СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ТИПА 2 У МУЖЧИН-ЯКУТОВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в офтальмологии, а также в эндокринологии, медицинской генетике, общественном здоровье и здравоохранении, медико-социальной экспертизе, генной инженерии, генотерапии для прогнозирования развития и профилактики диабетической ретинопатии (ДР) при сахарном диабете типа 2 (СД типа 2) у мужчин - якутов.

Известен способ прогнозирования возникновения и развития диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (Заявка 2003122404/15, G01N 33/68, БИПМ №6, 27.02.2005 г.), который позволяет прогнозировать возникновение и прогрессирование диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом при проведении иммунологического исследования сыворотки крови путем определения содержания интерлейкина - 1β при наличии его в концентрации 50 пкг/мл и выше. Возникновение диабетической ретинопатии при отсутствии клинических явных изменений на глазном дне прогнозируют при концентрации интерлейкина - 1β 700 пкг/мл и более.

Известен способ прогнозирования клинической манифестации диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа (Патент 2292549, G01N 33/487, БИПМ №3, 27.01.2007 г.), который позволяет исследовать индуцированную хемолюминесценцию слезной жидкости и световую чувствительность макулы с помощью фотостресс-теста. При значениях индуцированной хемолюминесценции слезной жидкости от 0,031-0,043 отн. ед. и показателях световой чувствительности макулы от 56 до 75 секунд прогнозируют высокий риск клинической манифестации диабетической ретинопатии на ранней стадии.

Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (Заявка 2005112169/15 G01N 33/48, БИПМ №30, 27.10.2006 г.), который включает определение нитритов в крови, а в слезной жидкости - холестерин, СОД и каталазу, по этим показателям составляют карту, по которой определяют стадии развития ДР.

Известен способ диагностики диабетической ретинопатии (Патент 2071059, G01N 33/68, БИ №36, 27.12.1996 г.), который позволяет диагностировать диабетическую ретинопатию при определении в сыворотке крови повышенного уровня тироксинсвязывающего гормона в 1,5 и более раз.

Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (Патент 2124727, G01N 33/53, A61F 9/00, БИ №1, 10.01.1999 г.), который обеспечивает возможность прогнозирования перехода непролиферативной стадии диабетической ретинопатии в пролиферативную путем иммунологического исследования слезной жидкости и определения концентрации иммуноглобулина А при его значениях не менее 0,20 г/л.

Однако все перечисленные выше способы не позволяют в полном объеме определять специфические и генетические признаки диабетической ретинопатии непосредственно у больных сахарным диабетом типа 2, в частности, в зависимости от этнической принадлежности обследуемых пациентов, а именно у якутов.

Известен способ диагностики риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (Заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, БИПМ №24, 27.08.2003 г.), включающий определение у диабетика наличия полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека. Полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-ом положении на участке сигнального пептида препро-NPY человека и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза.

Данный способ диагностики разработан на основе изучения генетической предрасположенности к ДР при сахарном диабете независимо от его типа в гетерогенной популяционной среде и поэтому не приемлем для медико-генетического консультирования по ДР при СД типа 2 в других регионах, в частности в Республике Саха (Якутия). Это обусловлено тем, что генетическая предрасположенность к ДР при СД типа 2, как и к другим многофакторным заболеваниям, формируется в зависимости от особенностей популяционно-генетической структуры этноса, к которому относится этническая группа якутов.

Задача предлагаемого способа - прогнозирование риска развития ДР при СД типа 2 у якутов.

Поставленную задачу достигают за счет того, что амплификацию специфичности гена фактора некроза опухоли-альфа - TNF-α определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *Т/*Т полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа - TNF-α прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Способ осуществляют следующим образом

Кровь для выделения ДНК собирают из локтевой вены пациента в специальный вакутейнер с консервантом EDTA. Собранную кровь замораживают в специальном контейнере при температуре - 20°C и ниже.

ДНК экстрагируют из лейкоцитов с помощью системы очистки (Promega, Madison, WI).

В работе использовали полиморфный маркер гена фактора некроза опухоли-альфа, участвующий в воспалительных процессах: TNF-α (вариант - 1031 Т/С).

Гаплотип rs 1799964 гена TNF-α анализирован с помощью аллельной дифференциации Tagman универсальной средой ПЦР (no AmpErase UNG). Все реакции проводились на системе ABI7300 с использованием программы SDS 1.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Фрагменты ПЦР денатурировали при температуре 95°C в течение 5 минут с последующей ренатурацией понижением температуры до 25°C на протяжении 45 минут. Идентификация аллелей выполнена с использованием системы Wave Nuclear Acid Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, NE). Результаты соответствовали прямым данным секвенирования.

Статистическая обработка материалов. Статистический анализ данных проведен с использованием пакета Statistica 8.0 и SAS 7.0. При сравнении качественных данных использован критерий Пирсона χ² и точный критерий Фишера. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5%. Относительный риск заболевания по каждому аллелю вычисляли как соотношение шансов (odds ratio - OR) с расчетом доверительных интервалов (OR'). При OR=1 ассоциации нет, OR>1 - положительная ассоциация заболевания с аллелем и генотипом и OR<1 - отрицательная ассоциация.

Офтальмологическое обследование пациентов включало стандартные методы определения визометрии, офтальмотонуса, биомикроскопии, офтальмоскопии с применением универсальной линзы Гольдмана в условиях медикаментозного мидриаза при отсутствии противопоказаний.

Учитывая особые этические моменты, связанные с охраной права личности, осмотры и забор биологического материала проводились с заполнением специальных медицинских карт при добровольном согласии на участие в клиническом исследовании взрослого пациента или родителя несовершеннолетнего больного. Форма указанной медицинской карты одобрена Комитетом по этике при Якутском научном центре СО РАН РФ (Протокол №5 от 21.06.2006 г.).

Нами обследованы коренные жители, принадлежащие к этнической группе якутов, проживающие в 5 районах (Амгинский, Усть-Алданский, Таттинский, Чурапчинский, Мегино-Кангаласский) Республики Саха (Якутия).

В ходе работы исследованы 238 образцов ДНК этнических якутов обеих гендерных групп. Группу исследования составили 78 больных ДР (Классификация E.Kohner, M.Porta, 1990) при СД типа 2, в возрасте свыше 40 лет. Контрольная группа состояла из 160 добровольных доноров той же этнической группы, без клинических и лабораторных признаков сахарного диабета, не родственных между собой и не имеющих отягощенный семейный анамнез по сахарному диабету. Сравнительная клинико-социальная характеристика исследуемых пациентов в обеих группах представлена в таблице 1.

Таблица 1 Сравнительная социально-клиническая характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов Характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов Группа больных ДР при СД 2 типа Контрольная группа 1 2 3 Возраст 54.7±10.9 57.0±14.7 Пол (М/Ж в %) 31.5/68.5 42.6/57.4 Индекс массы тела 27.5±3.76 25.2±2.87 Гликемия (ммоль/л) 11.7±4.81 4.8±0.75 Артериальное давление (систолическое) (ммHg) 151±24 140±14 Артериальное давление (диастолическое) (ммHg) 92±11 88±8

Из таблицы 1 видно, что пациенты обеих групп не имели особых статистических различий по полу и возрасту. Основной составляющей обеих групп были женщины в возрасте старше 50 лет. Среди пациентов исследуемой группы отмечается повышенный индекс массы тела, уровня гликемии и артериального давления.

В результате офтальмологического исследования пациентов установлено, что длительность развития ДР варьировала в диапазоне от 1 года до 20 лет. ДР развилась в 62.8% случаев после установления СД типа 2 в течение первых 5 лет. Впервые выявленная ДР, преимущественно 1 и 2 стадии, установлена нами при сроке СД типа 2 на момент исследования и продолжительности основного заболевания до 1 года в 30% случаев.

Данный факт подтверждает тяжесть диабетических микроангиопатий органа зрения, обусловливающих раннюю слепоту и слабовидение пациентов в первые годы заболевания.

В результате молекулярно-генетического исследования отмечено, что эмпирическое распределение частот генотипов полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа в популяции якутов соответствует теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга (χ²=0.007, Р=0.999).

В общей популяции якутов, среди женщин с ДР и здоровых лиц достоверные статистические различия по полиморфному варианту - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа не выявлены.

Оценка распределения частот генотипов и аллелей полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа обнаружила статистически значимые различия между мужчинами больными ДР и мужчинами контрольной группы (табл.2).

Из табл.2 видно, что с наибольшей частотой в группе мужчин больных ДР, чем у мужчин в контрольной группе встречаются генотип *Т/*Т (72.41% против 43.59%, Р=0.026) и аллель *Т (81.03% против 65.38%, Р=0.054). Относительный риск (OR) генотипа *T/*T составил 3.4 (CI_OR=1.21-9.54) и аллеля *T - 2.26 (CI_OR=1.01-5.06). Частоты других генотипов и аллелей достоверно не различаются.

Таблица 2 Анализ ассоциаций полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) с диабетической ретинопатией у мужчин-якутов Полиморфизм Генотипы/аллели Контроль Больные ДР Р OR CI_OR P_i±S_p (%) CI P_i±S_p (%) CI -1031 Т/С *T/*T 43.59±7.94 27.81-60.38 72.41±8.3 52.76-87.27 0.026 3.4 1.21-9.54 *T/*C 43.59±7.94 27.81-60.38 17.24±7.01 5.85-35.77 0.419 - - *C/*C 12.82±5.35 4.3-27.43 10.34±5.65 2.19-27.35 0.947 - - *T 65.38±5.39 53.76-75.8 81.03±5.15 68.59-90.13 0.054 2.26 1.01-5.06 *C 34.62±5.39 24.2-46.24 18.97±5.15 9.87-31.41 0.44 0.2-0.8 Примечание к таблице 2: n - количество наблюдений, p_i - частота генотипа (аллеля); s_p - ошибка р₁; Р - вероятность; OR (odds ratio) - показатель соотношения шансов; CI (confidence interval) - 95% доверительный интервал.

Предлагаемый способ позволяет при выявлении генотипа *T/*T и аллеля *Т полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) у мужчин-якутов прогнозировать риск развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2.

Выявленные генотип *T/*T и аллель *Т полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) являются маркерами повышенного риска диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 для мужчин данного этноса. Полученные результаты будут способствовать своевременному прогнозированию и/или выявлению группы риска по диабетической ретинопатии среди мужчин-якутов и помогут определить тактику ведения пациента с предрасположенностью к диабетической ретинопатии с использованием индивидуального комплекса профилактических и лечебных мероприятий.

Таким образом, полученные данные указывают на несомненную связь между полиморфным вариантом - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) и генетической предрасположенностью к диабетической ретинопатии у мужчин-якутов, что дает возможность прогнозировать риск возникновения диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 и проводить превентивную терапию.

Предложенный способ современен и позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать развитие ДР у мужчин-якутов с СД типа 2.

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у мужчин-якутов, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, отличающийся тем, что амплификацию специфичности гена фактора некроза опухоли-альфа - TNF-α определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *Т/*Т полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа - TNF-α прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии. Способ обеспечивает выявление группы риска по диабетической ретинопатии при сахарном диабете 2 типа у мужчин-якутов для дальнейшего определения тактики профилактических и лечебных мероприятий. 2 табл., 1 пр.

Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у мужчин-якутов, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, отличающийся тем, что амплификацию специфичности гена фактора некроза опухоли-альфа - TNF-α определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *Т/*Т полиморфного варианта - 1031 Т/С гена фактора некроза опухоли-альфа - TNF-α прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.