СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА Российский патент 2023 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области биохимии и медицины и может быть использовано при диагностических исследованиях различных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом.

Малоновый диальдегид - один из продуктов свободнорадикального окисления липидов, накопление которого отражает степень оксидативного стресса в организме.

Известен способ определения количества малонового диальдегида [Романова Л.А., Стальная И.Д. // Современные способы в биохимии. - М., 1977, с. 64-66] с тиобарбитуровой кислотой, в котором проводят измерение оптической плотности продуктов окислительной модификации биомолекул, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Реакция проходит при температуре кипящей водяной бани, результат регистрируют на спектрофотометре при длине волны 532 нм.

Недостатком способа является завышение результата при наличии в пробе биомолекул белкового, нуклеотидного, углеводного происхождения, способных реагировать с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенных продуктов реакции.

Известен способ определения количества малонового диальдегида [Ф.А. Тугушева, А.И. Куликова, И.М. Зубина Особенности перекисного окисления липидов крови больных хроническим гломерулонефритом в стадии нарушения функции почек на фоне нефротического синдрома // Вопросы медицинской химии, 1993, т. 39, №3, с. 18-21], основанный на хроматографическом суммарном определении токоферола, общих и небелковых SH-групп эритроцитов и малонового диальдегида с математическим выделением доли малонового диальдегида.

Недостатком способа является сложность оценки исходных данных для математической обработки данных. Начальные допущения алгоритма приводят к значительной погрешности определения уровня малонового диальдегида в зависимости от фонового состава образца.

Известен способ определения количества малонового диальдегида [Janero D. R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury //Free Radical Biology and Medicine. - 1990. - Т. 9. - №. 6. - С. 515-540], в котором проводят измерение оптической плотности продукта реакции малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой, в результате которой образуется розовый триметиновый комплекс. Реакция проходит при температуре кипящей водяной бани. Измерение количества образующегося розового триметинового комплекса проводят на спектрофотометре при длине волны 532 нм.

Недостатком способа является использование термостатирования реакции в кипящей водяной бане и завышение результата при наличии в пробе биомолекул белкового, нуклеотидного, углеводного происхождения, способных реагировать с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенных продуктов реакции.

Известен способ определения количества малонового диальдегида [Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. // Вопросы питания, 1999, №2, с. 41-43], в котором измеряют суммарную антиоксидантную активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, диеновых конъюгатов и малонового диальдегида с последующим вычислением доли малонового диальдегида с использованием нормирующих коэффициентов при расчете.

Недостатком способа является сложность оценки исходных данных для математической обработки данных. Начальные допущения алгоритма приводят к полуколичественной оценке результатов определения малонового диальдегида.

Известен способ определения количества малонового диальдегида [Никифоров О.Н., Сазонова О.В., Суханова Л.Я., Князькова Л.Г., Галенок В.А. Перекисное окисление липидов и состояние системы антиоксидантной защиты у больных инсулинзависимым сахарным диабетом. Проблемы Эндокринологии. 1997;43(5):16-19] в эритроцитах, в котором проводят спектрофотометрическое измерение в максимуме оптической плотности 532 нм количества продукта реакции между малоновым диальдегидом и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре кипящей водяной бани и кислой среде pH протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты.

Недостатком способа является постоянное поддержание высокой температуры, что отрицательно влияет на стабильность анализируемого образца.

За прототип принят способ определения концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты [RU 2112241 C1, МПК G01N 33/48 (1995.01), G01N 33/50 (1995.01)] в котором в образец крови, сыворотки или гомогената ткани последовательно добавляют 1% раствор тритона X-100 или дезоксихолата, 0.6 М раствор HCl и 0.06 М раствор тиобарбитуровой кислоты; смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в минуту) образец инкубируют при постоянной температуре 95°C в течение 30-60 минут. Реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляют трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7: 3). Полученная смесь имеет характерную розовую окраску триметинового комплекса. Количество малонового диальдегида в образце оценивают по величине оптической плотности образованного триметинового комплекса относительно смеси с теми же реагентами, в отсутствии образца.

Недостатками способа являются длительность анализа более 1 часа, завышение результата при наличии в пробе биомолекул белкового, нуклеотидного, углеводного происхождения, способных реагировать с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенных продуктов реакции. Продукты таких реакций изменяют прозрачность и окраску полученной смеси, что мешает определению её оптической плотности на спектрофотометре. Помимо этого, кровь содержит большое количество окрашивающих веществ, что в несколько раз повышает оптическую плотность в области поглощения триметинового комплекса 532 нм.

Техническим результатом предложенного изобретения является создание быстрого способа, позволяющего повысить достоверность определения малонового диальдегида

Способ определения малонового диальдегида, также как в прототипе, включает последовательное добавление в жидкую пробу 1/20 по массе тритона Х-100 в виде водного раствора, раствора HCl для создания кислой среды рН ≅ 1 и использование тиобарбитуровой кислоты, оценку концентрации малонового диальдегида спектрофотометрически по величине оптической плотности образованного триметинового комплекса при длине волны 532 нм.

Согласно изобретению, для регистрации оптической плотности образованного триметинового комплекса используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованной в неё 1.0 % тиобарбитуровой кислотой, а концентрацию малонового диальдегида определяют по градуировочному графику или визуально по цветовой шкале, используя интенсивность окраски полиметакрилатной матрицы.

В качестве жидкой пробы используют воду или биологические жидкости, содержащие малоновый диальдегид.

Полиметакрилатную матрицу, состоящую из 95 % полиметилметакрилата и 5 % полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 (ПЭГ 400), в форме пластинки 4х6х1 мм опускают на 10 с в раствор, содержащий 1.0 % тиобарбитуровой кислоты в 8.2 М растворе этанола. Пластинка после обработки остается бесцветной и прозрачной. После этого матрица готова к работе или может храниться без потери свойств не менее 6 месяцев.

Полиметакрилатная матрица при рН ≅ 1 экстрагирует в собственный объем малоновый диальдегид из анализируемой пробы и препятствует проникновению биомолекул белкового, нуклеотидного, углеводного происхождения, способных реагировать с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенных продуктов в зону реакции. Таким образом, исключается влияние посторонних веществ образца на результат определения малонового диальдегида, следовательно, возрастает достоверность его определения.

По сравнению с прототипом для осуществления предложенного способа определения малонового диальдегида в жидкой пробе не требуются стадии нагревания в кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждения при 15°C в течение 30 мин, стабилизации окраски с использованием трилона Б, этанола и хлороформа, что существенно сокращает время анализа

На фиг. 1 показана градуировочная зависимость поглощения полиметилметакрилатной матрицы (А) от концентрации малонового диальдегида (С) в пробе при длине волны 532 нм.

На фиг. 2 представлена цветовая шкала окраски полиметилметакрилатной матрицы от концентрации малонового диальдегида в пробе

В таблице 1 показана проверка правильности предложенного способа определения малонового диальдегида.

Пример 1.

Использовали водный раствор стандарта малонового диальдегида (1,1,3,3-тетраэтоксипропана), полученный смешиванием 5 мкл государственного стандартного образца (массовая доля 1,1,3,3-тетраэтоксипропана - 97 %) и 100 мл дистиллированной воды. Пробу 100 мкл водного раствора стандарта малонового диальдегида вносили в пробирку объемом 10 мл, последовательно добавляли 0.5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0.2 мл 0.6 М раствора HCl для создания кислой среды рН ≅ 1. Затем в пробирку помещали полиметакрилатную матрицу с распределенной в ее объеме 1.0 % тиобарбитуровой кислотой. Пробирку встряхивали в течение 10 мин для образования хромогенного продукта розового цвета, достаточного для количественной оценки. Раствор сливали, вынимали полиметакрилатную матрицу и высушивали фильтровальной бумагой. Регистрацию результата проводили на спектрофотометре путем измерения величины оптической плотности при длине волны 532 нм. Содержание малонового диальдегида в анализируемом растворе определяли по градуировочному графику (фиг. 1). Результат определения: 4.98±0.03 мкл.

Пример 2.

Использовали водные растворы стандарта малонового диальдегида (1,1,3,3-тетраэтоксипропана), полученные смешиванием 1, 2, 4, 6 мкл государственного стандартного образца (массовая доля 1,1,3,3-тетраэтоксипропана - 97%) и 100 мл дистиллированной воды. Пробу 100 мкл водного раствора стандарта малонового диальдегида вносили в пробирку объемом 10 мл, последовательно добавляли 0.5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0.3 мл 0.4 М раствора HCl для создания кислой среды рН ≅ 1. Затем в пробирку помещали полиметакрилатную матрицу с распределенной в ее объеме 1.0 % тиобарбитуровой кислотой. Пробирку встряхивали в течение 10 мин для образования хромогенного продукта розового цвета, достаточного для количественной оценки. Раствор сливали, вынимали полиметакрилатную матрицу и высушивали фильтровальной бумагой. Построенная цветовая шкала (фиг. 2) позволяет проводить полуколичественное визуальное определение содержания малонового диальдегида в пробе.

Пример 3.

Для определения количества малонового диальдегида отбирали в центрифужную пробирку цельную гепаринизированную кровь объемом 0.02 мл. После чего кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирали плазму. Оставшуюся эритроцитарную массу перемешивали и инкубировали 90 мин в условиях жесткого окисления в термостате (t=37°С, с доступом О₂ воздуха). После инкубации к реакционной смеси прибавляли 1 мл 28% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Завершив центрифугирование, супернатант переносили количественно в пробирку объемом 5 мл.

Затем в пробирку помещали полиметакрилатную матрицу с распределенной в ее объеме 1.0 % тиобарбитуровой кислотой. Пробирку встряхивали в течение 10 мин для образования хромогенного продукта розового цвета, достаточного для количественной оценки. Раствор сливали, вынимали полиметакрилатную матрицу и высушивали фильтровальной бумагой. Регистрацию результата проводили на спектрофотометре путем измерения величины оптической плотности при длине волны 532 нм. Содержание малонового диальдегида в анализируемом растворе определяли по градуировочному графику (фиг. 1).

В способе-прототипе в пробирку добавляли 1 мл 1% раствора тиобарбитуровой кислоты. Полученный раствор термостатировали на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждали пробирку в холодной воде и определяли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 532 нм.

Была проведена проверка правильности способа определения малонового диальдегида [Показатели правильности способа определения, проводили в соответствии с требованиями РМГ 61 - 2010 / РМГ 61-2010 Показатели точности, правильности, прецизионности методик химического анализа. Введ. 2012-09-01. М.: Стандартинформ, 2013. 59 с.]. Количественное определение малонового диальдегида в сыворотке крови способом добавки показало, что малоновый диальдегид может быть определен обоими способами. Данные, полученные двумя независимыми способами, близки и согласуются. Правильность предложенного способа является более высокой по сравнению с прототипом, за счет отсутствия погрешности, вносимой фоновыми веществами крови, имеющими собственную окраску.

Предлагаемый способ сокращает время анализа за счет отсутствия стадий нагревания и стабилизации окраски и не требует введения дополнительных химических веществ. Для проведения реакции не требуется избавляться от влияния фоновых мешающих веществ, что позволяет повысить достоверность определения малонового диальдегида.

Способ определения малонового ДИальдегида

Таблица 1 Способ С_{добавки}, мМ Содержание малонового диальдегида, мМ C (_{найденной добавки}), мМ θ t_эксп Правиль-ность
σ(Δ_с), % С_{(без добавки)} S₁, % С_{(с добавкой)} S₂, % Прототип 0.04 0.010±0.002 16 0.055±0.005 6.4 0.045 0.05 0.93 12 Изобретение 0.04 0.009±0.002 13 0.048±0.003 3.0 0.039 -0.01 0.03 4

Изобретение относится к области биохимии и медицины и может быть использовано при диагностических исследованиях различных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Предложен способ определения малонового диальдегида. Последовательно добавляют в жидкую пробу 1/20 по массе тритона Х-100 в виде водного раствора, раствор HCl для создания кислой среды рН ≅ 1 и полиметакрилатную матрицу с иммобилизованной в неё 1.0% тиобарбитуровой кислотой. Оценку концентрации малонового диальдегида осуществляют спектрофотометрически по величине оптической плотности образованного триметинового комплекса при длине волны 532 нм. Концентрацию малонового диальдегида определяют по градуировочному графику или визуально по цветовой шкале, используя интенсивность окраски полиметакрилатной матрицы. Изобретение позволяет сократить время анализа, исключить влияние посторонних веществ образца на результат определения малонового диальдегида и таким образом повысить достоверность определения малонового диальдегида. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Способ определения малонового диальдегида, включающий последовательное добавление в жидкую пробу 1/20 по массе тритона Х-100 в виде водного раствора, раствора HCl для создания кислой среды рН ≅ 1 и использование тиобарбитуровой кислоты, оценку концентрации малонового диальдегида спектрофотометрически по величине оптической плотности образованного триметинового комплекса при длине волны 532 нм, отличающийся тем, что для регистрации оптической плотности образованного триметинового комплекса используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованной в неё 1.0% тиобарбитуровой кислотой, а концентрацию малонового диальдегида определяют по градуировочному графику или визуально по цветовой шкале, используя интенсивность окраски полиметакрилатной матрицы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве жидкой пробы используют воду, содержащую малоновый диальдегид.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве жидкой пробы используют биологические жидкости, содержащие малоновый диальдегид.