СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ И АКТИВАЦИИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению стабильных ферментов, а именно гидролитических.

Известен способ стабилизации и активации гидролитических ферментов ионами кальция, а также органическим агентом, в качестве которого используют N-защищенную аминокислоту, в частности N-бензилоксикарбониламинокислоту молярной концентрации, превышающей более чем в 30 раз молярную концентрацию фермента (RU 2167937, C 12 N 9/96).

Недостатком известного способа является то, что для стабилизации фермента используют одновременно два стабилизатора - ионы кальция и вышеуказанную аминокислоту.

Известен способ стабилизации и активации гидролитических ферментов, в частности амилолитических, предусматривающий введение в раствор, содержащий фермент, стабилизатора, в качестве которого используют водорастворимую кальциевую соль и органический агент - алифатический гликоль, имеющий формулу HO-CHCHO или пропандиол, а в некоторых случаях неионогенное моющее вещество (US 3819528, С 11 D, 1974).

Недостатком известного способа является недостаточная эффективность стабилизации и активации фермента.

Наиболее близким техническим решением является способ стабилизации и активации ферментов, в частности РНКазы и химотрипсина с помощью С₇-алкилоксибензола.

Способ осуществляют путем внесения в раствор фермента, предварительно растворенного в этаноле С₇-алкилоксибензола в концентрации 0,03-0,1, и последующего инкубирования полученной смеси в течение 10-60 мин (“Микробиология”, 2000, том 69, №2, 224-230).

Задачей предложенного технического решения является повышение стабилизации и активации ферментов, а также расширение ассортимента стабилизаторов и активаторов ферментов.

Поставленная задача решается за счет того, что разработан способ стабилизации и активации гидролитических ферментов 5-метилрезорцином, при этом 5-метилрезорцин используют в виде водного раствора с концентрацией 0,05-1,0 мг/мл, при использовании в качестве гидролитического фермента Амилосубтилина раствор 5-метилрезорцина используют в концентрации 0,5-1,0 мг/мл, а при использовании в качестве гидролитического фермента Ксиланазы раствор 5-метилрезорцина используют в концентрации 0,05-0,2 мг/мл.

Пример 1

Исследование влияния 5-метилрезорцина на активность Ксиланазы ГЗх с активностью 8000 ед./г. Для этого готовят серию растворов 5-метилрезорцина с концентрацией 0,05-1,0 мг/мл. Готовят раствор фермента Ксиланазы ГЗх с концентрацией 0,2 мг/мл. В раствор фермента вносят раствор 5-метилрезорцина в соотношении, указанном в таблице 1. Смесь выдерживают при температуре 50°С в течение 10 минут, после чего определяют активность Ксиланазы ГЗх по ТУ 9291-035-34588571-2001.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Проведены исследования по влиянию 5-метилрезорцина на термо- и рН стабильность Ксиланазы ГЗх.

Полученные результаты представлены в таблицах 2 и 3.

Из полученных данных видно, что внесение в раствор фермента 5-метилрезорцина способствует повышению активности фермента на 38-51% при оптимальном значении температуры действия фермента, а при рН 6,0 активность фермента увеличилась на 72% по сравнению с контролем.

Пример 2

Готовят раствор фермента Амилосубтилина ГЗх (производства ОАО “Восток”) и серию растворов 5-метилрезорцина в концентрации, указанной в таблице 4.

Проведены исследования по влиянию 5-метилрезорцина на термо- и рН стабильность фермента амилосубтилина ГЗх, а также на сохранение его активности в процессе хранения.

Полученные результаты представлены в таблицах 5, 6, 7.

Из результатов, приведенных в таблицах 5 и 6, видно, что при обработке Амилосубтилина ГЗх 5-метилрезорцином происходит стабилизация фермента и увеличение его ферментативной активности. Так, активность фермента при 40°С возрастает на 70%, а при рН 6,0 на 82,5%.

Активность Амилосубтилина ГЗх без обработки стабилизатором составила через сутки 77%, на вторые и третьи сутки снизилась до 45%, в то время, как активность фермента, обработанного стабилизатором, увеличилась на 40%.

Изобретение относится к биотехнологии. Данным способом стабилизируют ферменты амилосубтилин и ксиланазу. В качестве стабилизатора используют 5-метилрезорцин в виде водного раствора с концентрацией 0,05-1,0 мг/мл. Применение 5-метилрезорцина способствует повышению активности фермента на 38-51% при оптимальном значении температуры действия фермента. 2 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Способ стабилизации и активации амилосубтилина или ксиланазы, включающий внесение в качестве стабилизатора водного раствора 5-метилрезорцина в концентрации 0,05-1,0 мг/мл и инкубирование полученной смеси в течение 10 мин при температуре 50°С.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при стабилизации и активации амилосубтилина 5-метилрезорцин предпочтительно вносится в концентрации 0,5-1,0 мг/мл.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при стабилизации и активации ксиланазы 5-метилрезорцин предпочтительно вносится в концентрации 0,05-0,2 мг/мл.