ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BLP21 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА LYSPRO ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК C12N15/17 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения высокоочищенного генно-инженерного инсулина Lyspro, применяемого при изготовлении лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета.

Инсулин Lyspro - быстродействующий аналог инсулина человека, у которого в аминокислотной последовательности В-цепи инвертированы остатки РrоВ28 и LysB29 (см.чертеж) [Hanaire-Broutin H., Melki V., Bessieres-Lacombe S., Tauber J.P. // Diabetes Care, 2000, v.23, p.1232-1235]. Конформационные изменения в С-концевой последовательности В-цепи гормона, ставшие результатом этой модификации, заметно снизили димеризацию молекул белка, характерную для инсулина человека [Wood A.J.J. // N. Engl. J. Med., 1997, v.337, p.176-183]. Поскольку произведенные замены не затронули участок, ответственный за рецепторное взаимодействие, сродство инсулина Lyspro к инсулиновому рецептору осталось таким же, как у инсулина человека. Сродство инсулина Lyspro к рецептору IGF-1 увеличилось незначительно, поэтому уровни стимуляции клеточного роста аналогом инсулина и инсулином человека имеют сравнимые значения [Slieker L.J., Sundell К. // Diabetes, 1991, v.40, suppl.1, р.168А]. Уменьшение склонности белка к образованию агрегатов увеличило скорость абсорбции инсулина Lyspro после инъекции, обеспечило более высокий уровень содержания препарата в плазме и снизило продолжительность его действия [Howey D.C., Bowsher R.R., Brunelle R.L., Woodworth J.R. // Diabetes, 1994, v.43, p.396-402]. В результате, действие инсулина Lyspro начинается через 15 мин после подкожной инъекции, достигает максимальных значений приблизительно через 1 ч и прекращается спустя 2-4 ч [Torlone E., Fanelli С., Rambotti A.M., Kassi G., Modarelli F., Di Vincenzo A., Epifano L., Ciofetta M., Pampanelli S., Brunetti P. // Diabetologia, 1994, v.37, p.713-720].

Известен штамм Escherichia coli K12 RV308/pRB172 - продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro человека, в котором ген этого аналога проинсулина, кодирующий полипептид с двумя избыточными N-концевыми аминокислотными остатками Met-Tyr, находится в экспрессирующей векторной плазмиде под контролем промотора pL и температурочувствительного репрессора с1857 фага λ. После термоиндукции рекомбинантного гена повышением температуры до 40°С, образующийся рекомбинантный инсулин накапливается в клетках Е.coli в тельцах включения, из которых проводят его дальнейшую очистку [пат. США №5514646, опубл. 1996]. Необходимость использования термоиндукции для достижения регулируемой экспрессии проинсулина Lyspro человека в бактериальных клетках является существенным недостатком обсуждаемого штамма-прототипа Е.coli. Кроме того, известно, что во время инкубации бактериальных клеток при повышенной температуре происходит индукция синтеза белков теплового шока, которые участвуют, в частности, в деградации белков с нарушенной пространственной структурой, а именно это характерно для полипептидов рекомбинантного проинсулина, находящихся в составе телец включения [Gottesman S. // Annu. Rev. Genet., 1996, v.30, p.411-421]. В данном случае рекомбинантная плазмида находится в клетках бактериального штамма Е.coli К12 дикого типа, недостатками которого является наличие в нем функциональной системы RecA-зависимой рекомбинации, что отрицательно сказывается на стабильности рекомбинантной плазмиды. В дополнение к этому такие бактериальные клетки содержат полный набор цитоплазматических и мембранных протеолитических ферментов, которые участвуют в деградации белкового продукта экспрессии гена проинсулина Lyspro, что уменьшает выход рекомбинантного аналога инсулина и затрудняет его очистку.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм-продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro человека Е.coli pLP-3-1/TG-1, в котором рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный полипептид с последовательностью проинсулина Lyspro человека, соединенный через пептидный линкер с аминокислотной последовательностью домена В стафилококкового белка А, введена в клетки Е.coli TG-1 дикого типа. Индукция экспрессии рекомбинантного гена в этом штамме осуществляется с использованием изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) при нормальной температуре [пат. РФ №2235776, МКИ C12N 15/17, опубл 2003]. Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза рекомбинантного белка, и он лишен недостатков штамма с термоиндуцибельным рекомбинантным геном. Однако очистка гибридного белка, получаемого из клеток этого штамма в виде телец включения, и конечного продукта, инсулина Lyspro, также затруднена из-за присутствия продуктов протеолиза, что значительно уменьшает выход инсулина Lyspro и повышает его себестоимость.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента высокопродуктивных штаммов-продуцентов, позволяющих получать быстродействующий инсулин Lyspro с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается путем создания штамма бактерий Е.coli BLP21 - продуцента рекомбинантного проинсулина Lyspro, содержащего плазмидную ДНК pLP-3-1.

Штамм получают трансформацией плазмидной ДНК pLP-3-1 клеток Е.coli BL21. Трансформантов отбирают на селективной агаризованной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, по резистентности к антибиотику, т.е. способности к росту в его присутствии. Плазмида pLP-3-1 является рекомбинантной, содержит искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus, пептидного линкера His₆GlySerArg и проинсулина Lyspro человека, гибридный tac-промотор и терминатор рибосомного оперона E.coli, a также ген bla, кодирующий β-лактамазу, которая придает клеткам устойчивость к ампициллину. Содержание рекомбинантного проинсулина Lyspro человека в предлагаемом штамме составляет не менее 25% суммарного клеточного белка.

Штамм Е.coli BLP21 имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Генетические признаки.

F^- ompT hsdS_B(r_B ^- m_B ^-) gal dcm. Проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLP-3-1.

Условия хранения штамма.

Штамм бактерий Escherichia coli BLP21 хранят на чашках и косяках при 4°С. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в среде LB, содержащей 30% глицерин, при -20-70°С.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLP-3-1.

Преимуществом полученного штамма Е.coli BLP21 перед штаммом-продуцентом прототипа является повышение стабильности рекомбинантного проинсулина Lyspro человека как следствие неактивного состояния генов lon и ompT, кодирующих соответственно АТР-зависимую протеиназу и протеиназу внешней мембраны бактериальных клеток. В результате, в клетках нового штамма отсутствуют продукты протеолиза предшественника инсулина, что позволило упростить процесс очистки конечного продукта и повысить выход очищенного генно-инженерного инсулина Lyspro. Изобретение иллюстрирует пример.

Пример

Штамм бактерий Е coli BLP21 создают путем введения ДНК плазмиды pLP-3-1 с помощью электропорации в компетентные клетки E coli BL21. Исходный штамм Е.coli BL21 F^- ompT hsdS_B(r_B ^- m_B ^-) gal dcm получен из музея ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г.Москва). Компетентные бактериальные клетки получают в соответствии со стандартной методикой.

Плазмидную ДНК pLP-3-1, кодирующую аминокислотную последовательность проинсулина Lyspro человека, выделяют из штамма-продуцента Е.coli pLP-3-1/TG-1 [патент РФ №2235776] стандартным щелочным методом (Maniatis, Т., Fritsch, Е.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) и используют для введения в компетентные клетки Е.coli BL21 с помощью электропорации [пат. РФ №2267534, МКИ, 2004]. Клетки нескольких бактериальных колоний, выросших на чашках в присутствии ампициллина, далее выращивают в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и хранят в пластиковых ампулах при -70°С в той же среде, содержащей 30% глицерин.

В полученном бактериальном штамме E.coli BL21/pLP-3-1 (BLP21) определяют эффективность биосинтеза рекомбинантного проинсулина Lyspro человека.

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения высокоочищенного генно-инженерного инсулина Lyspro - быстродействующего аналога инсулина человека. Путем трансформации родительского штамма бактерий Escherichia coli BL21 плазмидной ДНК pLP-3-1 получают штамм Escherichia coli BLP21 - продуцент проинсулина Lyspro. Изобретение позволяет получить стабильный рекомбинантный инсулин Lyspro с высоким выходом и по упрощенной технологии. 1 ил.

Штамм бактерий Escherichia coli BLP21 - продуцент рекомбинантного проинсулина Lyspro, содержащий плазмидную ДНК pLP-3-1.