СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ Советский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N1/14 C12N9/14 C12R1/665 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения кислой фосфатазы, применяемой в сыроделии и медицине (для обработки ран).

Цель изобретения повышение активности и выхода целевого продукта.

Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента фермента используют штамм Aspergillus foetidus F-164, который выращивают в ферментационной питательной среде следующего состава, мас. Кукурузный крахмал 4-10 Пшеничные отруби 0,05-0,125 Амилосубтилин ГЗх(600 ед/г, ГОСТ 23635-79) 0,02-0,05 (NH₄)₂SO₄ 0,4-1,0 MgSO₄ 0,025-0,0625 КСl 0,025-0,0625 MnCl₂ 0,005-0,0125 Вода Остальное
В качестве источника углеводов используют кукурузный крахмал, который содержит фосфора почти в 4 раза меньше, чем картофельный, поэтому добавка на его фоне индукторов способствует созданию оптимальных для биосинтеза фермента условий.

В лимитированную по фосфору питательную среду вводят пшеничные отруби, являющиеся индуктором фермента, которые содержат и индуцируют биосинтез кислой фосфатазы.

Амилосубтилин ГЗх (600 ед/г ГОСТ 23635-79) как осахаривающий агент для гидролиза кукурузного крахмала применяется в концентрации 0,02-0,05% Обычно обработку (осахаривание) крахмала производят в соответствии с регламентом, при этом добавляют 0,26% амилосубтилина ГЗх, который содержит значительные количества (0,28 мг) фосфора, не учитываемого при экспериментах и нарушающего баланс фосфора в питательной среде. Между тем шт. Asp. foetidus F-164 не нуждается в полном осахаривании крахмала до моно- и дисахаридов. Достаточно разжижения и гидролиза до декстрин, тем более, что глюкоза ингибирует рост продуцента и биосинтез фермента. Поэтому количество амилосубтилина ГЗх сокращено до 0,02-0,05% что также приводит к экономии дорогостоящего сырья.

Добавление в питательную среду MnCl₂ в количестве 0,005-0,0125% способствует биосинтезу фермента.

Культивирование Asp. foetidus F-164 проводят при дробном температурном режиме:
засев среды при 40-45^оС;
культивирование в течение 16-20 ч при 35-40^оС;
с 20 ч и до конца ферментации температура культивирования 28-30^оС.

Asp. foetidus F-164 является факультативным термофилом и повышение температуры засева, а также начальной стадии культивирования благоприятно сказывается на накопление биомассы на этой стадии и уменьшает вероятность инфицирования культуры посторонней микрофлорой, растущей, как правило, при 28-37^оС. В процессе культивирования Asp. foetidus F-164 происходит закисление культуральной жидкости до рН 2,1-2,2, на этой стадии развитие инфекции маловероятно и, так как биосинтез фермента идет при 28-32^оС, ее поддерживают на этом уровне до конца ферментации.

В процессе культивирования используют дробную аэрацию:
с момента засева и до 24 ч роста 1 об. воздуха/1 об. культуральной жидкости в 1 мин;
следующие 12 ч (с 24 до 36 ч роста) 1,5 об.воздуха/1 об. культуральной жидкости в 1 мин;
после 36 ч роста и до конца ферментации подача воздуха в режиме 1 об. воздуха/1 об. культуральной жидкости в 1 мин.

Дробная аэрация обусловлена тем, что при набухании и прорастании конидий процессы дыхания идут неинтенсивно. При нарастании биомассы необходимо повышение аэрации, а в стадии активного биосинтеза фермента уровень аэрации снижается до первоначального.

Последующая обработка культуральной жидкости заключается в фильтрации, стерильной фильтрации, ультраконцентрировании, сушке распылением, с добавлением перед сушкой в ультраконцентрат 0,8-1,2% сернокислого магния для стабилизации фермента кислой фосфатазы.

Активность кислой фосфатазы определяют, используя в качестве субстрата 0,5%-ный раствор пара-нитрофенилфосфата натрия.

За единицу активности принимается такое количество фермента, при действии которого на субстрат в стандартных условиях опыта (гидролиз 1 ч при 30^оС) за 1 мин образуется 1 нмоль пара-нитрофенила.

П р и м е р 1 (контроль по прототипу).

В колбу емкостью 750 мл наливают 100 мл питательной среды следующего состава, мас. Картофельный крахмал 5,5 NH₄NO₃ 0,5 MgSO₄ 0,05 KCl 0,04
10%-ный водный
экстракт овсяной шелухи 7,5 Вода Остальное
Затем засевают А. awamori шт. 22 в количестве 5% от содержания питательной среды. Культивирование проводят при 30^оС, в условиях аэрации на качалке при 200 об/мин в течение 72 ч. Активность фермента 208,5 ед/мл (в пересчете на пара-нитрофенил 427,0 ед/мл).

П р и м е р 2. Колбы емкостью 750 мл, объем питательной среды 100 мл, аэрация на качалке при 180 об/мин. Температура культивирования 30^оС, продолжительность 72 ч. Посевной материал Asp. foetidus F-164 в количестве 0,01% от содержания питательной среды. Питательная среда следующего состава, мас. Кукурузный крахмал 6 Пшеничные отруби 0,075 Амилосубтилин ГЗх 0,035 (NH₄)₂SO₄ 0,6 MgSO₄ 0,037 КСl 0,037 MnCl₂ 0,01 Вода Остальное
Активность культуральной жидкости 810 ед/мл.

П р и м е р ы 3, 4, 5, 6. Условия культивирования те же, что в примере 1.

Данные приведены в табл. 1.

П р и м е р 7. Питательная среда как в примере 1. Культивирование Asp. foetidus F-164 проводят в ферментере емкостью 1,5 м³ с коэффициентом заполнения 0,5. Температурный режим: засев при 42^оС; культивирование в течение 18 ч при 36^оС; в последующие 32 ч температура 30^оС.

Аэрация: с момента засева и до 24 ч роста 1 об.воздуха./1 об. культуральной жидкости в 1 мин; с 24 до 36 ч роста 1,5 об. воздуха/1 об. культуральной жидкости в 1 мин; с 36 ч роста и до конца ферментации 1 об. воздуха/1 об. культуральной жидкости в 1 мин.

Продолжительность культивирования 50 ч. Активность культуральной жидкости 1620 ед/мл. Активность автолизата 2160 ед/мл. Активность препарата 153600 ед/г. Выход препарата 10 кг с 1 м³ культуральной жидкости. Биомасса 32 кг/м³ при влажности 77%
П р и м е р ы 8, 9, 10, 11. Питательная среда и условия культивирования те же, что в примере 6. Данные приведены в табл. 2.

П р и м е р 12. Условия культивирования те же, что в примере 6. При обработке культуральной жидкости перед сушкой в ультраконцентрат добавляют 1% сернокислого магния.

Активность готового препарата 180000 ед/г.

П р и м е р ы 13, 14, 15, 16. Условия культивирования те же, что в примере 6. В ультраконцентрат перед сушкой добавляют сернокислый магний. Данные приведены в табл. 3.

При использовании вышеописанного комплекса мероприятий в конце ферментации происходит автолиз культуры, что приводит к дополнительному увеличению активности кислой фосфатазы в культуральной жидкости на 20-25% за счет выхода внутриклеточного фермента и к уменьшению в 3 раза отходов производства в виде биомассы.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения кислой фосфатазы, применяемой в сыроделии и медицине. С целью повышения активности и выхода целевого продукта используют штамм Asp. foetidus F 164, культивирование которого осуществляют на лимитированной по фосфору питательной среде следующего состава, мас. кукурузный крахмал 4 10; пшеничные отруби 0,05 0,125; амилосубтилин ГЗХ (600 ед/г) 0,02 0,05; сернокислый аммоний 0,4 1,0; сернокислый магний 0,025 0,0625; хлористый калий 0,025 0,0625; хлористый марганец 0,005 0,0125. Культивирование микроорганизма ведут в дробных режимах аэрации и температуры, а именно засев среды при 40 45°С культивирование в лаг-фазе при 35 50°С с аэрацией от 1 об. воздуха/ 1 об. культуральной жидкости в 1 мин до 1,5 об. воздуха/ 1 об. культуральной жидкости в 1 мин; в стадии активного биосинтеза фермента при 28 30°С и аэрации 1 об. воздуха// 1 об. культуральной жидкости в 1 мин. Последующая обработка культуральной жидкости предусматривает фильтрацию, стерильную фильтрацию, ультраконцентрирование, сушку распылением с добавлением в ультраконцентрат перед сушкой 1% сернокислого магния как стабилизатора фермента. Создание вышеописанных условий культивирований приводит к автолизу культуры в конце ферментации, что ведет к дополнительному увеличению активности кислой фосфотазы в культуральной жидкости на 20 25% за счет выхода внутриклеточного фермента и к уменьшению в 3 раза отходов производства в виде биомассы. Указанным способом получают препарат кислой фосфотазы с активностью до 180000 ед/г и выходом 10 кг/м³ 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий внесение посевного материала гриба Aspergillus, культивирование в условиях аэрации на питательной среде, содержащей органический источник углерода и азота, минеральные соли хлористый калий и сульфат магния и воду, с последующей фильтрацией, ультраконцентрированием и сушкой распылением, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода целевого продукта, в качестве продуцента кислой фосфатазы используют Aspergillus toetidus ВКПМ F-164, в питательную среду в качестве органического источника углерода и азота вводят кукурузный крахмал и пшеничные отруби, а также дополнительно вносят амилосубтилин ГЗх, сульфат аммония и хлористый марганец при следующем соотношении компонентов, мас.

Кукурузный крахмал 4 10
Пшеничные отруби 0,05 0,125
Амилосубтилин ГЗх 0,02 0,005
Сульфат аммония 0,4 1,0
Сульфат магния 0,025 0,0625
Хлористый калий 0,025 0,0625
Хлористый марганец 0,005 0,0125
Вода Остальное
при этом внесение посевного материала осуществляют при 40 45^oС, культивирование в течение 16 20 ч ведут при 28 32^oС, а с 20 ч роста и до конца ферментации при 28 32^oС, при этом аэрацию с момента засева и до 24 ч роста проводят 1 об. воздуха/ 1 об. культуральной жидкости в 1 мин, с 24 ч до 36 роста 1,5 об. воздуха/ 1 об. культуральной жидкости в 1 мин, после 36 ч и до конца ферментации 1 об. воздуха/1 об. культуральной жидкости в 1 мин, а перед сушкой в ультраконцентрат добавляют 0,8 1,2% сернокислого магния.