ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК И ПОЛУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕНА ЗЛАКОВЫХ РЕКОМБИНАНТНЫМ СПОСОБОМ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/09 C12N15/29 C12N15/63 C12P21/00 C07K2/00 G01N33/53 A61K38/02 

Настоящее изобретение относится к идентификации и исследованию аллергена травяной пыльцы и кодирующей его молекуле рекомбинантной ДНК. В качестве природного исходного материала служит пыльца Phleum pratense. Кроме того, данное изобретение относится к фрагментам, неполным последовательностям и мутантам. Молекулы рекомбинантной ДНК, а также полученные из них полипептиды, фрагменты или вариации можно применять в терапии заболеваний, связанных с пыльцевыми аллергиями. Помимо этого полученные рекомбинантными методами протеины и фрагменты могут применяться с целью диагностики пыльцевых аллергий.

Аллергии типа 1 представляют собой проблему, актуальную во всем мире. До 20% населения промышленно развитых стран жалуется на аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальную астму. Эти аллергии вызывают присутствующие в воздухе аллергены (аэроаллергены), источники которых имеют самую разнообразную природу (пыльца растений, клещи, собаки или кошки). В случае травяной пыльцы, в свою очередь, у почти половины (до 40%) лиц, страдающих аллергией типа 1, наблюдается проявление IgE специфической активности (Friedhoff и др., 1986, J Allergy Clin. Immunol.78, 1190-201).

Веществами, инициирующими аллергии типа 1, являются протеины, гликопротеины и полипептиды. Проникая в организм через слизистые оболочки, эти аллергены вступают в реакцию с молекулами IgE, связанными у аллергиков с поверхностями лаброцитов. При взаимном сцеплении двух молекул IgE посредством аллергена эффекторные клетки начинают высвобождать медиаторы (например гистамин, простагландины) и цитокины. Таким образом, можно наблюдать соответствующие клинические симптомы.

Исходя из относительной частоты, с которой у страдающих аллергией обнаруживают антитела IgE против тех или иных аллергенов, последние разделили на главные и второстепенные. В случае тимофеевки луговой (Phleum pratense), Phl p 1 (Petersen и др., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5 (Matthiesen и 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen и др., 1992), Phl p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) и Phl p 2/3 (Dolecek и др., 1993, FEBS 335 (3), 299-304) до настоящего времени считались главными аллергенами, a Phl p 4 ( 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) и группы 10 и 11 из Lolium perenne (Ansari и др., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) - второстепенными.

В связи с настоящим изобретением особый интерес представляет аллерген Phl p 4, поскольку он обладает молекулярной массой 55 кДа (Fischer и др., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98 (1), 189-98), такой же, что и у нового аллергена, и, таким образом, наиболее близко сопоставим с аллергеном, получаемым по данному изобретению, хотя значительно отличается от последнего с иммунологической и биохимической точек зрения. В отличие от вышеупомянутых аллергенов Phl p 4 является единственным с до сих пор не идентифицированной геномной или транскрипционной (кДНК) последовательностью. Среди прочего имеются данные о последовательностях Phl p 1 (Laffer и др., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen и др., 1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95 (5), 987-994), Phl p 5 (Vrtala и др., 1993, J. Immunol. 151 (9), 4773-4781), Phl p 6 (Petersen и др., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108 (1), 55-59) и Phl p 2 (Dolecek и др., 1993, FEBS 335 (3), 299-304). С помощью последовательностей кДНК можно получать рекомбинантные аллергены, которые могут применяться в диагностике и терапии (Scheiner и Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).

Классическими методами эффективного терапевтического лечения аллергий является специфическая иммунотерапия или гипосенсибилизация (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6), 336-339, Bousquet и др., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4), 558-562). Эти методы предполагают подкожное введение пациенту возрастающих доз экстрактов природного аллергена. Однако при этом могут иметь место аллергические реакции или даже анафилактический шок. С тем чтобы по возможности избежать подобных последствий, применяют новые препараты в форме аллергоидов. Они представляют собой химически модифицированные экстракты аллергенов с существенно пониженной реакционной способностью IgE, при этом обладая Т-клеточной активностью, идентичной таковой, наблюдаемой в необработанном экстракте (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382).

Еще более оптимизировать терапию можно, применяя аллергены, полученные рекомбинантными методами. Описанные коктейли из полученных рекомбинантными методами аллергенов высокой чистоты, состав которых, при желании, можно подобрать сообразно показаниям для того или иного пациента, вполне могут вытеснить экстракты природных аллергенов, поскольку последние помимо различных аллергенов содержат довольно большое количество иммуногенных, но не аллергенных, сопутствующих протеинов. С появлением рекомбинантных аллергенов со специфическими мутациями, в которых эпитопы IgE были подвергнуты специфической делеции без ущерба для ключевых с точки зрения терапии Т-клеточных эпитопов, стали реальными перспективы безопасной гипосенсибилизации с помощью продуктов экспрессии (Schramm и др., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).

Другая возможность терапевтического воздействия на нарушенный Тh-клеточный баланс у страдающих аллергией пациентов заключается в лечении с применением экспрессируемой ДНК, кодирующей соответствующие аллергены. Экспериментальное подтверждение наличия аллергензависимого действия в отношении иммунного ответа впервые было получено на грызунах путем введения им кодирующей аллерген ДНК (Hsu и др., 1996, Nature Medicine 2 (5), 540-544).

Настоящее изобретение можно с успехом применять в диагностике in-vitro и in-vivo аллергических болезней, в особенности поллиноза. С этой целью клонированную нуклеиновую кислоту лигируют в вектор экспрессии, после чего эту конструкцию экспрессируют в клетке подходящего типа. После биохимической очистки этот рекомбинантный аллерген можно применять для осуществляемого традиционными методами обнаружения антител IgE. С другой стороны, в настоящем изобретении предлагается основной компонент содержащего рекомбинантный аллерген или нуклеиновую кислоту препарата, предназначенного для проведения специфической иммунотерапии. Здесь имеется целый ряд возможностей. Во-первых, компонентом препарата может быть протеин с немодифицированной первичной структурой. Во-вторых, по настоящему изобретению в ходе терапии можно применять гипоаллергенные (аллергоидные) формы, получаемые путем специфической делеции эпитопов IgЕ полной молекулы или формирования отдельных фрагментов, кодирующих Т-клеточные эпитопы, что позволяет избежать нежелательных побочных эффектов. И, наконец, лигируя нуклеиновую кислоту как таковую с эукариотным вектором экспрессии, получают препарат, который, если применять его непосредственно, дает возможность проводить лечение, результат которого состоит в изменении аллергического иммунного состояния.

Настоящее изобретение относится к молекуле рекомбинантной ДНК, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты (фиг.1) и кодирующей аллерген. В качестве природного исходного материала служат частицы пыльцы злаковых, таких как, например, среди прочего, Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus.

После очистки и выделения природного аллергена осуществляют секвенирование N-концевого протеина. На основе выведенной из него последовательности нуклеиновой кислоты получают праймер. С помощью этого праймера из кДНК-популяции пыльцы методом ПЦР получили соответствующую кДНК, которую затем клонировали и исследовали. По настоящему изобретению из этой кодирующей аллерген молекулы ДНК были получены фрагменты и неполные последовательности.

По завершении экспрессии молекулы рекомбинантной ДНК или фрагментов и неполных последовательностей в клеточных системах, осуществляемой с помощью соответствующих векторов экспрессии, производили очистку аллергена или гипоаллергенных вариаций или фрагментов.

Для очистки природного аллергена из пыльцы тимофеевки луговой применяли двухстадийный процесс. Проведя водную экстракцию пыльцы, полученный в результате экстракт с помощью хроматографии методом гидрофобного взаимодействия разделяли на две фракции, одна из которых проходила через колонку, а другая - через элюат. Первая фракция содержала три аллергена, Phl p 1 (30-35 кДа), Phl p 2/3 (11-14 кДа) и неизвестный аллерген (55-60 кДа). Эти протеины разделяли путем гель-фильтрации с использованием Superdex 75.

Упомянутый неизвестный до сих пор аллерген (рабочее название р55) отделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфатом натрия и блотировали на поливинилиденфторидную мембрану, после чего выделяли точно отобранную фракцию. Последовательность N-концевой аминокислоты в этой молекуле р55 определяли методом расщепления по Эдману (фиг.2).

С целью получения и клонирования соответствующей кДНК р55 по настоящему изобретению на основе N-концевой последовательности (фиг.3) конструировали специфический праймер ДНК (21 мер). В качестве второго праймера использовали якорную последовательность, локализованную в олиго-dТ-праймере, применяемом для обратной транскрипции. ПЦР осуществляли в жестких условиях с использованием кДНК, полученной из репрезентативной мРНК-популяции пыльцы Phleum pratense, праймера по настоящему изобретению и якорного праймера. С помощью аналитического гель-электрофореза в ходе ПЦР была идентифицирована амплифицированная ДНК размером 1,65 тысячи гетероциклических оснований нуклеотидов нуклеиновой кислоты. Эту амплифицированную ДНК лигировали в вектор pCR2.1, после чего была проведена ее успешная трансформация. В результате секвенирования вставок в двух разных клонах получили идентичную последовательность.

В этой первичной амплифицированной ДНК идентифицировали открытую рамку считывания (ОРС) размером 1492 пар оснований (см. фиг.1).

Чтобы из этой нуклеиновой кислоты получить соответствующий рекомбинантный протеин (фиг.4), сперва с помощью ферментов-ограничителей вектор pCR2.1 повторно клонировали в вектор экспрессии pProEx Htb. По завершении экспрессии и биохимической очистки продукта экспрессии был проведен ряд анализов аллергенности образованного протеина. Как показали эти анализы, например, вестерн-блоттинг и дот-блот, рекомбинантный протеин специфически реагировал с IgE пациентов с клиническими симптомами аллергии, вызванной травяной пыльцой. В качестве контроля использовали природный р55. Итак, можно заключить, что рекомбинантный протеин является аллергеном. Таким образом, продукт экспрессии позволяет проводить диагностику пациентов, страдающих аллергией, вызванной травяной пыльцой, усовершенствованным методом с повышенной специфичностью.

С целью получения гипоаллергенных вариаций, которые позволили бы улучшить методы терапии, по настоящему изобретению из нуклеиновой кислоты, клонированной в векторе экспрессии, были получены описанные фрагменты и комбинации неполных последовательностей. Кроме того, были проведены сайт-специфические точечные мутации, главным образом, в триплете, кодирующем цистеин. Таким образом, эта часть настоящего изобретения отличается от таковой, посвященной методу диагностики с пониженной или вовсе отсутствующей активностью IgЕ. Благодаря возможности подобного понижения [пробел] можно говорить о применении при гипосенсибилизации препаратов с незначительным побочным действием или таковых, характеризующихся полным отсутствием последнего. Нуклеиновые кислоты, кодирующие гипоаллергенные вариации протеина, или немодифицированные нуклеиновые кислоты, кодирующие р55, лигированные с человеческим вектором экспрессии, также могут применяться в качестве препаратов для специфической иммунотерапии.

Таким образом, объектами настоящего изобретения являются

а) молекула рекомбинантной ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, выполняющий функцию аллергена и предпочтительно экспрессируемый злаковыми (Роасеае) и однодольными растениями;

б) указанная молекула ДНК с нуклеотидной последовательностью из Phleum pratense;

в) нуклеотидная последовательность упомянутой молекулы ДНК, изображенная на фиг.1;

г) молекула ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая гибридизируется с упомянутой последней нуклеотидной последовательностью, приведенной на фиг.1;

д) неполные последовательности и их комбинации, присутствующие в нуклеотидной последовательности по п. в) или г);

е) молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность а)-г), модифицированную с помощью специфических мутаций отдельных кодонов и путем элиминации или аддиции;

ж) нуклеотидная последовательность по п. в), кодирующая иммуномодулирующий Т-клеточный реакционноспособный фрагмент;

з) нуклеотидная последовательность по п. г), кодирующая иммуномодулирующий Т-клеточный реакционноспособный фрагмент;

и) нуклеотидная последовательность по п. д), кодирующая иммуномодулирующий Т-клеточный реакционноспособный фрагмент;

к) нуклеотидная последовательность по п. е), кодирующая иммуномодулирующий Т-клеточный реакционноспособный фрагмент;

л) вектор экспрессии или система клонирования рекомбинантной ДНК, состоящий(-ая) из молекулы рекомбинантной ДНК по пп. а)-г), функционально связанной с последовательностью, управляющей экспрессией;

м) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. в);

н) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. г);

о) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. д);

п) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. е);

р) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. ж);

с) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. з);

т) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. и);

у) полипептид, кодируемый из нуклеиновой кислоты по п. к);

ф) способ получения полипептида, его фрагмента или производной путем культивирования прокариотных или эукариотных клеток, трансформированных вектором экспрессии по п. 11 формулы изобретения, и выделения соответствующего протеина или полипептида из культуры;

х) способ диагностики пыльцевых аллергий in vivo или in vitro с использованием полипептидов по п.п. м)-о);

ц) фармацевтический препарат, включающий полипептид, фрагмент или производную по пп. м)-ф), предназначенный для терапевтического лечения людей или животных, страдающих пыльцевой аллергией;

ч) способ терапии страдающих пыльцевой аллергией людей или животных с применением фармацевтического препарата по п. ц);

ш) способ терапии пыльцевых аллергий путем вакцинации ДНК конструкциями по п. л);

щ) способ терапии пыльцевых аллергий путем вакцинации ДНК векторами по п. л), содержащими иммуностимулирующие фрагменты ДНК.

Таким образом, будучи составляющей процесса идентификации, присущего тому или иному пациенту спектра сенсибилизации, позволяющего различать компоненты аллергена, настоящее изобретение служит для усовершенствования методов диагностики in-vitro. Также данное изобретение можно применять с целью изготовления существенно улучшенных препаратов, предназначенных для проведения специфической иммунотерапии пациентов, страдающих аллергиями, вызванными травяной пыльцой.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в аллергологии и медицине. Описана молекула рекомбинантной ДНК, кодирующий полипептид-аллерген злаковых, который экспрессируется злаковыми и однодольными растениями. Описан также фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуномодулирующий Т-клеточный реакционноспособный фрагмент полипептида-аллергена. Изобретение охватывает вектор экспрессии и систему клонирования, включающие указанную ДНК или его фрагмент. Описан полипептид-аллерген и его фрагмент, способ его получения. Представлены способы диагностики in vivo и in vitro пыльцовой аллергии, в особенности поллиноза, с использованием полипептида или его фрагмента, а также способы терапии страдающих пыльцевой аллергией людей или животных путем вакцинации ДНК вектором или введением фармацевтического препарата, включающего полипептид или его фрагмент. Использование изобретения позволяет проводить специфическую иммунотерапию, результат которого состоит в изменении аллергического иммунного состояния. 13 с. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Молекула рекомбинантной ДНК, кодирующая полипептид, действующий в качестве аллергена и предпочтительно экспрессируемый злаковыми (Роасеае) и однодольными растениями, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей последовательность, изображенную на фиг.1, и последовательность, модифицированную с помощью специфических мутаций отдельных кодонов и путем элиминации или добавления.2. Молекула рекомбинантной ДНК по п.1, отличающаяся тем, что кодируемый ею полипептид экспрессируется Phleum pratense.3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуномодулирующий Т-клеточный реакционноспособный фрагмент полипептида, действующего в качестве аллергена и предпочтительно экспрессируемого злаковыми (Роасеае), содержащая фрагмент нуклеотидной последовательности, изображенной на фиг.1, или модифицированной последовательности по п.1.4. Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, состоящий из молекулы рекомбинантной ДНК по любому из пп.1-3, функционально связанной с последовательностью, управляющей экспрессией.5. Система клонирования рекомбинантной ДНК, включающая молекулу рекомбинантной ДНК по любому из пп.1 и 2.6. Полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1.7. Фрагмент полипептида, кодируемый нуклеотидной последовательностью, охарактеризованной в п.3.8. Способ получения полипептида по любому из пп.6-7 путем культивирования прокариотных или эукариотных клеток, трансформированных вектором экспрессии по п.4, и выделения соответствующего полипептида.9. Способ диагностики пыльцевой аллергии in vivo, отличающийся тем, что пациенту вводят полипептид по п.6 или фрагмент полипептида по п.7 с последующим учетом реакции организма пациента.10. Способ диагностики пыльцевой аллергии in vitro, отличающийся тем, что исследуемый материал от пациента контактируют с полипептидом по п.6 или фрагментом полипептида по п.7 с последующим учетом результатов контактирования.11. Фармацевтический препарат, предназначенный для терапевтического лечения людей или животных, страдающих пыльцевой аллергией, и включающий полипептид по любому из пп.6 и 7.12. Способ терапии страдающих пыльцевой аллергией людей или животных, отличающийся тем, что предусматривает использование фармацевтического препарата по п.11.13. Способ терапии страдающих пыльцевой аллергией людей или животных, отличающийся тем, что предусматривает вакцинацию ДНК вектором, обеспечивающим экспрессию полипептида по п.4, действующего в качестве аллергена и предпочтительно экспрессируемого злаковыми (Роасеае).14. Способ терапии страдающих пыльцевой аллергией людей или животных, отличающийся тем, что предусматривает вакцинацию ДНК вектором, обеспечивающим экспрессию иммуномодулирующего фрагмента полипептида по п.4, действующего в качестве аллергена и предпочтительно экспрессируемого злаковыми (Роасеае).