мутности 0,8. Затем добавляют индуктор ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 6 ч. Отбирают пробу 2 мл и центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин, после чего клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол и 0,01% бромфенолового синего, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отбирают образцы объемом 2,5, 5, 7,5, 10 и 15 мкл и анализируют электрофорезом в 13%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфат натрия. Гель окрашивают Кумасси R-250 и сканируют на лазерном денситометре Ultrascan XL. По данным сканирования гибридный полипептид составляет не менее 25-30% суммарного клеточного белка.
Изобретение относится к генной инженерии, в частности к получению проинсулина Lyspro человека, и может быть использовано для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инсулинозависимого сахарного диабета. Конструируют плазмиду pPL-3-1, кодирующую гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, в котором последовательность домена В стафилококкового белка А соединена через пептидный линкер HiS6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина Lyspro человека, с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), содержащей HindIII/BamHI-фрагмент плазмиды pPINS07, включающий гибридный tac-промотор, ген β-лактамазы (bla), область начала репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомного оперона E.coli, последовательность нуклеотидов, кодирующую последовательность аминокислот домена В белка A S. aureus, содержащую синонимическую замену С→Т в положении 3 третьего кодона GAC, соединенную с последовательностью нуклеотидов, кодирующей пептид His6GlySerArg, и HindIII/BamHI/-фрагмент (271 п.о.), кодирующий проинсулин Lyspro человека, сайты рестрикции со следующими координатами: EcoRI - 1, NcoI/ - 217, BamHI - 221, PstI - 342 и 417, HindIII - 492, SalGI - 4513, ClaI – 4792. Бактерии Escherichia coli трансформируют плазмидой pPL-3-1 и получают штамм Escherichia coli TG-1/pLP-3-1 - продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина Lyspro человека. Изобретение позволяет получить проинсулин Lyspro человека с высоким выходом и по упрощенной технологии. 2 н.п. ф-лы, 3 ил.
| US 5514646, 07.05.1996.EP 0383472, 22.08.1990.RU 2144957 C1, 27.01.2000.RU 2143493 C1, 27.12.1999. |
