ДИАГНОСТИКА РИСКА РАЗВИТИЯ У СУБЪЕКТА АТЕРОСКЛЕРОЗА ИЛИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ Российский патент 2004 года по МПК A61K48/00 A61P9/10 C12Q1/68 

Настоящее изобретение касается способов диагностики возможного наличия у субъекта повышенного риска развития атеросклероза и восприимчивости пациента-диабетика к наличию повышенного риска развития диабетической ретинопатии. Изобретение далее касается способов лечения субъектов с диагнозом наличия повышенного риска развития упомянутых заболеваний с целью предотвращения развития упомянутых заболеваний. Также изобретение касается способов изучения или тестирования фармацевтических средств или генетических средств, применимых для лечения упомянутых заболеваний с использованием животной модели, включающей трансгенное животное.

Предпосылки изобретения

Публикации и другие материалы, использованные в данном тексте для освещения предпосылок настоящего изобретения и, в частности, для представления дополнительных подробностей в связи с практической стороной, включены здесь для сведения в виде библиографических ссылок.

Нейропептид-Y (NPY) входит в состав семейства панкреатических пептидов, являясь нейромодулятором, который секретируется многими нейронами центральной и периферической нервной системы: он является наиболее массовым пептидом в головном мозге и сердце (1-4). NPY является наиболее сильным возбуждающим аппетит нейропептидом и может обладать тонизирующей ингибиторной активностью в отношении сигнала о насыщении, опосредованного лептином (2-3,5). NPY стимулирует секрецию инсулина (6) и индуцируемое инсулином усвоение глюкозы у здоровых крыс (7). Напротив, инсулин и инсулиноподобный фактор-II роста подавляют секрецию NPY гипоталамусом (8). В животных моделях ожирения и диабета 2-го типа усиленная активность NPY-нейронов из-за резистентности гипоталамуса к инсулиновому ингибированию может приводить к перееданию, снижению энергозатрат и ожирению (9). Кроме того, NPY участвует в контроле эндокринной оси “гипоталамус-гипофиз-надпочечник” (10). В сердечно-сосудистой системе NPY является сосудосуживающим фактором - он подавляет секрецию норэпинефрина и опосредует норэпинефриновый ответ (11). Интересно, что при экспериментальном диабете, как было показано, изменяются ответы сердечно-сосудистой и дыхательной систем на NPY (12, 13). Далее, NPY может обладать ангиогенными свойствами (4), что может усиливать развитие атеросклероза. Широко распространяемые эффекты действия NPY опосредуются рядом различных субтипов рецепторов NPY (14). Совсем недавно авторы изобретения идентифицировали весьма распространенный полиморфизм, обусловливаемый заменой лейцина в 7-м положении на пролин (Leu-7-Pro) (15). Было установлено, что этот полиморфизм ассоциирован с существенно более высокими уровнями сывороточных общих и LDL-холестеринов, в частности, у больных с ожирением в исследованных двух независимых популяциях из Финляндии и одной популяции из Голландии. Кроме того, в одной из этих популяций уровни аполипопротеина-В были выше у индивидуумов без диабета, имеющих полиморфизм Leu-7-Pro (15). Хотя биохимическая и физиологическая связь между метаболизмом холестерина и NPY в настоящее время не установлена, тем не менее полиморфизм Leu-7-Pro в гене NPY должен рассматриваться как новый генетический маркер высоких уровней холестерина у больных с ожирением.

Краткое содержание изобретения

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение касается способа диагностики восприимчивости субъекта к наличию повышенного риска развития атеросклероза, причем упомянутый способ включает определение наличия у упомянутого субъекта полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека, причем упомянутый полиморфизм заключается в замене лейцина в положении 7 на пролин на участке сигнального пептида упомянутого препро-NPY, причем упомянутый полиморфизм является индикатором повышенного риска развития атеросклероза.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение касается способа диагностики у пациента-диабетика восприимчивости к наличию повышенного риска развития диабетической ретинопатии, причем упомянутый способ включает определение наличия у упомянутого субъекта полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека, причем упомянутый полиморфизм заключается в замене лейцина в положении 7 на пролин на участке сигнального пептида упомянутого препро-NPY, причем упомянутый полиморфизм является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии.

В соответствии с третьим аспектом настоящее изобретение касается способа лечения субъекта, у которого диагностирован повышенный риск развития атеросклероза, или лечения пациента-диабетика, у которого диагностирован повышенный риск развития диабетической ретинопатии, с целью предотвращения развития любого из упомянутых заболеваний, включающего введение упомянутому субъекту эффективного количества агента, противодействующего влиянию мутантного гена NPY.

В соответствии с четвертым аспектом настоящее изобретение касается способа лечения субъекта, у которого диагностирован повышенный риск развития атеросклероза, или лечения пациента-диабетика, у которого диагностирован повышенный риск развития диабетической ретинопатии, с целью предотвращения развития любого из упомянутых заболеваний, включающего применение к субъекту специфичной генотерапии, имеющей целью восстановление мутантной последовательности сигнального пептида NPY.

В соответствии с пятым аспектом настоящее изобретение касается способа изучения или тестирования фармацевтических средств или генетических средств, применимых для лечения атеросклероза или диабетической ретинопатии, путем использования животной модели, включающей трансгенное животное, которое несет последовательность ДНК человека, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую препропоследовательность нейропептида-Y (препро-NPY), или ее часть, кодирующую зрелый пептид NPY человека, в котором аминокислота лейцин в 7-м положении на участке сигнального пептида упомянутого препро-NPY либо (i) не изменена, либо (ii) заменена на пролин.

В соответствии с шестым аспектом настоящее изобретение касается способа изучения или тестирования фармацевтических средств или генетических средств, применимых для лечения атеросклероза или диабетической ретинопатии, путем использования животной модели, включающей трансгенное животное, которое несет последовательность ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, которая кодирует во всех отношениях нормальную последовательность NPY мыши, или ее часть, которая кодирует зрелый пептид NPY мыши, но в составе которой нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид мыши, заменена на последовательность сигнального пептида человека, кодирующую либо нормальный, либо мутантный сигнальный пептид человека.

Краткое описание чертежей

На фиг.1а схематически изображена молекулярная структура гена NPY человека, пептида препро-NPY и зрелого пептида NPY.

На фиг.1b показана нуклеотидная последовательность гена NPY человека. Прописные символы соответствуют экзонным последовательностям, а строчные символы - последовательностям интронов. В скобках указаны депозитарные номера GenBank. Стрелка указывает на положение, в котором тимидин (Т) нормального гена заменен на цитозин (С) с образованием мутантного гена. Подчеркнутая последовательность во 2-м экзоне - это последовательность, которая кодирует сигнальный пептид из 28 аминокислот (1-й экзон - SEQ ID NO 1; 2-й экзон - SEQ ID NO 2; 3-й экзон - SEQ ID NO 3 и 4-й экзон - SEQ ID NO 4).

На фиг.1с показана нуклеотидная последовательность мРНК препро-NPY человека (SEQ ID NO 5: последовательность белка приведена в SEQ ID NO 6). Стрелка указывает на положение, в котором тимидин (t) в нормальной мРНК заменен на цитозин (с) с образованием мутантной мРНК.

Подробное описание изобретения

Нейропептид-Y (NPY) является состоящим из 36 аминокислот нейромедиатором, широко представленным в центральной и периферической нервной системе. NPY обладает широким спектром активностей, которые связаны с контролем энергетического баланса организма и функции сердечно-сосудистой системы. Ранее авторами изобретения было показано, что субъекты, у которых в составе сигнального пептида NPY имеется пролин-7, характеризуются более высокими уровнями сывороточных холестерина и аполипопротеина-В по сравнению с индивидуумами, характеризующимися последовательностью сигнального пептида дикого типа (Leu-7/Leu-7). Настоящее изобретение основывается на анализе связи полиморфизма Leu-7-Pro гена NPY и общей толщины интимы-медии (IMT) сонной артерии, определенной методом ультрасоно-графического сечения в ходе 10-летнего катамнестического обследования пациентов, которым в первый раз был поставлен диагноз диабета 2-го типа (81 пациент: 41 мужчина, средний возраст 67,1 лет), и индивидуумов без диабета (105 субъектов: 48 мужчин, средний возраст 65,5 лет), у которых было проведено генотипирование по полиморфизму Leu-7-Pro в составе гена NPY. Частота носительства замены Рrо-7 составила 9,9% у больных-диабетиков и 14,3% у контрольных лиц (р=0,360). Средняя общая IMT сонной артерии у индивидуумов без диабета без полиморфизма Leu-7-Pro составила 1,04±0,02 мм, с полиморфизмом - 1,14±0,04 мм (р=0,156), а у пациентов-диабетиков - соответственно 1,18±0,03 и 1,58±0,21 мм (р=0,004). В анализе ковариаций общей группы средняя общая IMT сонной артерии была независимо ассоциирована с полиморфизмом Leu-7-Pro (F=5,165; р=0,024). Эта модель учитывала возраст, пол, диабет, клинические проявления “макрососудистых” заболеваний, курение, систолическое кровяное давление и уровень LDL-холестерина. Более того, больные-диабетики, включающие Рrо-7 в составе препро-NPY, характеризовались достоверно большей частотой диабетической ретинопатии (р=0,04) по сравнению с пациентами, имевшими генотип Leu-7/Leu-7. Данное исследование указывает на то, что присутствие замены Рrо-7 в препро-NPY достоверно ассоциировано с повышенным атеросклерозом сонных артерий у субъектов с диабетом и без диабета, причем даже после корректировки по известным факторам риска. Более того, представлено первое доказательство того, что Рrо-7 в составе препро-NPY повышает риск развития диабетической ретинопатии у пациентов с диабетом 2-го типа.

Последовательность ДНК или мутантный сигнальный пептид, или упомянутый пептид, связанный с любым иным продуктом расщепления препро-NPY, могут быть использованы для тестирования субъекта с целью определения того, является ли упомянутый субъект носителем мутантного гена NPY. Определение может быть осуществлено либо путем анализа ДНК с помощью хорошо известных методов, которые включают прямое секвенирование ДНК нормального и мутантного гена NPY, аллель-специфичную амплификацию с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющую выявлять либо нормальную, либо мутантную последовательность NPY, либо путем непрямого выявления нормального или мутантного гена NPY с помощью различных молекулярно-биологических методов, включая, например, метод ПЦР-выявления одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) или электрофорез в денатурирующем гель-градиенте (DGGE). Определение нормального или мутантного гена NPY также можно осуществить с использованием метода выявления ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), который, в частности, применим для генотипирования большого числа образцов.

Определение также может быть проведено на уровне РНК с помощью анализа РНК, экспрессируемой на тканевом уровне, с применением различных методов. Для гибридизации могут быть сконструированы аллель-специфичные зонды. Гибридизация может быть осуществлена, например, с использованием метода Нозернблоттинга, теста на защиту от РНКазы или метода гибридизации in situ. РНК, производная от нормального или мутантного гена NPY, также может быть исследована путем конверсии тканевой РНК сначала в кДНК с последующей амплификацией кДНК методом аллель-специфичной ПЦР и анализом их по типу геномной ДНК, как это было описано выше.

Как альтернатива, определение может быть осуществлено с помощью иммунологического теста, в котором образец приводят в контакт с антителом, способным связываться с сигнальным пептидом или упомянутым пептидом, связанным с любым другим продуктом расщепления препро-NPY.

Антитела могут быть сформированы по отношению к нормальной или мутантной препро-NPY или, что более специфично, по отношению к нормальному или мутантному сигнальному пептиду в составе NPY. Получение антител может быть проведено в экспериментальных животных in vivo с целью получения поликлональных антител или in vitro с использованием клеточных линий с целью получения моноклональных антител.

Субъект, у которого диагностировано наличие повышенного риска развития атеросклероза, или субъект-диабетик, у которого диагностировано наличие повышенного риска развития диабетической ретинопатии, могут быть подвергнуты лечению с целью предотвращения развития любого из упомянутых заболеваний путем введения упомянутому субъекту эффективного количества агента, противодействующего влиянию мутантного гена NPY. Это можно осуществить с помощью специфической генотерапии, имеющей целью восстановление мутантной последовательности NPY, или путем введения фармацевтических терапевтических средств, что имеет целью модулировать синтез, секрецию или метаболизм эндогенного NPY или специфическим образом взаимодействовать с сайтами-мишенями для NPY за счет модулирования эффектов NPY с участием специфических белков-рецепторов NPY. К настоящему времени пять различных субтипов рецепторов NPY были клонированы и охарактеризованы (рецепторы Y1-Y5) и были синтезированы молекулы лекарственных средств, которые специфически взаимодействуют с этими рецепторами NPY. Описанная лекарственная терапия не ограничивается только этими указанными рецепторами или механизмами, но также охватывает и другие рецепторы NPY и родственные механизмы, которые еще предстоит открыть, включая механизмы секреции NPY.

Противодействие влиянию мутантного гена NPY у пациента с применением антисмысловой терапии или переключения, или замещения гена включает направленную коррекцию связанной с заболеванием мутации или направленную (сайт-специфичную) инактивацию мутантного аллеля по механизму гомологичной рекомбинации.

Антисмысловая терапия охватывает способы, созданные для нарушения трансляции в результате прямого взаимодействия с информационной РНК-мишенью (мРНК). Этого можно достичь с использованием направленного олигонуклеотида, который взаимодействует в соответствии с правилом Уотсона-Крика с информационной РНК, функции которой блокируются. Подавление генной экспрессии с помощью антисмыслового олигонуклеотида зависит от способности антисмыслового олигонуклеотида связываться с комплементарной последовательностью мРНК и предотвращать трансляцию этой мРНК. Возможной является корректировка единственного мутантного нуклеотида в гене с использованием стратегии, основанной на олигонуклеотидах (Giles et al., 1995; Schwab et al., 1994; Yoon et al., 1996). Короткого, состоящего из 7 или 8 нуклеотидов, олигонуклеотида достаточно для обеспечения антисмысловой активности и специфичности, которые в основном зависят от фланкирующих последовательностей РНК-мишени. Связывания должно быть достаточно для обеспечения стабильного связывания и расщепления, опосредованного РНКазой-Н.

Авторы изобретения противодействовали влиянию мутантного гена NPY с использованием короткого аллель-специфичного олигонуклеотида, который включает последовательность мутировавшего участка: ...cgа ct/сg ggg... (мутировавшие нуклеотиды выделены жирным шрифтом). Этого можно достичь путем использования олигонуклеотидов разной длины при условии, что все они распознают мутировавшую нуклеотидную последовательность. В соответствии с предсказываемой вторичной структурой мРНК препро-NPY (фиг.1 и 2) наилучшей последовательностью-мишенью являются нуклеотиды [-9]-[+2] “вокруг” сайта мутации, т.е. последовательность, направленная на 3'-ас ааg cgа ctg g-5'. Эта последовательность включает “выпуклости”, для которых известно, что они усиливают связывание олигонуклеотида с мРНК-мишенью.

Возможным является использование немодифицированных олигонуклеотидов, однако для повышения их стабильности, устойчивости к действию нуклеаз и эффективности проникновения в ядро можно использовать некоторые модификации. Было синтезировано достаточно большое число модифицированных пиримидинов, в основном по атомам С-2, С-4, С-5 и С-6, с включением их в нуклеотиды. Также могут быть синтезированы и включены в олигонуклеотиды пуриновые аналоги. Положение 2' в сахарной составляющей (пентафуранозном кольце) заменяют на группы метокси, пропокси, O-алкокси или метоксиэтокси. Был сформирован новый скелет олигонуклеотидов, в котором заменены фосфат или сахарно-фосфатная единица, например С5-пропинилпиримидин-модифицированные фосфотиоатные олигонуклеотиды. Также можно использовать химерные олигонуклеотиды, у которых 5'- и 3'-концы модифицированы межнуклеотидными связями, такими как метилфосфотиоатные, фосфодиэфирные или метилфосфонатные. Относительно новые технологии связаны с конформационно ограниченными ЗНК-олигонуклеотидами (“закрытая нуклеиновая кислота”) и пептид-нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины). По структуре отличаются сконструированные в биосистемах рибозимы, однако их специфичность также связана с распознаванием последовательности мРНК-мишени.

В способах замещения гена или переключения гена инактивируют последовательность мутантного гена и вносят скорректированную последовательность. Этого можно достичь путем трансфекции экзогенного гена с нормальной кодирующей последовательностью и блокировки мутантной кодирующей последовательности антисмысловым олигонуклеотидом. Также можно использовать способ, включающий только внесение скорректированной нормальной последовательности без разрушения мутантной последовательности. Это можно использовать в гетерозиготных клетках, т.е. клетках, несущих один нормальный аллель и один мутантный аллель, результатом чего будет преобладание экспрессии нормальных аллелей. Также могут быть обработаны гомозиготные по мутации клетки, в результате чего будет достигнут доминантный положительный эффект, т.е. нормальный аллель будет экспрессирован в большей степени, чем мутантный аллель.

Влияние мутантной последовательности NPY на функции гена NPY можно исследовать у трансгенных животных. Трансгенное животное может быть получено с использованием методологии направленной гомологичной рекомбинации. И нормальная, и мутантная последовательности сигнального пептида NPY человека (или любая последовательность ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует препропоследовательность нейропептида-Y (препро-NPY), или ее часть, которая кодирует аминокислотную последовательность зрелого пептида NPY мыши или зрелого пептида NPY человека, в котором (i) аминокислота лейцин в 7-м положении на участке сигнального пептида упомянутой препро-NPY была заменена на пролин, или (ii) аминокислота лейцин в 7-м положении на участке сигнального пептида упомянутой препро-NPY не изменена, должны быть внесены в последовательность гена NPY с целью замены эндогенной последовательности сигнального пептида. При данных условиях функции эндогенного гена NPY во всех отношениях остаются в норме, лишь синтез препро-NPY регулируется либо нормальной, либо мутантной последовательностью сигнального пептида NPY человека. Такую трансгенную модель можно использовать для изучения физиологического значения мутантного гена NPY высокоспецифичным образом. Она также будет представлять собой идеальную предклиническую модель для изучения и тестирования новых молекул лекарственных средств, которые созданы с целью модифицирования влияния мутантного гена NPY.

Настоящее изобретение более подробно описывается нижеследующими экспериментами.

Экспериментальная часть

Схема исследований

Данное исследование представляет собой данные перекрестного анализа по материалам 10-летнего обследования группы пациентов с диабетом 2-го типа и контрольных индивидуумов без диабета, наблюдаемых с момента постановки диагноза в соответствии с подробно описанным ранее (16-22). Вкратце, исходное обследование охватывало 133 пациента, у которых впервые был поставлен диагноз диабета 2-го типа, в возрасте 45-64 лет и 144 контрольных индивидуума без диабета, случайным образом отобранных из перечня населения. Базовый анализ был проведен в течение 1979-81 годов, а все субъекты обследования проживали в определенном районе на востоке Финляндии (16). Все субъекты были включены в 5- и 10-летние катамнестические наблюдения в течение 1985-86 годов (17) и 1991-92 годов (18-19) соответственно. В течение 10-летнего наблюдения 36 пациентов-диабетиков (27%) и восемь контрольных индивидуумов (6%) скончались в основном из-за сердечно-сосудистых заболеваний (18). В ходе 10-летнего наблюдения ультрасонографический анализ сонной артерии (20-21) был проведен у 84 диабетиков исходной группы (63%) и 119 членов недиабетической группы (83%), а анализ генотипа был сделан для всех субъектов за исключением трех диабетиков и одного субъекта без диабета. Исследование было утверждено Комитетом по этике университета в Куопио.

Субъекты и методы

Анализ историй болезни и сердечно-сосудистых заболеваний, применение лекарств, курение, кровяное давление, индекс массы тела (ИМТ) и соотношение окружностей талии и бедра были подробно описаны ранее (18-22). Группа “макрососудистых заболеваний” охватывает субъектов с любыми ранее установленными случаями инфаркта миокарда, инсульта или синдрома Шарко. Тест на толерантность к пищевой глюкозе проводили с использованием дозы глюкозы 75 г. Нарушенную толерантность к глюкозе у контрольных индивидуумов классифицировали в соответствии с критериями ВОЗ (23). Также ранее были охарактеризованы взятие проб крови и измерение сывороточных липидов и липопротеинов с помощью методов ультрацентрифугирования и преципитации, а также уровней аполипопротеина-В, плазматической глюкозы и плазматического инсулина (19-22).

Анализ генотипа

Генотип препро-NPY определяли с помощью анализа ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) на материале ДНК, экстрагированной из периферической крови субъектов, при том что исследователь не знал фенотип субъекта. Вкратце, полиморфизм, проявляющийся в замене тимина (1128) на цитозин (1128), образует рестрикционный BsiEI-сайт, который и использовали для генотипирования субъектов по полиморфизму Leu-7-Pro в соответствии с описанным ранее (15). ПЦР-продукты расщепляли рестриктазой BsiEI (New England Biolabs Inc., Beverly, MA: США), и продукты расщепления анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле.

Оценка атеросклероза сонной артерии

Метод высокоразрешающего ультрасонографического изображения В-типа разработали для обеспечения надежной и воспроизводимой идентификации параметров сонных артерий и определения ближних и удаленных контактов областей стенок сосудов в соответствии с тем, что более подробно описано ранее (10-21, 24). Вкратце, сонную артерию разделяли на два сегмента на основании анатомии и геометрии артерии. Ключевыми анатомическими параметрами, определяющими такое разделение, являлись проксимальная точка каротидного синуса (область бифуркации сонной артерии) и конец делителя протока, который отделяет внутреннюю сонную артерию от наружной. В продольных изображениях артерий граница адвентициальной оболочки и медиальной оболочки (медии) и граница интимы и просвета на дальней стенке сосуда являются специфическими анатомическими границами, определяющими IMT. Ультразвуковой анализ сонных артерий был проведен на двух сертифицированных соникаторах. Использовали ультразвуковое устройство Biosound Phase Two, оборудованное 10-мегагерцовым кольцевым последовательным датчиком. Видеоинформацию анализировали по количественным параметрам в центральной лаборатории с использованием процедуры компьютерного считывания (24-25). Среднюю максимальную величину для дальней стенки сосудов по двум сторонам головы использовали в качестве показателя общей IMT сонной артерии.

Статистические методы

Отправной гипотезой авторы изобретения считали то, что субъекты, характеризующиеся заменой Рrо-7 в составе препро-NPY, имеют более высокую среднюю IMT по сравнению с субъектами, имеющими препро-NPY дикого типа (Leu-7/Leu-7). Ассоциации полиморфизма Leu-7-Pro с непрерывными переменными определяли с помощью критерия Стьюдента, а для дискретных переменных использовали критерий хи-квадрат. Связь общей IMT сонной артерии с полиморфизмом Leu-7-Pro дополнительно анализировали с помощью теста на ковариантность (ANCOVA), позволяющего контролировать влияние отобранных ковариационных факторов. Переменные с асимметричным распределением (например, IMT сонной артерии, содержание инсулина) анализировали после логарифмирования. Величина Р, равная или меньшая 0,05, рассматривалась как статистически значимая. Все статистические анализы были осуществлены с помощью процедур от SPSS-Unix.

Результаты

Различие в частотах аллеля С1128 в группах субъектов без диабета (14,3%) и диабетиков (9,9%) было статистически незначимым (р=0,36). Характеристики субъектов с диабетом и без диабета в группах Leu7/Leu7 и Рго7/- даны в табл.1а-b. Различий по возрасту, полу, индексу массы тела, отношению окружности талии и бедра, уровням кровяного давления и частоте “макрососудистых” заболеваний не было выявлено между генотипическими группами в пределах групп диабетиков и субъектов без диабета. Уровень LDL-холестерина был выше у субъектов без диабета с полиморфизмом Leu-7-Pro по сравнению с отсутствием полиморфизма (р=0,05), о чем авторы сообщали ранее (15). Хотя имелась тенденция более высокого содержания аполипопротеина-В в группе Рго7/- по сравнению с группой Leu7/Leu7, это различие не было статистически значимым. Проведенные ранее авторами исследования включали только субъектов без ожирения и без применения каких-либо медикаментозных средств, известных как подавители метаболизма холестерина (такие как бета-блокаторы или мочегонные средства), в составе имевшейся группы субъектов без диабета (15). По другим липопротеинам не было выявлено отчетливых различий: интересно, что у пациентов-диабетиков не было связи с уровнем сывороточного холестерина даже тогда, когда пациентов анализировали в соответствии со средним индексом массы тела (данные не включены).

Средняя общая IMT сонной артерии была примерно на 25% выше у пациентов-диабетиков, несущих аллель Рrо-7, по сравнению с таковыми без него (р=0,004), а аналогичное превышение по IMT у субъектов без диабета составило 9% (р=0,156). Анализ ковариаций в обеих группах после их объединения (табл.2) показал, что факторами, независимо влияющими на общую IMT сонной артерии, являлись возраст, аллель Рrо-7, диабет, систолическое кровяное давление и “макрососудистые” заболевания. Более того, пациенты-диабетики, характеризовавшиеся заменой Рrо-7 в составе препро-NPY, проявляли существенно ускоренное развитие диабетической ретинопатии (р=0,04) по сравнению с диабетиками, имевшими генотип Leu-7/Leu-7.

Обсуждение

Полученные авторами изобретения данные обследования пожилых субъектов с диабетом и без диабета из Финляндии указывают на то, что аллель Рrо-7 препро-NPY достоверно связан с усиленным атеросклерозом сонных артерий, причем даже более выражение у пациентов-диабетиков. Обнаружение этого является важным потому, что повышение толщины стенок (IMT) сонных артерий повышает риск сердечно-сосудистых нарушений пропорциональным образом даже до клинического проявления сердечно-сосудистых заболеваний (26). Кроме того, присутствие полиморфизма Pro-7 в составе препро-NPY было достоверным образом связано со скоростью развития диабетической ретинопатии. Аллель Рrо-7 также был ассоциирован с высокими уровнями сывороточного LDL-холестерина и уровнями аполипопротеина-В у субъектов без диабета и без ожирения (15), однако такая связь отсутствовала у пациентов-диабетиков вне зависимости от их массы тела.

Диабет 2-го типа характеризуется состоянием, при котором заметно возрастает риск атеросклероза, и, хотя известные факторы риска составляют основу встречаемости диабетических “макрососудистых” заболеваний (27), значительная доля таких случаев поражения сосудов остается необъясненной, оправдывая тем самым поиск других вероятных средовых, метаболических и генетических влияющих факторов. В проведенном исследовании авторы изобретения впервые показывают, что для пациентов-диабетиков, несущих аллель Рrо-7, характерна более высокая IMT сонных артерий по сравнению с таковой при генотипе Leu-7/Leu-7. Хотя эти данные основываются на ограниченном числе обследованных субъектов, отсутствие связи аллеля Рrо-7 с другими факторами риска, исследованными у пациентов-диабетиков, делают обнаруженный факт более интригующим. Поскольку группа контрольных лиц без диабета включала субъектов с нарушенной переносимостью глюкозы, как и в любом популяционном анализе, а, следовательно, толерантность к глюкозе представляет собой фактор непрерывного перехода между группами исследованной популяции, то авторы объединили группы с целью повышения статистического разрешения анализа ковариаций. В таком анализе факторы возраста, диабета, систолического кровяного давления и клинически проявленных “макрососудистых” заболеваний были, как и сообщалось ранее (21), мощными факторами, влияющими на IMT сонных артерий. Интересно, что влияние генотипа NPY сохраняло статистическую значимость и в таком анализе. Ни в одной из групп другие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний у лиц без диабета не были связаны с генотипом NPY за исключением уровня инсулина при голодании. Нарушения в интерпретации могут быть обусловлены избирательной смертностью, как и в любом перекрестном анализе. Однако, поскольку уровни LDL-холестерина были стабильно выше на протяжении всего 10-летнего наблюдения у контрольных субъектов без диабета и без ожирения, несущих аллель Рrо-7, а, с другой стороны, поскольку влияние генотипа на IMT сонных артерий было более выраженным у пациентов-диабетиков, у которых со времени диагностирования наблюдалась высокая смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (18), то весьма вероятно, что в проведенных исследованиях данная связь недооценена.

Каким образом NPY может усиливать развитие атеросклероза? Во-первых, такой эффект может опосредоваться влиянием генотипа по препро-NPY на метаболизм LDL-холестерина (15). Однако этот эффект модулируется массой тела (15) и, как явствует из проведенного здесь исследования, в этом отношении такой эффект не был выявлен у пациентов с диабетом 2-го типа (более подробный анализ липопротеинов, проведенный в связи с такой зависимостью перекрестно или во времени, не дал в этом отношении каких-либо дополнительных находок). Во-вторых, NPY может обладать ангиогенными свойствами, которые могут быть вовлечены в развитие атеросклероза. Как было показано, NPY активен как митоген гладкой мускулатуры (28), как стимулятор прикрепления, миграции, синтеза ДНК (29) и образования капиллярных сосудов эндотелиальными клетками человека (4). Небольшая доля циркулирующего NPY происходит от эндотелиальных клеток, и такой происходящий от эндотелиальных клеток NPY может действовать как аутокринный ангиогенный фактор даже при очень низких своих концентрациях (4). Следовательно, лица с заменой Рrо-7 в составе препро-NPY могут быть предрасположены к увеличению толщины стенок сосудов, что выражается в увеличении толщины интимы-медии у сонных артерий, вследствие нарушения функций эндотелиального NPY. В-третьих, NPY является важным модулятором вегетативной нервной системы. Основная часть циркулирующего NPY образуется в окончаниях периваскулярных симпатических нервов, а уровень NPY коррелирует с уровнем норэпинефрина (30). Дисфункция вегетативной нервной системы является независимым фактором предрасположения пациентов с диабетом 2-го типа к смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, на что указывает анализ исследованной здесь популяции (22). Механизмы, лежащие в основе сердечно-сосудистых заболеваний и дисфункции вегетативной нервной системы во многом предположительны, однако согласно неопубликованным данным авторов настоящего изобретения вегетативная регуляция сердечной деятельности изменена у субъектов, несущих замену Рrо-7 в составе препро-NPY. Следовательно, авторы настоящего изобретения предполагают, что атеросклероз может быть связан с геном (генами), вовлеченным в развитие сосудов, липидный метаболизм и функцию вегетативной нервной системы, а недавно обнаруженный вариант гена NPY (15) является первым таким фактором, для которого показана связь с ускоренным развитием атеросклероза.

В заключение полученные результаты указывают на то, что наличие замены Рrо-7 в составе препро-NPY связано с оцениваемым ультрасонографическим методом атеросклерозом сонных артерий у жителей Финляндии с диабетом и без диабета. Более того, данное исследование впервые доказало, что присутствие Рrо-7 в препро-NPY также связано с повышенным риском развития диабетической ретинопатии у пациентов с инсулиннезависимым сахарным диабетом (диабетом 2-го типа), что может являться потенциальной мишенью для разработки лекарственных средств.

Должно быть понятно, что способы по настоящему изобретению могут быть включены в форме различных вариантов, причем только немногие из них раскрыты в данном тексте. Для специалистов в данной области должно быть понятно, что существуют и другие варианты, которые не отклоняются от сути настоящего изобретения. Следовательно, описанные варианты являются иллюстративными и не должны рассматриваться как в чем-либо ограничивающие.

Схема 1

Предсказанная вторичная структура мРНК препро-NPY. Данная схема показывает предсказанную структуру 5'-конца (нуклеотиды 1-138) полноразмерной последовательности мРНК препро-NPY, опубликованной в GenBank под депозитарным №К01911. Вторичная структура была предсказана с использованием программы MFOLD от Genetics Computer Group Висконсинского университета.

Изображение в алгоритме Squiggle для: osa1.mfold от 7 февраля, 19100, 12:46. (Линейная) MFOLD для: osa1.seq Т:37.0. Обозначение: 5173 от 1: до 138 от 7 февраля, 19100, 12:43. Длина - 138. Энергия - -28,4.

Схема 2

Предсказанная вторичная структура мРНК препро-NPY. Данная схема показывает предсказанную структуру 5'-конца (нуклеотиды 1-138) полноразмерной последовательности мРНК препро-NPY, опубликованной в GenBank под депозитарным №К01911. Вторичная структура была предсказана с использованием программы MFOLD от Genetics Computer Group Висконсинского университета. Мутантным нуклеотидом является Т→С в 106-м положении.

Изображение в алгоритме Squiggle для: osa2.mfold от 7 февраля, 19100, 14:11. (Линейная) MFOLD для: osa2.seq Т:37.0. Обозначение: 4340 от 1: до 138 от 7 февраля, 19100, 14:07. Длина - 138. Энергия - -26,4.

Библиография

1. Benarroch ЕЕ: Neuropeptides in the sympathetic system: presence, plasticity, modulation and implications. Ann Neurol 36:6-13, 1994.

2. Tomaszuk A, Simpson С, Williams G: Neuropeptide Y, the hypothalamus and the regulation of energy homeostasis. Horm Res 46:53-8, 1996.

3. Palmiter RD, Erickson JC, Hollopeter G, Baraban SC, Schwatrz MW: Life without neuropeptide Y. Recent Prog Horm Res 53:163-99, 1998.

4. Zukowska-Grojec Z, Karwatowska-Prokopczuk E, Rose W, Rone J, Movafagh S, Ji H, Yeh Y, Chen WT, Kleinman HK, Grouzmann E, Grant DS: Neuropeptide Y: a novel angiogenic factor from the sympathetic nerves and endothelium. Circ Rec 83:187-95, 1998.

5. Sahu A, Kalra SP: Neuropeptide regulation of feeding behaviour Neuropeptide Y:TEM 4:217-224, 1993.

6. Moltz JH, McDonald JK: Neuropeptide Y: direct and indirect action on insulin secretion in the rat. Peptides 6:1155-1159, 1985.

7. Vettor R, Pagano C, Granzotto M, Englaro P, Angeli P, Blum WF, Federspil G, Rohner-Jeanrenaud F, Jeanrenaud B: Effects of intravenous neuropeptide Y on insulin secretion and insulin sensivity on skeletal muscle in normal rats. Diabetologia 41:1361-7, 1998.

8. Sahu A, Dube MG, Phelps CP, Sninsky CA, Kalra PS, Kalra SP: Insulin and insulin-like growth factor II suppress neuropeptide Y release from the nerve terminals in the paraventricular nucleus: a putative hypothalamic site for energy homeostasis. Endocrinology 136:5718-24, 1995.

9. Frankish HM, Dryden S, Hopkins D, Wang Q, Williams G: Neuropeptide Y, the hypothalamus and diabetes: insights into the central control of metabolism. Peptides 16:757-71, 1995.

10. Wahlestedt С, Skagerberg G, Ekman R, Heilig M, Sundler F, Hakanson R: Neuropeptide Y (NPY) in the area of the hypothalamic paraventricular nucleus activates the pituitary-adrenocortical axis in the rat. Brain Res 417:33-38, 1987.

11. Shine J, Potter EK, Biden T, Selbie LA, Herzog H: Neuropeptide Y and regulation of the cardiovascular system. J Hypertens (Suppi) 12:S41-S45, 1994.

12. Dunbar JC, Ergene E, Anderson GF, Barraco RA: Decreased cardiorespiratory effects of neuropeptide Y in the nucleus tractus solitarius in diabetes. AmJ Physiol 262:R865-71, 1992.

13. Lind H, Eriinge D, Brunkwall J, Edvinsson L: Selective attenuation of neuropeptide-Y-mediated contractile responses in blood vessels from patients with diabetes mellitus. Clin Auton Res 5:191-7, 1995.

14. Larhammar D, Soderberg С, Lundell I: Evolution of the neuropeptide Y family and its receptors. Ann. NY Acad Sci 839:35-40, 1998.

15. Karvonen MK, Pesonen U, Koulu M, Niskanen L, Laakso M, Rissanen A, Dekker JM, Hart LM, Valve R, Uusitupa MIJ: Association of a leucine(7)-to-proline(7) polymorphism in the signal peptide of neuropeptide Y with high serum cholesterol and LDL cholesterol levels. Nat Med 4:1434-1437, 1998.

16. Uusitupa M, Siitonen O, Aro A,: Prevalence of coronary heart disease, left ventricular failure and hypertension in middle-aged, newly diagnosed type 2 (non-insulin-dependent) diabetic subjects. Diabetologia 28:22-27, 1985.

17. Niskanen LK, Uusitupa MI, Sarlund H, Siitonen O, : Five-year follow-up study on plasma insulin levels in newly diagnosed NIDDM patients and nondiabetic subjects. Diabetes Care 13:41-48, 1990.

18. Uusitupa MIJ, Niskanen LK, Siitonen O, Voutilainen E, : Ten-year cardiovascular mortality in relation to risk factors and abnormalities in lipoprotein composition in type 2 (non-insulin-dependent) diabetic and non-diabetic subjects. Diabetologia 36:1175-1184, 1993.

19. Niskanen L, Uusitupa M, Karjalainen J, Siitonen O: Metabolic evolution of Type 2 diabets - 10-year follow-up study. J Intern Med 236:263-270, 1994.

20. Uusitupa M, Niskanen L, Luoma J, Mercouri M, Rauramaa R,: Autoantibodies against oxidized LDL as predictors of atherosclerotic vascular disease in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Arterioscl&Thromb&Vasc Biol 16:1236-1242, 1996.

21. Niskanen L, Rauramaa R, Miettien H, Haffner SM, Mercuri M, Uusitupa M: Carotid artery intima-media thikness in elderly patients with NIDDM and in nondiabetic subjects. Stroke 27:1986-1992, 1996.

22. Toyry J, Niskanen L, Lansimies E, Uusitupa M: Occurrence, predictors and clinical significance of autonomic neuropathy in NIDDM: 10-year follow-up from the diagnosis. Diabetes 45:308-315, 1996.

23. World Healths Organisation. Diabetes mellitus: report of a WHO Study Group. Geneva: World Health Org., Tech Rep Ser, no 727, 1985.

24. Mercuri M, Bond MG, Nichols FT, Carr AA, Flack JM, Byington R, Raines J, for the MIDAS Group. Baseline reproducibility of B-mode ultrasound imaging measurement of carotid intimal media thikness: the Multicenter Isradipine Diuretic Atherosclerosis Study (MIDAS). J Cardiovasc Diagnosis Procedures 11:241-252, 1993.

25. Rauramaa R, , Mercuri M, Rankinen Т, Bond MG: Association of risk factors and body iron status to carotid atherosclerosis in middle-aged Eastern Finnish men. Eur Heart J 15:1020-1027, 1994.

26. O'Leary DH, Polak JF, Kronmal RA, Manolio ТА, Burke GL, Wolfon SKJ. Carotid-artery intima and media thikness as a risk factor for myocardial infarction and stroke in older adults. Cardiovascular Health Study Collaborative Research Group. N Engi J Med 1999; 340:14-22.

27. Stamler J, Vaccaro O, Neaton JD, Wentworth D for the Multiple Risk Factor Intervention Trial Research Group: Diabetes, other risk factors and 12-years cardiovascular mortality for men screened in the Multiple Risk Factor Intervention Trial. Diabetes Care 16:434-444, 1993.

28. Zukowska-Grojec Z, Pruszczyk P, Colton C, Yao J, Shen GH, Myers AK, Wahlestedt C: Mitogenic effect of neuropeptide Y in rat vascular smooth muscle cells. Peptides 1993; 14:263-268.

29. Shigeri Y, Fujimoto M: Neuropeptide Y stimulates DNA synthesis in vascular smooth muscle cells. Neurosci Lett 1993; 149:19-22.

30. Lundberg JM, Franco-Cereceda A, Hemsen A, Lacroix JS, Pernow J: Pharmacology of noradrenaline and neuropeptide tyrosine (NPY)-mediated sympathetic cotransmission. Fundam Clin Pharmacol 4:373-391, 1990.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике наличия у субъекта повышенного риска развития атеросклероза и возможного наличия у субъекта-диабетика повышенного риска развития диабетической ретинопатии. Настоящее изобретение касается способов лечения субъектов, у которых диагностировано наличие повышенного риска развития упомянутых заболеваний. Также изобретение касается способов изучения или тестирования фармацевтических средств или генетических средств, применимых для лечения таких заболеваний с использованием животной модели, включающей трансгенное животное. Способы по настоящему изобретению основаны на полиморфной замене лейцина на пролин в 7-м положении в составе гена препропоследовательности нейропептида-Y. Технический результат: повышение эффективности диагностики атеросклероза и диабетической ретинопатии. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 ил.

1. Способ диагностики риска развития атеросклероза, включающий определение у пациента полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека, причем полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-м положении на участке указанного сигнального пептида и является индикатором повышенного риска развития атеросклероза.2. Способ по п.1, в котором пациент является диабетиком.3. Способ диагностики риска развития диабетической ретинопатии, включающий определение у пациента полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека, причем полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-м положении на участке указанного сигнального пептида и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии.4. Способ лечения пациента, у которого диагностирован повышенный риск развития атеросклероза в соответствии с п.1 или 2, с целью предотвращения развития атеросклероза, включающий введение пациенту эффективного количества агента, противодействующего влиянию мутантного гена NPY.5. Способ по п.4, при котором упомянутым агентом является фармацевтическое средство, имеющее целью модулировать синтез, секрецию или метаболизм эндогенного NPY или взаимодействовать специфическим образом с сайтами-мишенями для NPY путем модулирования действия NPY за счет специфичных к NPY белков-рецепторов.6. Способ по п.4, при котором упомянутым агентом является фармацевтическое средство, имеющее целью модулировать экспрессию нормального или мутантного гена NPY.7. Способ лечения пациента с повышенным риском развития атеросклероза в соответствии с п.1 или 2 с целью предотвращения развития атеросклероза, включающий применение к пациенту специфичной генотерапии, имеющей целью восстановление мутантной последовательности NPY.8. Способ лечения пациента-диабетика с повышенным риском развития диабетической ретинопатии в соответствии с п.3 с целью предотвращения развития диабетической ретинопатии, включающий введение пациенту эффективного количества агента, противодействующего влиянию мутантного гена NPY.9. Способ по п.8, при котором упомянутым агентом является фармацевтическое средство, имеющее целью модулировать синтез, секрецию или метаболизм эндогенного NPY или взаимодействовать специфическим образом с сайтами-мишенями для NPY путем модулирования действия NPY за счет специфичных к NPY белков-рецепторов.10. Способ по п.8, при котором упомянутым агентом является фармацевтическое средство, имеющее целью модулировать экспрессию нормального или мутантного гена NPY.11. Способ лечения пациента-диабетика с повышенным риском развития диабетической ретинопатии в соответствии с п.3 с целью предотвращения развития диабетической ретинопатии, включающий применение к пациенту специфичной генотерапии, имеющей целью восстановление мутантной последовательности NPY.12. Способ изучения фармацевтических средств или генетических средств, применимых в лечении атеросклероза или диабетической ретинопатии, путем использования животной модели, включающей трансгенное животное, которое несет последовательность ДНК человека, включающую нуклеотидную последовательность, которая кодирует препропоследовательность нейропептида-Y (препро-NPY), или ее часть, которая кодирует зрелый пептид NPY человека, в котором аминокислота лейцин в 7-м положении на участке сигнального пептида упомянутой препро-NPY (i) не заменена или (ii) заменена пролином.13. Способ изучения фармацевтических средств или генетических средств, применимых в лечении атеросклероза или диабетической ретинопатии, путем использования животной модели, включающей трансгенное животное, которое несет последовательность ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, которая кодирует во всех отношениях нормальную последовательность NPY мыши, или ее часть, которая кодирует зрелый пептид NPY мыши, но в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид мыши, заменена на последовательность сигнального пептида человека, кодирующую либо нормальный, либо мутантный сигнальный пептид человека.