Способ оценки уровня окислительного стресса у пациентов с ожогами Российский патент 2023 года по МПК G01N33/49 G01N33/92 G01N21/76 

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано при оценке окислительного стресса у пациентов с термической травмой.

Высокий риск осложнений при тяжелых ожоговых травмах в настоящее время все чаще связывают с развитием у пострадавших синдрома системного воспалительного ответа. Термическая травма вызывает выброс цитокинов и простагландинов, в результате чего усиливается взаимодействие между лейкоцитами, тромбоцитами и клетками эндотелия. Активация лейкоцитов, в первую очередь полиморфно-ядерных (ПМЯЛ), ведет к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) и азота, что в сочетании с повышенной адгезией ПМЯЛ к эндотелию создает угрозу окислительного повреждения собственных органов и тканей. С другой стороны, резкое снижение радикал-продуцирующей активности ПМЯЛ может способствовать развитию сепсиса. В норме повышенная продукция АФК компенсируется активацией защитных антиоксидантных ферментов (супероксид дисмутазы, каталазы, глутатион пероксидазы и др.). Дисбаланс между активностью радикал-продуцирующей и антиоксидантной систем приводит к избытку свободных радикалов, которые играют роль циркулирующих «патологических сигналов», и лежит в основе поражения легких и других внутренних органов (Михальчик Елена Владимировна. Показатели окислительного стресса при ожоговой травме : дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.04 Москва, 2006 234 с. РГБ ОД, 71:07-3/54).

Известен способ интегральной оценки окислительного стресса при неотложных состояниях (Патент на изобретение RU 2226276), основанный на определении в сыворотке крови показателей свободнорадикальных реакций - диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, степени окисленности липидов и показателей антиоксидантной системы - α-токоферола, церулоплазмина, отличающийся тем, что оценку окислительного стресса производят по интегральному показателю К - коэффициенту окислительного стресса сыворотки крови, определяемому по формуле:

где К - интегральный показатель окислительного стресса;

ДКi - содержание диеновых конъюгатов в сыворотке крови больного;

МДАi - содержание малонового диальдегида в сыворотке крови больного;

COi - степень окисленности липидов сыворотке крови больного;

ТФi - содержание α-токоферола в сыворотке крови больного;

ЦПi - содержание церулоплазмина в сыворотке крови больного;

ДКn - содержание диеновых конъюгатов в сыворотке крови здорового человека (норма);

МДАn - содержание малонового диальдегида в сыворотке крови здорового человека (норма);

СОn - степень окисленности липидов сыворотки крови здорового человека (норма);

ТФn - содержание α-токоферола в сыворотке крови здорового человека (норма);

ЦПn - содержание церулоплазмина в сыворотке крови здорового человека (норма). Увеличение коэффициента К по сравнению с нормой свидетельствует об усилении окислительного стресса и о преобладании прооксидантных процессов над антиоксидантными.

В вышеприведенном способе используется большое количество показателей, оперирование сложными формулами, что требует больших временных затрат и расхода реактивов. Кроме того, нет возможности осуществлять оценку, необходимую для прогноза ожоговой болезни.

Известен способ диагностики окислительного стресса организма человека (Патент на изобретение RU 2236008), связанный с определением в гемолизате уровня тиоловых групп. По разнице между показателями среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей, равного 0,174±0,004 оптических единиц, и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп. При значении этой разницы, равной 0,000±0,008 оптических единиц, определяют отсутствие окислительного стресса. При положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Дополнительно определяют количество продуктов модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fe2+ процессовперекисного окисления. Определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритротроцитов по формуле:

КОМБэр.=(ТБЧэр.+ТБЧэр.Ind)⋅(Ед-sh-гр.-Ei-sh-гр.)⋅100, где КОМБэр. - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА, ТБЧэр. - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в оптических единицах, ОЕ, ТБЧэр.Ind - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe2+, в оптических единицах, ОЕ, Ед-sh-гр. - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОЕ, равный 0,174±0,004 ОЕ, Ei-sh-гр. - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ, 100 - расчетный коэффициент. Чем выше положительное значение КОМБэр., тем выше уровень окислительного стресса организма.

К недостаткам способа можно отнести:

1) учет показателей прооксидантной и антиоксидантной систем свободнорадикального окисления только на клеточном уровне (в эритроцитах) без внимания плазменного звена, что снижает чувствительность данного метода и приводит к неверному отражению уровня имеющегося окислительного стресса, а, следовательно, неадекватному назначению терапии, направленной на его устранение;

2) невысокая информативность, так как исследуемые тиоловые соединения являются узкоспецифичными, преимущественно внутриклеточными антиоксидантами, и не учитываются плазменные антиоксиданты, имеющие существенное значение в защите от свободных радикалов, что не позволяет полностью оценить все звенья антиоксидантной системы, приводящие к развитию и формированию окислительного стресса, поэтому достоверность данного метода снижается;

3) длительность оценки, в связи с использованием большого количества показателей, ручных спектрофотометрических методов анализа, многоэтапной пробоподготовки, необходимости применения дополнительного оборудования при использовании метода люминесценции.

Поскольку у всех пациентов с обширными ожогами присутствует в той или иной степени окислительный стресс, то антиоксидантную терапию назначают при поступлении больного и контролируют состояние на всем протяжении лечения. В связи с этим требуется получение объективных данных оценки оксидативного стресса в процессе лечения.

Задача предполагаемого изобретения - разработка способа комплексной оценки оксидативного стресса при термической травме, основанный на использовании минимального количества лабораторных методов диагностики, для назначения и контроля эффективности антиоксидантной терапии.

Техническим результатом изобретения является сокращение времени на получение оценки оксидативного стресса у пациентов с ожогами, повышение ее эффективности и информативности. Технический результат достигается тем, что методом индуцированной биохемилюминесценции определяют показатели свободнорадикального окисления (СРО), за который принимают значение S, выдаваемое биохемилюминометром, и общей антиоксидантной активности (ОАА), за который принимают значение tg2α, выдаваемое биохемилюминометром, не менее трех дней подряд и если в каждый из трех дней СРО/ОАА 14,5 и более, то оксидативный стресс оценивают как критический с преобладанием свободно-радикальной активности, а при значении 12,2 и менее как критический с преобладанием антиоксидантной активности, в остальных случаях оксидативный стресс оценивают как адекватный.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного забирают кровь в пробирку с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и общепринятым методом получают плазму крови. Далее в плазме определяют активность процессов свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной активности c помощью метода индуцированной биохемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-06 (Нижний Новгород) [Пискарев И.М. и др. Исследование уровня свободнорадикальных процессов в субстратах и биологических образцах с помощью индуцированной хемилюминесценции // Биофизика. - 2015. - Т. 60, № 3. - С. 496-505]. В кювету биохемилюминометра вносят 100 мкл плазмы, 400 мкл фосфатного буфера (рН=7,5), 400 мкл 0,05 мМ раствора сульфата железа и 200 мкл 2% раствора Н2О2. Измеряют интенсивность свечения за 30 секунд. На экране компьютера появляется информационная карта, на которой высвечиваются значения, характеризующие интенсивность СРО и ОАА. Оценивают следующие параметры хемилюминограммы: tg2α - показатель, свидетельствующий об общей антиоксидантной активности и характеризующий скорость спада процессов свободнорадикального окисления, который принимают за СРО; S - показатель, свидетельствующий о свободнорадикальном окислении биологического объекта и равный светосумме хемилюминесценции за 30 секунд (количество импульсов за 30 секунд), который принимают за ОАА.

Рассчитывают отношение СРО к ОАА, и если в каждый из трех дней подряд отношение показателя свободнорадикального окисления к показателю общей антиоксидантной активности 14,5 и более оксидативный стресс оценивают как критический с преобладанием свободно-радикальной активности, а при 12,2 и менее как критический с преобладанием антиоксидантной активности.

Метод биохемилюминесценции, индуцированной H₂O₂ и Fe²⁺, основан на каталитическом разложении Н₂О₂ ионами металла с переходной валентностью по реакции Фентона: HOOH + Fe²⁺ → HO^• + OH^- + FeO₂^. приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света [Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. - 2009. - Т. 49. - С. 341-388]. На интенсивность биохемилюминесценции влияет полный комплекс соединений, обладающих как антиоксидантным, включая ферменты и вещества с антиоксидантными свойствами, так и прооксидантным действием. Таким образом, метод дает возможность комплексной оценки баланса про-/антиоксидантных систем и, следовательно, позволяет выявить уровень компенсаторных возможностей организма.

Причинно-следственная связь между существенными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом проявляется в выборе параметров, получаемых с помощью метода биохемилюминесценции СРО и ОАА, являющихся универсальными показателями окислительного стресса, имеющими однозначную трактовку. Используют для оценки только два показателя, что уменьшает количество реактивов, сокращает время, необходимое для оценки. Исследования проводят три дня подряд, чтобы повысить точность оценки, исключив случайные изменения и погрешности измерений. Показатель СРО, полученный с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции, позволяет количественно определить все продукты окислительной модификации различной природы (липидной, белковой, нуклеотидной, углеводной), которые являются составными компонентами мембран и субклеточных структур, что позволит правильно оценить выраженность сформировавшегося окислительного стресса у пациента с ожогами. Таким образом, исследование общей антиоксидантной активности плазмы и интенсивности СРО, включая количество окисленно-модифицированных продуктов при индукции перекисного окисления химическими прооксидантами (Fe2+), одновременно позволит оценивать степень выраженности окислительного стресса и рассчитать объем необходимой антиоксидантной терапии.

Способ поясняется примерами.

Пример 1.

В ожоговое отделение поступил пациент К., возраст 43 года, при поступлении состояние пациента расценено как тяжелое. Диагноз: Ожог пламенем I-II-III степени на площади 60% поверхности тела. Тяжелый ожоговый шок. Индекс Франка - 72, что свидетельствует по данным литературы о сомнительном исходе для пациента. По предложенному способу выполнен забор крови и на биохемилюминометре БХЛ-06 (Нижний Новгород) получены показатели СРО и ОАА в 1-ые, 2-ые, 3-и сутки после травмы и в процессе лечения. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1 Сутки СРО ОАА СРО/ОАА 1 12,660 0,450 28,133 2 13,027 0,477 27,310 3 11,034 0,510 21,635 4 10,911 0,547 19,947 5 10,231 0,585 17,489 6 10,321 0,602 17,145 7 10,911 0,641 17,022 8 10,513 0,658 15,977 9 10,324 0,712 14,500 10 10,302 0,740 13,922 11 10,315 0,739 13,958 12 10,127 0,713 14,203 13 10,104 0,728 13,879 14 10,008 0,735 13,616

Как видно из таблицы 1 первые три дня значения СРО/ОАА превышали 14,5, поэтому оксидативный стресс оценен как критический с преобладанием свободнорадикальной активности. Пациенту проведено комплексное лечение с включением антиоксидантных препаратов.

По предложенному способу выполнен забор крови и получение СРО и ОАА на 4-ые, 5-ые, 6-и сутки в процессе лечения. Соотношение СРО/ОАА превышали 14,5, но были значительно ниже показателей первых трех суток.

Состояние пациента оставалось тяжелым, но стабильным, без отрицательной динамики.

Выполнен забор крови и получение СРО и ОАА на 11-ые, 12-ые, 13-и сутки в процессе лечения. Соотношение СРО/ОАА не превышали 14,5 и были больше 12,2, поэтому оксидативный стресс оценен как адекватный. При этом состояние пациента средней степени тяжести, стабильное.

В результате проведенного лечения пациент выписан с признаками выздоровления на 32 сутки.

Пример 2.

В ожоговое отделение поступил пациент К., возраст 30 лет. Диагноз: Ожог пламенем I-II-III степени на площади 51% поверхности тела. Ожоговый шок. Термоингаляционная травма. Ожог роговиц. Индекс Франка - 115, что по данным литературы свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для пациента. По предложенному способу выполнен забор крови и на биохемилюминометре БХЛ-06 (Нижний Новгород) получены показатели СРО и ОАА в 1-ые, 2-ые, 3-и сутки после травмы и в процессе лечения. Полученные данные приведены в таблице 2.

Таблица 2 Сутки СРО ОАА СРО/ОАА 1 10,14 0,547 18,537 2 10,819 0,632 17,119 3 11,032 0,583 18,923 21 10,52 0,728 14,450 22 10,416 0,755 13,800 23 9,823 0,762 12,900

Как видно из таблицы 2 первые три дня значения превышали 14,5, поэтому оксидативный стресс оценен как критический с преобладанием свободнорадикальной активности.

Пациенту проведено комплексное лечение с включением антиоксидантных препаратов.

К 21 суткам состояние пациента средней степени тяжести с отчетливой положительной динамикой. Выполнен забор крови и получение СРО и ОАА на 21-ые, 22-ые, 23-и сутки в процессе лечения. Соотношение СРО/ОАА не превышали 14,5, но были более 12,2, поэтому оксидативный стресс оценен как адекватный.

Пациент выписан с признаками выздоровления на 67 сутки.

Пример 3.

В ожоговое отделение поступил пациент Д., возраст 38 лет. Диагноз: Ожог кипятком I-II-III степени на общей площади 75% поверхности тела. Ожоговый шок. Индекс Франка - 105, что свидетельствует по данным литературы о неблагоприятном исходе для пациента. По предложенному способу выполнен забор крови и на биохемилюминометре БХЛ-06 (Нижний Новгород) получены показатели СРО и ОАА в 1-ые, 2-ые, 3-и сутки после травмы и в процессе лечения. Полученные данные приведены в таблице 3.

Таблица 3. Сутки СРО ОАА СРО/ОАА 1 8,930 0,355 25,15493 2 35,738 1,090 32,78716 3 53,725 1,645 32,65957 4 53,615 1,674 32,02808 5 53,464 1,680 31,82381 6 53,613 1,730 30,99017 7 53,725 1,764 30,45635 8 53,050 1,235 42,95547 9 43,135 1,753 24,60639 10 42,415 1,784 23,77522 11 42,514 1,718 24,74622 12 41,618 1,613 25,80161 13 45,896 1,654 27,74849 14 47,669 1,662 28,68171

Как видно из таблицы 3 первые три дня значения превышали 14,5, поэтому оксидативный стресс оценен как критический с преобладанием свободнорадикальной активности. При дальнейших исследованиях за любые три дня подряд значения значительно превышали 14,5, что свидетельствует о критическом оксидативном стрессе с преобладанием свободнорадикальной активности. Эти изменения наблюдались не смотря на проводимое комплексное лечение с включением антиоксидантных препаратов. Клинически состояние пациента оставалось тяжелым, без положительной динамики. Пациент умер на 14 сутки после травмы.

Пример 4.

В ожоговое отделение поступил пациент Г., возраст 36 лет. Диагноз: Ожог пламенем I-II-III степени на площади 51% поверхности тела. Тяжелый ожоговый шок. Индекс Франка - 121, что свидетельствует по данным литературы о неблагоприятном прогнозе для пациента. По предложенному способу выполнен забор крови и на биохемилюминометре БХЛ-06 (Нижний Новгород) получены показатели СРО и ОАА в 1-ые, 2-ые, 3-и сутки после травмы и в процессе лечения. Полученные данные приведены в таблице 4.

Таблица 4 Сутки СРО ОАА СРО/ОАА 1 15,84 1,501 10,553 2 15,53 1,451 10,703 3 15,433 1,265 12,200 4 12,4 0,863 14,368 5 11,62 0,697 16,671 6 10,435 0,584 17,868 7 11,234 0,623 18,032 8 11,117 0,630 17,646 9 10,889 0,652 16,701 10 10,748 0,630 17,060 11 11,117 0,632 17,590 12 11,223 0,603 18,612 13 11,546 0,611 18,897 14 11,742 0,582 20,175

Как видно из таблицы 4 все три первых дня значения были 12,2 и менее, поэтому оксидативный стресс оценен как критический с преобладанием антиоксидантной активности. Состояние пациента оставалось тяжелым, без положительной динамики, не смотря на проведение адекватной терапии.

Пациенту проведено комплексное лечение с включением антиоксидантных препаратов. При дальнейших исследованиях за любые три дня подряд значения значительно превышали 14,5, что свидетельствует о критическом оксидативном стрессе с преобладанием свободнорадикальной активности. Состояние пациента на фоне проводимой комплексной терапии продолжало оставаться тяжелым, без положительной динамики.

Пациент скончался спустя 1,5 месяца лечения от правосторонней нижнедолевой пневмонии.

Пример 5.

В ожоговое отделение поступил пациент Г., возраст 43 года. Диагноз: Ожог пламенем I-II-III степени на площади 52% поверхности тела. Термоингаляционная травма. Тяжелый ожоговый шок. Индекс Франка - 128, что свидетельствует по данным литературы о неблагоприятном прогнозе для пациента. По предложенному способу выполнен забор крови и на биохемилюминометре БХЛ-06 (Нижний Новгород) получены показатели СРО и ОАА в 1-ые, 2-ые, 3-и сутки после травмы и в процессе лечения. Полученные данные приведены в таблице 5.

Таблица 5. Сутки СРО ОАА СРО/ОАА 1 10,867 0,487 22,314 2 10,480 0,485 21,608 3 10,775 0,49 21,990 4 10,668 0,512 20,836 5 10,534 0,523 20,141 6 10,532 0,534 19,723 7 10,540 0,545 19,339 8 10,520 0,549 19,162 9 9,520 0,584 16,301 10 9,563 0,797 11,999 11 9,640 0,740 13,027 12 9,558 0,726 13,165 13 9,548 0,732 13,044 14 9,517 0,740 12,861

Как видно из таблицы 5 первые три дня значения превышали 14,5, поэтому оксидативный стресс оценен как критический с преобладанием свободнорадикальной активности. На фоне проводимого комплексного лечения с включением антиоксидантных препаратов продолжали оценку оксидативного стресса по предложенному способу. На 7-ые, 8-ые, 9-и сутки в процессе лечения соотношение СРО/ОАА превышали 14,5, но были значительно ниже показателей первых трех суток. Состояние пациента при проведении комплексной интенсивной терапии продолжало оставаться тяжелым, но стабильным, без отрицательной динамики. Начиная с 10-ых суток состояние пациента оставалось тяжелым, стабильным, с положительной динамикой. По предложенному способу по измерениям за 11-13 сутки оксидативный стресс оценен как адекватный. Пациент выписан на амбулаторное лечение на 84 сутки.

Изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии, и может быть использовано для оценки уровня окислительного стресса у пациентов с ожогами. Методом индуцированной биохемилюминесценции определяют в крови показатели свободнорадикального окисления (СРО), за который принимают значение S, выдаваемое биохемилюминометром, и общей антиоксидантной активности (ОАА), за который принимают значение tg2α, выдаваемое биохемилюминометром, не менее трех дней подряд. Если в каждый из трех дней СРО/ОАА 14,5 и более, то оксидативный стресс оценивают как критический с преобладанием свободнорадикальной активности. При значении 12,2 и менее - как критический с преобладанием антиоксидантной активности. В остальных случаях оксидативный стресс оценивают как адекватный. Способ обеспечивает возможность сокращения времени на получение оценки оксидативного стресса у пациентов с ожогами, повышения ее эффективности и информативности, за счет определения в крови показателей СРО и ОАА методом индуцированной биохемилюминесценции. 5 табл., 5 пр.

Способ оценки уровня окислительного стресса у пациентов с ожогами, характеризующийся тем, что методом индуцированной биохемилюминесценции определяют в крови показатели свободнорадикального окисления (СРО), за который принимают значение S, выдаваемое биохемилюминометром, и общей антиоксидантной активности (ОАА), за который принимают значение tg2α, выдаваемое биохемилюминометром, не менее трех дней подряд, и если в каждый из трех дней СРО/ОАА 14,5 и более, то оксидативный стресс оценивают как критический с преобладанием свободнорадикальной активности, а при значении 12,2 и менее как критический с преобладанием антиоксидантной активности, в остальных случаях оксидативный стресс оценивают как адекватный.