СПОСОБ РАННЕГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 G01N33/573 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 

Предполагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, генетике, нефрологии, генной инженерии, биохимии и может быть использовано с целью прогнозирования тяжелого течения диабетической нефропатии у лиц с сахарным диабетом 1 типа.

Сахарный диабет 2 типа (СД 2) - это полигенное мультифакторное заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией, которая является результатом нарушения секреции, действия инсулина или обоих этих факторов. В основе заболеваний, относящихся к мультифакториальным, лежит генетическая предрасположенность и средовые факторы. Мультифакториальные заболевания (МФЗ) являются самой многочисленной и разнообразной группой болезней, составляющую более 90% от всей соматопатологии человека и характеризующиеся наиболее высокими темпами роста заболеваемости, смертности и инвалидизации трудоспособного населения в современных популяциях [Бочков Н.П. и др., 2011]. К наиболее часто встречающимся МФЗ относятся: ревматоидный артрит, ишемическая болезнь сердца, гипертоническая и язвенная болезни, цирроз печени, сахарный диабет и др., которые сопровождаются различными осложнениями. Особую роль в прогнозе течения болезни и качестве жизни пациента играет такое грозное осложнение СД 1, как диабетическая нефропатия (ДНП), приводящая в своем исходе к Хронической болезни почек. ДНП формируется в результате гемодинамических и метаболических факторов и возникает приблизительно у 20-40% больных СД 1 типа (Дедов И.И, Шестакова M.B., 2016). При этом смертность у лиц с СД 1 типа и ДНП в 2 раза выше, чем у пациентов без ДНП (Древаль А.В., Мисникова И.В., 2010). Выявление предикторов, которые, помимо уже известных повреждающих факторов (гипергликемия, артериальная гипертензия, дислипидемия, иммунное воспаление, окислительный стресс), способны оказывать влияние на тяжесть и быстроту прогрессирования нефропатии, прежде всего, за счет избыточного образования мембрано- и цитотоксических продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), является важной проблемой для углубления знаний о механизмах развития и течения ДНП. В связи с активным развитием генетических технологий и повышением знаний в области молекулярно-генетических исследований широкое распространение приобретает изучение взаимосвязи между отдельными аллельными генами и патологическими процессами (Кузьмина Л.П, Безругавнигова Л.М., 2006). Значительное число имеющихся данных свидетельствует о вовлеченности различных полиморфных генов в формирование предрасположенности к мультифакторной патологии, как по всему спектру, так и к отдельным нозологическим формам [Risch N.J., 2000; Hirschhorn J.N. et al., 2002; Lohmueller K.E. et al., 2003; Баранов B.C., 2009]. В условиях современной техногенной цивилизации считается, что наиболее существенный вклад в формирование предрасположенности к социально значимым болезням человека могут вносить гены ферментов защитных и адаптационных систем организма - это, прежде всего, гены компонентов системы иммунного надзора, антиоксидантной защиты (АОЗ) и ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) [Полоников А.В. с соавт., 2008.]. Обнаружение полиморфных аллелюй генов биотрансформации ксенобиотиков, которые, с одной стороны, обезвреживают опасные для организма вещества, а с другой стороны, продуцируют активные формы кислорода в процессе функционирования (АФК), которые обладают высокой реакционной способностью и являются потенциальными факторами интенсификации процессов свободно-радикального окисления (СРО) и ПОЛ, позволит прогнозировать и заранее включать в комплексную терапию СД препараты антиоксидантного и нефропротективного действия. Все вышесказанное определяет актуальность изучения роли полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков в развитии патобиохимических нарушений у больных с ДНП и позволит определить дополнительные эффективные методы мониторинга проводимой терапии на молекулярно-генетическом уровне.

Известен способ прогнозирования развития хронической болезни почек (ХБП) у пациентов с сахарным диабетом (СД) (2021115852, 02.06.2021 МПК А61В 5/00 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)), включающий определение типа сахарного диабета и комплекса диагностически значимых показателей: пол (х пол), возраст на момент постановки диагноза (х возраст), наличие инфаркта миокарда в анамнезе (х инфаркт), наличие диабетической комы в анамнезе (х кома), наличие диабетической ретинопатии (х ретинопатия), значение индекса массы тела (ИМТ) (х ИМТ), на основании полученных данных и при наличии СД 1 типа вычисляют вероятность развития ХБП через 5 лет у пациентов с СД 1 типа (р) по формуле:

,

Известен способ диагностики риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, БИПМ №24, 27.08.2003 г.), включающий определение у пациента с сахарным диабетом 2 типа наличия полиморфизма на участке сигнального пептида препро- NPY человека. Полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-ом положении на участке сигнального пептида препро- NPY человека и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза. Но, к сожалению, в данном исследовании не участвовали пациенты с СД 1 типа и гликемический контроль у всех исследуемых был разный. Что не позволяет судить об отсутствии влияния других внешних факторов на формирование ретинопатии.

Ближайшим аналогом является способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов (Заявка: 2011137055/15, 07.09.2011 G01N 33/50 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)), включающий выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипирование гена интерлейкина методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, отличающийся тем, что проводят генотипирование интерлейкина-6 и при выявлении аллеля *G полиморфного варианта -572 G/C гена интерлейкина-6 - IL-6 прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Заявителями не обнаружено аналогов по способам комплексного генетического прогнозирования степени тяжести ДНП у пациентов с СД2 типа. А именно нефропатия является одной из основных причин смерти пациентов с сахарным диабетом. Кроме того, в вышеуказанном ближайшем аналоге пациенты были с разным уровнем гликированного гемоглобина, соответственно с разной степенью компенсации углеводного обмена, что не позволяет достоверно судить о вкладе в прогнозирование ретинопатии только изучаемого полиморфизма. С практической точки зрения, пациенты должны быть максимально схожи между собой по возрасту, длительности диабета, степени компенсации гликемии и принимаемой (или не принимаемой) терапии. Это позволит в большей степени исключить влияние смежные факторов на развитие диабетических осложнений.

Задача: определение наиболее достоверных и информативных молекулярно-генетических и биохимических маркеров, на более ранних стадиях, приводящих к прогрессирующему течению ДНП у лиц с СД 2 типа.

Сущностью данного изобретения заключается в выделении гомозиготного генотипа по аллелю G полиморфизма I105V гена GSTP-1, превышение активности ферментов системы АОЗ и показателей процессов свободно-радикального окисления от референтных значений (показателей контрольной группы условно здоровых доноров: малоновый диальдегид - 6,4±0,5 мкмоль/л; супероксиддисмутаза - 75,0±3,07 ед./г Hb/мин; каталаза - 30,5±1,6 нмоль H2O2/мг Hb; глутатионтрансфераза - 28,1±1,33 мкмоль/мин/мг белка), при наличии этих изменений, определяют высокую степень риска развития ДНП у больного.

В связи с выделением мутантного гомозиготного генотипа по аллелю G полиморфизма I105V гена GSTP-1 и определением активности ферментов системы АОЗ и детоксикации (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатион-S-трансферазы) и уровня малонового диальдегида (МДА), как основного маркера процессов СРО и ПОЛ, а также биохимических маркеров, таких как уровень креатинина в сыворотке крови, расчетом скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и определением уровня белка в моче, может позволить на ранней стадии спрогнозировать риск развития быстропрогрессирующей нефропатии, своевременно осуществить мероприятия по коррекции данного состояния и предупредить раннее развитие таких тяжелых осложнений ДНП, как анемия, артериальная гипертензия, патология фосфорно-кальциевого обмена, дислипидемия, протеинурия и др.

Для доказательства решения задачи проведено выделение ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипирование генов ФБК методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. Выявление у пациента гомозиготного полиморфизма по аллелю 2 гена GSTP-1 (I105V) и, связанных с этим, отклонений показателей системы про- / антиоксиданты (ферменты АОЗ и МДА) определяют высокий риск прогрессирования ДНП до 3 степени тяжести

Для проведения лабораторных исследований используют образцы сыворотки крови, полученные при центрифугировании пробирок с цельной венозной кровью со скоростью 3 тыс.об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре. Наряду с общеклиническим обследованием у больных оценивают уровни глюкозы натощак и постпрандиальной гликемии, а также общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение гликированного гемоглобина. Оценку микроальбуминурии производят в разовой порции мочи после полной стабилизации гликемического профиля (в контрольном общем анализе мочи перед выпиской). С целью оценки оксидативного статуса перед выпиской пациента из стационара, после полной стабилизации гликемии производился забор крови для определения состояния системы про- /антиоксиданты (МДА - показатель процессов СРО и ПОЛ и ферменты АОЗ и ФБК - Каталаза, Супероксиддисмутаза, Глутатион-S-трансфераза).

Способ апробирован на двух группах пациентов: пациенты с СД 2 типа и пациенты без СД 2 типа. В основную группу были включены 70 пациентов с СД 2 типа в возрасте 45-70 лет, без тяжелых сопутствующих патологий, с длительностью сахарного диабета до 5 лет, уровнем гликированного гемоглобина не более 10%, и уровнем СКФ не менее 60 мл/мин/1.73 м2. Критерии исключения: СД 1-го типа/другие типы сахарного диабета; наличие тяжелых осложнений СД (протеинурия, почечная недостаточность, макрососудистые осложнения); наличие тяжелой сопутствующей соматической патологии; пациенты с первичным поражением почек (инфекционным, сосудистым, токсическим, иммуновоспалительным, опухолевым); возраст моложе 45 и старше 70 лет; уровень гликированного гемоглобина более 10%; длительность СД 2 типа более 5 лет и уровень СКФ менее 60 мл/мин/1.73 м2.

Контрольная группа была сформирована из 20 добровольцев, сопоставимых по возрасту, полу и этнической принадлежности, не являющихся родственниками пациентов основной группы и не имевших в анамнезе СД 2 типа, тяжелые поражения почек, тяжелую сопутствующую соматическую патологию.

Генотипирование при помощи ПЦР позволило в дальнейшем разделить пациентов основной и контрольной группы на подгруппы в зависимости от определяемого полиморфизма гена GSTP-1 (I105V): гомозиготы с нулевым (делеционным) генотипом (гомозиготы по аллелю 2 - 0/0 - G/G), гомозиготы с нормальным генотипом (гомозиготы по аллелю 1 - +/+ - А/А), гетерозиготы с генотипом +/0 - A/G по определенным генам и генным локусам.

Материалом для молекулярно-генетического исследования послужила цельная венозная кровь, которая забиралась однократно при включении пациента в исследование. Для выделения геномной ДНК применяли сорбентный метод с использованием набора реактивов «ДНК-экспресс кровь» («Литех», Россия), затем методом ПЦР SNP-экспресс- электрофорез на оборудовании «Терцик» производилось исследование полиморфизма GSTP1 полиморфизм I105V (A>G). Для всех полиморфизмов применяли соответствующие наборы реагентов («Литех», Россия). Регистрация FAM и HEX позволяла определить три варианта генотипа:

• гомозигота по основному аллелю (аллель 1)

• гетерозигота,

• гомозигота по минорному аллелю (аллель 2)

Было проведено сравнение различных вариантов полиморфизмов гена биотрансформации ксенобиотиков и системы АОЗ: GSTP1 полиморфизм I105V (A>G), с показателями СКФ, микроальбуминурии, потребностью в инсулине и показателями общего антиоксидантного статуса. Значимые отклонения в вышеуказанных показателях выявлены для гомозиготного полиморфизма по аллелю 2 гена GSTP-1 (I105V)

Исследование показателей системы про- /антиоксиданты проводилось по следующим методикам:

1) МДА: Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977

2) Супероксиддисмутаза (СОД): Сирота Т.В., 1999

3) Глутатион-S-трансфераза (Г-S-T): Карпищенко А.И., 1999.

4) Каталаза (КАТ): Королюк М.А. и соавт., 1988

За нормальные (референтные) значения активности ферментов системы АОЗ принимались показатели пациентов контрольной группы

Достоверность различий в распределении частот генотипов между группами больных и здоровых лиц оценили по тесту %2, по методу сопряженных таблиц (четырехпольная таблица). Числовые распределения показателей системы антиоксиданой защиты и перекисного окисления липидов проверялись на соответствие нормальному распределению с применением критерия Шапиро-Уилка. В ходе исследования числовые распределения показателей соответствовали нормальному закону. Количественные показатели в биохимических характеристиках пациентов (показатели активности ферментов ФБК и СРО) оценивались по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р менее 0,05. Расчеты выполнены с помощью программы STATISTICA 6.1 Stat-Soft Inc, США.

У пациентов с СД 2 типа (пациенты основной группы) процент выявленных гетерозиготных носителей (+/0 - A/G) гена GSTP-1 (I105V) - 16%, а гомозиготных по аллелю 1 (+/+ - А/А) - 76%, гомозиготных по аллелю 2 (0/0 - G/G) - 8%, в отличие от контрольной группы, в которой процент гетерозиготных носителей (+/0 - A/G) составил 65%, а гомозиготных носителей по аллелю 1 (+/+- А/А) - 35%, а носители гомозигот по аллелю 2 (0/0 - G/G) - не были выявлены. При рассмотрении результатов основной группы по компонентам ДНП значимых различий между гетерозиготными носителями (+/0 - A/G) и гомозиготными носителями по аллелю 1 (+/+- А/А) в уровне СКФ, микроальбуминурии выявлено не было. Так средний уровень СКФ в подгруппах гомозиготного и гетерозиготного полиморфизма изучаемого гена в основной группе составил- 64 мл/мин/1,73 м2, средний уровень микроальбуминурии - 0,18 г/л, суточная потребность в инсулине - 26 ед/сут. А вот показали пациентов - носителей мутантной гомозиготы по аллелю 2 (0/0 - G/G) были значительно хуже. Так уровень СКФ в этой подгруппе пациентов основной группы составил 48 мл/мин/1,73 м2, уровень альбуминурии в разовой порции мочи составил 0,9 г\л. Суточная потребность в инсулине - 17,6 Ед/сут.

Наиболее выраженные изменения показателей СРО и АОЗ основной группы (МДА и ферменты КАТ и СОД) были в группе гомозиготных носителей по аллелю 1. Однако это не коррелировало со снижением функции почек. Показатели активности ферментов АОЗ в подгруппе носителей мутантной гомозиготы (0/0 - G/G) были значительно выше, чем в аналогичной подгруппе контрольной группы, однако значимо не отличались от показателей подгрупп гетерозиготных (+/0 - A/G) и гомозиготных носителей по аллелю 1 (+/+ - А/А) контрольной группы. Уровень СРО - МДА в подгруппе носителей мутантной гетерозиготы (+/0 - A/G) был значительно выше (100,5 мкМоль/л), чем в других подгруппах основной группы пациентов.

В таблице приведены данные зависимости уровня показателей ферментов АОЗ и СРО от генотипа пациентов основной и контрольной группы. Все полученные результаты оказались статистическими значимыми.

Таким образом, было выявлено, что носители мутантной гомозиготы по аллелю 2 (0/0 - G/G) гена GSTP-1 (I105V) имеют более высокий показатель СРО, а также более высокий уровень ферментов АОЗ: каталазы, супероксиддисмутазы. Это также коррелирует с более тяжелым течением ДНП в данной подгруппе (уровень СКФ ниже, а уровень микроальбуминурии выше, чем у лиц с другими генотипами основной группы). Можно предположить, что это является одной из причин быстрой прогрессии поражения почек в данной когорте пациентов.

Пример: Пациент В. 1970 года рождения, страдает СД 2 типа в течение 8 лет. Получает ИТ (глулизин и гларгин 300) в средней суммарной суточной дозе 48 ед. В домашних условиях старался поддерживать гликемию в диапазоне от 8-13 ммоль/л. В связи с сильным эмоциональным стрессом в последние 2-3 недели измерял гликемию редко, пропускал инъекции инсулина, не считал хлебные единицы, колол инсулин «на глаз». Уровень гликемии на этом фоне повышался до 20-25 ммоль/л, появилась выраженная сухость во рту, жажда, тошнота и однократная рвота. Самостоятельно справиться с декомпенсацией сахарного диабета не мог. Госпитализирован в терапевтическое отделение Больницы Скорой медицинской помощи. Из анамнеза: СД 2 типа 8 лет. Хронические заболевания: Гипертоническая болезнь 2 ст., риск 4. Биохимический анализ крови: Калий крови - 3,3 (3,4-5,5 ммоль/л) Креатинин - 97 г/л, СКФ - 70 мл/мин/1,73 м². Общий анализ крови - без особенностей. Общий анализ мочи при поступлении - глюкоза +++, кетоновые тела +, белок - 1,6 г/л. Кислотно-щелочное состояние: рН - 7,13, sBE, с - (-4) ммоль/л. Гликированный гемоглобин - 8,9%. Была назначена инфузионная терапия, инсулинотерапия, терапия препаратами альфа-липоевой кислоты. К моменту выписки после стабилизации состояния и достижения нормогликемии повторно был проведен общий анализ мочи. Уровень белка в моче составил 0,6 г/л (600 мг/л) в разовой порции мочи. После стабилизации гликемии был произведен забор крови для оценки системы про-/антиоксиданты и ФБК. Уровень МДА - 103,9 мкмоль/л, КАТ - 51,1 нмоль H2O2/мг Hb, Г-S-T - 32,6 мкмоль/мин/мг, СОД - 82,1 ед./г Hb/мин. Что значительно превышает аналогичные показатели в контрольной группе.

Пациент осмотрен офтальмологом. Диагноз - препролиферативная ретинопатия.

Был сформулирован окончательный диагноз:

Сахарный диабет 2 типа, декомпенсация с компенсированным кетоацидозом при поступлении. Препролиферативная ретинопатия, Диабетическая нефропатия с незначительно сниженной СКФ (СКФ=70 мл/мин/1,73 м2). Диабетическая дистальная полинейропатия нижних конечностей, сенсорный тип. Целевой уровень гликированного гемоглобина - менее 7,0%. Сопутствующий: Гипертоническая болезнь 2 ст, риск 4

В процессе исследования гена GSTP-1 (I105V) был обнаружен гомозиготный полиморфизм по аллелю 2.

В связи с чем пациенту была предложена терапия агонистами глюкогоноподобного пептида - 1, либо ингибиторами натрий-глюкозного котранспортера 2 типа. Но из-за материальных соображений пациент от данной терапии решил отказаться. Также была назначена антиоксидантная терапия: Витамин Е 400 мг ежедневно 1-2 месяца курсами 2 раза в год, препараты альфа-липоевой кислоты 600 мг 1 раз в день 2-3 месяца курсами 2 раза в год. Ежегодное наблюдение эндокринолога с более тщательной оценкой функции почек. Наблюдение невролога, офтальмолога, кардиолога. А также - использование препаратов ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (иАПФ), либо антагонистов рецепторов ангиотензина II (АРА) с целью нефропротекции и с гипотензивной целью.

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, генетике, нефрологии, генной инженерии и биохимии, и может быть использовано для раннего прогнозирования риска развития диабетической нефропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Из лимфоцитов венозной крови выделяют ДНК. Генотипируют ген GSTP-1 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. При выявлении гомозиготного генотипа по аллелю G полиморфизма I105V гена GSTP-1 и превышения уровня малонового диальдегида, активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионтрансферазы определяют высокую степень риска развития диабетической нефропатии у больного. Способ обеспечивает возможность раннего прогнозирования риска развития диабетической нефропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа за счет определения достоверных и информативных молекулярно-генетических и биохимических маркеров. 1 табл., 1 пр.

Способ раннего прогнозирования риска развития диабетической нефропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, состоящий в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов венозной крови, генотипируют ген GSTP-1 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом, у больного выявляют гомозиготный генотип по аллелю G полиморфизма I105V гена GSTP-1 и превышение активности ферментов системы антиоксидантной защиты и показателей процессов свободно-радикального окисления от референсных значений - показателей контрольной группы условно здоровых доноров: малоновый диальдегид - 6,4±0,5 мкмоль/л; супероксиддисмутаза - 75,0±3,07 ед./г Hb/мин; каталаза - 30,5±1,6 нмоль H2O2/мг Hb; глутатионтрансфераза - 28,1±1,33 мкмоль/мин/мг, при наличии этих изменений определяют высокую степень риска развития диабетической нефропатии у больного.