КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗЫ ПРИ ЕГО ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ МЕТОДОМ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА TRICHODERMA VIRIDE 44-11-62/3 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗЫ В ЭТОЙ СРЕДЕ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/14 C12N9/42 C12N9/42 C12R1/885 

Изобретение относится к области биотехнологии, а точнее к ее начальной стадии - биосинтезу ферментов, которые продуцируются в культуральную жидкость в процессе глубинного культивирования низших грибов на искусственных средах.

К таким ферментным препаратам относится целлюлоза, продуцирующаяся в культуральную жидкость в процессе глубинного культивирования низшего гриба Trichoderma viride. Из этого фермента в дальнейшем получают технический ферментный препарат целловиридин ГЗх - ТУ 11249895-13-13-92. Он применяется в комбикормовой промышленности в качестве энзимной добавки при получении кормов из трудноусвояемого животными и птицей зерна (рожь, ячмень, овес и т.п. ).

Начальной стадией получения целловиридина ГЗх является глубинное культивирование низшего гриба Trichoderma viride в ферментационных аппаратах. Далее, полученную культуральную жидкость передают по трубопроводам на распылительную сушилку типа СРЦ-100, где после ее высушивания получают целевой продукт.

Успех получения товарного продукта во многом зависит от состава питательной среды, на которой культивируется Trichoderma viride, и условий ферментации. Способы глубинного культивирования грибных продуцентов Trichoderma и состав питательных сред достаточно хорошо изучены на лабораторном уровне. Например, в работе В.А. Величко, Т.В. Полянской и др. "Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов". Авторское свидетельство СССР N 3486197/28-13, кл. C 12 N 9/42, C 12 N 1/22 опубликовано 30.01.84. Авторы используют для культивирования Trichoderma viride Trichoderma long. , Egectridum candidium и др. питательную среду следующего состава, %:
Свекловичный жом - 3
Нитрат аммония - 0,2
Дигидрофосфат калия - 0,2
Солодовые ростки - 0,5
Пшеничные отруби - 0,2
Водородный показатель среды устанавливают 4,5 pH. Предварительно смесь целлюлозосодержащего сырья и органического источника азота - свекловичный жом, солодовые ростки и пшеничные отруби обрабатывают целловиридином ГЗх или целлоконигином ПХ в количестве 0,2-2,0 и 0,1-1,0 мас.% при температуре 40-55^oC в течение часа, гидромодуле 1,5-1:10. Выход целлюлазы после культивирования семи суток на 10-литровом ферментере - 12,2 ед/мл.

В работе В.П. Саловаровой, Ю.П. Грачева и М.С. Ваганова "Влияние состава питательной среды на биосинтез целлюлолитических ферментов при глубинном культивировании гриба Trichoderma long. 7-26" - Прикладная биохимия и микробиология, 1978, т. 14, вып.2, с. 172-176 методами математического моделирования, подтвержденными экспериментальными данными, авторы показали, что наиболее оптимальной средой для глубинного культивирования грибной культуры Trichoderma является среда следующего состава, %:
Свекловичный жом - 4,6
Нитрат аммония - 0,7
Дигидрофосфат калия - 0,3
Солодовые ростки и пшеничные отруби 1:1 - 0,75
Удельная ферментативная активность целлюлазы при культивировании на 750 мл колбах для Trichoderma long/ 7-26 составляет 16,3 ед/мл. Ферментацию проводят семь суток в непрерывном режиме при температуре (30 ± 1)^oC. В конце ферментации водородный показатель культуральной жидкости закисляется.

В работе "Способ получения целлюлолитических ферментов", Н.Т.Шинкаренко, Н. А.Острякова и др., авторское свидетельство СССР N 3449898/28-13, кл. C 12 N 9/42, опубликованное 15.02.84, в питательную среду для культивирования Trichoderma viride 44, которая аналогична в приведенной выше работе, вносят 0,02-0,04% сульфата хрома.

При культивировании гриба в непрерывном режиме в течение 108 ч на 60-литровых ферментерах получали выход фермента с активностью 15,5 ед/мл.

Как видно из данных работ, необходимым условием культивирования Trichoderma viride является наличие в питательной среде свекловичного жома как источника углерода.

Известна работа "Способ получения целлюлаз" Е.С. Морозов, Л.И. Сажина и др. , авторское свидетельство СССР N 4271847/31-13, кл. C 12 N 9/42//(C 12 N 9/42, C 12 R 1:885), опубликованное 07.07.89, где описано культивирование Trichoderma viride штамма F-120 и F-79 на 9 м³ ферментерах. При этом свекловичный жом авторы заменяли на целлолигнин (при соотношении целлюлозы и лигнина 1: 1). Его получали глубоким гидролизом ферментными препаратами целлобранином, целлокандином, целловиридином из расчета 20 ед/г сырья в течение 48-72 ч при температуре 45-50^oC с последующим отмыванием образующихся сахаров до концентрации не менее 0,002%. При этом получали выход целлюлазы 22,6 ед/мл.

Недостатками данного способа являются длительность и сложность процедуры приготовления питательной среды.

В работе "Штамм гриба Trichoderma viride ВКПМ F-374 - продуцент внеклеточной целлюлазы и ксиланазы", Н.А.Острикова, С.А.Коновалов и др., авторское свидетельство СССР N 4405929/30-13, кл. C 12 N 9/42, опубликованное 30.11.89, описан штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 и представлены условия его культивирования на 10-литровых ферментерах на питательной среде следующего состава, %:
Свекловичный жом - 3,0
Нитрат аммония - 0,4
Дигидрофосфат калия - 0,2
Сульфат аммония - 0,4
Сульфат магния - 0,03
Солодовые ростки - 1,43
Картофельная барда - 5,0
Водородный показатель среды 5,5 pH. Культивирование проводят в непрерывном режиме семь суток. Выход по целлюлазе 35 ед/мл.

Получение целлюлазы на 63 м³ ферментерах описано в регламенте на целловиридин ГЗх "ОПР 015800805-66-96 на производство препарата целловиридин ГЗх, ОАО "Биотехнология", 1996". Источником биосинтеза целлюлазы здесь является низший гриб Trichoderma viride 44-11-62/3. Рекомендуемая регламентная среда для культивирования, %:
Свекловичный жом - 2,9
Солодовые ростки - 1,4
Лактоза - 0,3
Белотин - 0,2
Сульфат аммония - 0,7
Дигидрофосфат калия - 1,0
Сульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,9
Водородный показатель среды 5,5 pH. Культивирование проводят в непрерывном режиме семь суток. Удельная активность фермента в культуральной жидкости до 30 ед/мл. Объем культуральной жидкости 32 м³ при коэффициенте загрузки 0,6.

Данный метод получения грибной культуры Trichoderma viride мы принимаем за прототип, поскольку он наиболее близок к заявляемому способу.

Недостатком данного способа для получения целловиридина в промышленных условиях на ферментаторах объемом 63 м³ является то, что в качестве источника углерода в питательной среде применяют свекловичный жом. Он даже после дробления имеет пористую структуру, разбухает в воде и всплывает, что приводит к образованию обильной пены. Это является причиной образования заторов в технологических трубопроводах. Для устранения затора технологическую операцию необходимо прерывать. Кроме этого, подобное обстоятельство отрицательно сказывается на работе технологического оборудования. Все это ведет к значительным механическим потерям как питательной среды, так и культуральной жидкости и, следовательно, к низкому выходу конечного продукта. Снижение выхода обуславливается главным образом низкой технологичностью питательной среды, связанной с негомогенностью ее состава из-за использования свекловичного жома в качестве источника углерода. И наконец, удельная активность целлюлазы при воспроизведении регламентных режимов на предложенной питательной среде не превышает 23 ед/мл, что также ведет к уменьшению выхода при производстве целловиридина ГЗх.

Целью изобретения является увеличение выхода процесса получения ферментного препарата целловиридина при его промышленном производстве на 63 м³ ферментерах путем применения более технологичной питательной среды, в которой углеводные компоненты не образуют заторов или пены. Хорошо подвергаются термической стерилизации на установке непрерывной стерилизации - УНС-20. Это исключит причины механических потерь. Поставленная цель достигается тем, что предлагается способ получения целлюлазы с ферментационной средой, где в качестве источника углерода вместо свекловичного жома используют крахмал кукурузный и отруби пшеничные, гидролизованные до доступных сахаров ферментными препаратами глюкаваморином ГЗх и амилосубтилином ГЗх, что придает ей новое качество - гомогенность. При этом продуктивность процесса биосинтеза целлюлазы должна быть не ниже 20-25 ед/мл. Эта цель достигается тем, что предлагается способ получения целлюлазы с ферментационной средой, где в качестве источника углерода вместо свекловичного жома используют крахмал кукурузный и отруби пшеничные, гидролизованные до доступных сахаров ферментными препаратами глюкаваморином ГЗх и амилосубтилином ГЗх. При этом процесс ферментации проводят при дискретном внесении активирующей добавки - раствора лактозы в течение всего биосинтеза целлюлазы в культуральной жидкости до 27 ед/мл. Это на 15% выше регламентной характеристики.

Сущность изобретения заключается в оптимальном соотношении компонентов питательной среды и дозировке раствора лактозы в процессе ферментации. Предлагается питательная среда для получения фермента целлюлазы, содержащая дигидрофосфат калия, сульфат магния, целлюлозу, лактозу и воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит хлорид кальция, гидрофосфат аммония, дрожжи кормовые и ферментативные гидролизаты пшеничных отрубей и кукурузного крахмала при следующем соотношении компонентов, %:
Ферментативный гидролизат крахмала кукурузного - 1,5
Ферментативный гидролизат отрубей пшеничных - 3,0
Хлорид кальция - 0,05
Гидрофосфат аммония - 0,6
Дигидрофосфат калия - 0,3
Дрожжи кормовые - 0,15
Сульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,5
Лактоза - 0,5
Вода водопроводная - Остальное
Из расчета на 1 кг крахмала добавляют 3000 ед. активности амилазы и 6000 ед. активности глюкоамилазы. На 1 г целлюлозы добавляют 12 ед. активности целлюлазы (отдельно готовят подпитку - раствор лактозы из расчета 0,5% на весь процесс ферментации). Раствор лактозы вносят дискретными порциями. Эта питательная среда гомогенна по своему составу и обладает высокой технологичностью при производстве целлюлазы на промышленных ферменторах. Практически не образует заторов, что значительно снижает механические потери. Дискретная дозировка раствора лактозы позволяет достичь нужной продуктивности процесса биосинтеза целлюлазы, а именно 27 ед/мл, что выше продуктивности среды со свекловичным жомом. Это приводит к увеличению выхода при промышленном производстве целловиридина ГЗх на 24%. Технологический процесс при этом становится более предсказуемым и воспроизводимым.

В качестве примеров рассмотрим процессы культивирования низшего гриба Trichoderma viride 44-11- 62/3.

Пример 1 (по прототипу)
Питательную среду на 63 м³ ферментер приготовляют, исходя из следующего состава, %:
Свекловичный жом - 2,9
Солодовые ростки - 1,4
Лактоза - 0,3
Белотин - 0,2
Сульфат аммония - 0,7
Дигидрофосфат калия - 1,0
Cульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,9
Водородный показатель среды 5,5 pH.

Отдельно готовят углеводные компоненты: свекловичный жом, солодовые ростки, целлюлозу, белотин и отдельно солевые компоненты: сульфат аммония, лактозу, дигидрофосфат калия, сульфат магния. Затем их стерилизуют острым паром в установке непрерывной стерилизации при температуре 124-130^oC поочередно, подавая в смеситель. Из смесителя по технологическим линиям готовую среду подают в ферментер. Куда затем вносят посевной материал низшего гриба Trichoderma viride 44-11-62/3. Культивирование проводят семь суток при температуре (30±1)^oC. Стерильный воздух подают, исходя из расчета 0,3 объема/ч на 1 объем культуральной жидкости первые 12 ч роста культуры, 1 объем/ч на 1 объем культуральной жидкости с 12 до 72 ч, с 72 ч 0,5 объема/ч на 1 объем культуральной жидкости. Избыточное давление 0,05 МПа. Скорость вращения мешалки 177 об/мин. Культивирование проводят без внесения подпиток в процессе ферментации. На 5-7 сутки среда закислилась до значения водородного показателя 3 ед.pH.

Полученную культуральную жидкость, обладающую целлюлазной активностью, по технологическим трубопроводам передавали на распылительную сушилку СРЦ-100.

Расчетный коэффициент загрузки ферментера 0,6. Получено 30 м³ культуральной жидкости с удельной ферментативной активностью по целлюлазе 23 ед/мл. После сушки получено 360 кг целловиридина ГЗх с ферментативной активностью 330 ед/г. Выход процесса составил 17,2%.

Пример 2 (по заявляемому методу)
Питательную среду готовят, исходя из следующего состава, %:
Ферментативный гидролизат крахмала кукурузного - 1,5
Ферментативный гидролизат отрубей пшеничных - 3,0
Хлорид кальция - 0,05
Гидрофосфат аммония - 0,6
Дигидрофосфат калия - 0,3
Дрожжи кормовые - 0,15
Сульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,5
Лактоза - 0,5
Вода водопроводная - Остальное
Из расчета на 1 кг крахмала добавляют 3000 ед. активности амилазы и 6000 ед. активности глюкоамилазы. На 1 г целлюлозы добавляют 12 ед. активности целлюлазы. Отдельно готовят подпитку - раствор лактозы из расчета 0,5% на весь процесс ферментации.

Углеводные компоненты питательной среды готовят следующим образом. В емкость с горячей водой (40-45^oC) вносят требуемое количество крахмала кукурузного, отрубей пшеничных, хлорида кальция и доводят водородный показатель до значения 6,0- 6,5 pH раствором щелочи. Загружают расчетное количество амилазы и проводят разжижение крахмала 3 ч. Далее раствор охлаждают, доводят значение водородного показателя до 4,5-4,7 pH раствором фосфорной кислоты и вводят расчетное количество глюкоамилазы. Гидролиз проводят 1 ч.

В другой емкости готовят солевые компоненты. В горячую воду (40-45^oC) вносят расчетное количество целлюлозы, перемешивают, доводят значение водородного показателя до 4,5-4,7 pH раствором фосфорной кислоты, загружают целлюлазу и при этой температуре проводят гидролиз 2 ч. Затем вносят остальные солевые компоненты.

В смесителе солевые и углеводные компоненты смешивают и передают на установку непрерывной стерилизации, где проводят стерилизацию острым паром с температурой 124-130^oC.

Параметры культивирования аналогичны примеру 1. Но в процессе ферментации через определенное время вводят дискретные порции раствора лактозы, исходя из изменения углеводного состава культуральной жидкости.

Полученную культуральную жидкость, обладающую целлюлазной активностью, по технологическим трубопроводам передают на распылительную сушилку СРЦ-100. Расчетный коэффициент загрузки ферментера 0,6. Получено 37 м культуральной жидкости с удельной ферментативной активностью по целлюлазе 27 ед/мл. После сушки получено 920 кг целловиридина ГЗх с ферментативной активностью 935 ед/г. Выход процесса составил 41,3%.

Таким образом, в результате использования предложенного способа выход процесса получения технического целловиридина ГЗх увеличивается на 24,1%.

Изобретение относится к биотехнологии, к биосинтезу целлюлазы. Способ предусматривает глубинное культивирование гриба Trichoderma viride 44-11-62/3 в среде, содержащей в качестве источника углерода гидролизаты крахмала кукурузного и отрубей пшеничных. Процесс ферментации проводят при дискретном внесении активирующей добавки - раствора лактозы до 0,5%. Использование гомогенной питательной среды позволяет исключить механические потери в производстве. Способ обеспечивает достижение более высокой активности целлюлазы в культуральной жидкости 27 ед/мл, увеличение выхода процесса производства ферментного препарата целловиридина на 24%. 2 с.п. ф-лы.

1. Питательная среда для получения фермента целлюлазы при его промышленном производстве методом глубинного культивирования низшего гриба Trichoderma viride 44-11-62/3, содержащая дигидрофосфат калия, сульфат магния, целлюлозу, лактозу и воду водопроводную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит хлорид кальция, гидрофосфат аммония, дрожжи кормовые и ферментативные гидролизаты пшеничных отрубей и кукурузного крахмала при следующем соотношении компонентов, %:
Ферментативный гидролизат кукурузного крахмала - 1,5
Ферментативный гидролизат пшеничных отрубей - 3,0
Хлорид кальция - 0,05
Гидрофосфат аммония - 0,6
Дигидрофосфат калия - 0,3
Дрожжи кормовые - 0,15
Сульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,5
Лактоза - 0,5
Вода водопроводная - Остальное
2. Способ получения фермента целлюлазы, включающий глубинное культивирование низшего гриба Trichoderma viride 44-11-62/3 на питательной среде и высушивание культуральной жидкости, отличающийся тем, что глубинное культивирование ведут на питательной среде по п.1, при этом лактозу вносят в виде раствора дискретными порциями в течение всего процесса культивирования.