ШТАММ MYCELIA RADICIS VAR. GINSENG-ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ РОСТРЕГУЛЯТОРНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/14 C12N1/20 A01N63/00 C12P39/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, продуцирующей биологически активные вещества, обладающие рострегуляторными свойствами, которые могут быть использованы в сельском хозяйстве при обработке таких культур, как картофель, огурцы, томаты и др.

Известно сообщество микроорганизмов для получения регуляторов роста растений, состоящее из микромицета Acremonium panaxeorum UHMU F-160, дрожжей Candida muscorum UHMU Y-411, Rhodotorula glutinis UHMU Y-42 и бактерий Azomonas macrocytogenes UHMU B-28 и Xantobacter sp UHMU B-29 /пат. РФ 2100932/. Недостатками указанного сообщества являются сложность и трудоемкость его культивирования, нестабильность получаемого препарата.

Известны препараты, стимулирующие развитие и рост растений, полученные из чистых культур грибов-эндофитов, выделенных из корней пшеницы, овса, картофеля, пырея, мать-и-мачихи. Каждый препарат состоит из растворенных в 70% этиловом спирте продуктов метаболизма соответствующего ему эндофита. Обработка одним из указанных препаратов семян пшеницы, огурцов или клубней картофеля перед посевом способствовала повышению урожая /Гельцер Ф.Ю. Новые продуценты стимулирующих веществ для растений Доклады ВАСХНИЛ, № 5, 1975/.

Известен препарат “Симбиот-2”, стимулирующий урожайность растений, полученный из продуктов метаболизма грибов-эндофитов (ав.св. СССР № 921488). В качестве сырья для его изготовления используют эндофиты, выделенные из корней облепихи.

Недостатком известных стимуляторов роста является невысокая активность препаратов, полученных из эндофитов растений, обладающих наибольшей лекарственной ценностью.

Известен препарат Симбионт-1, изготавливающийся из эндофитов, выделенных из корней женьшеня. Препарат эффективен только при хороших условиях роста растений (ав.св. СССР № 370932).

Общим недостатком известных препаратов является невозможность идентифицировать получаемую с помощью известных штаммов продукцию, содержание значительных количеств спирта в препарате.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является известный штамм Cylinddrocarpon magntsianum, являющийся продуцентом регулятора роста растений /патент Украины № 17558/. Штамм выделен из корневой системы облепихи. В качестве питательной среды используют, г/л: глюкозу, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄, K₂SO₄, MnSO₄, FeSO₄, аспарагин. Основным его недостатком является сложность его получения в промышленном масштабе, штамм оказывает эффективность только в прикорневой зоне определенного растения-хозяина.

Целью изобретения является расширение источников сырья из новых штаммов и повышение активности регулятора роста.

Цель достигается тем, что из корней женьшеня выделен новый штамм Mycelia radicis var. ginseng. Штамм хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ F-860. Штамм предназначен для получения биостимулятора роста растений.

Штамм выделен из корней женьшеня. Видовое название культуры Mycelia radicis var. ginseng, наименование штамм НТН-1. Родословная штамма: природный изолят. Подобный тип выделенного гриба сходен с грибами “эрикоидной микоризы”.

Культурально-морфологические особенности штамма: Аэроб. Гриб дает медленно растущие прижато-бархатистые колонии серо-коричневого цвета, с нижней стороны черного цвета. Скорость роста 0,17 см/сутки. Окраска среды под воздействием гриба не изменяется. При микроскопировании было выявлено, что гифы гриба темноокрашенные, с большим содержанием капель масла, очень часто склеены в коремиоподобные структуры. На гифах формируется значительное количество интеркалярных, собранных в цепочки шаровидных хламидоспор (от 3 до 5, реже 7 штук).

Продукт, синтезируемый штаммом, - комплекс биологически активных веществ.

При культивировании штамма в течение 3-х недель в жидкой среде Гельцер с последующим выделением комплекса вторичных метаболитов полученный препарат дает увеличение показателя всхожести сельскохозяйственных культур на 30-60%, а также прирост гипокотиля экспериментальной линии горчицы 50-70% к контролю (воде).

Биологическую активность определяли, используя стандартную методику биотестов на семенах растений.

Штамм хранили на агаризованных питательных средах при температуре 4-7°С с пересевами один раз в 3 месяца.

Агаризованная среда Гельцер (ГА), г/л, рН 6,2-6,6:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

K₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Агар-агар 15,0

Вода, мл До 1000

Размножение культуры осуществляли путем пересева на агаризованной среде Гельцер, состав которой представлен выше.

Условия и состав среды для ферментации: на жидкой питательной среде Гельцер продолжительность культивирования 20-30 дней при температуре 26±1°С.

Состав среды: жидкая питательная среда Гельцер, г/л, рН 6,0-6,4:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

K₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Вода, мл До 1000

Штамм не является зоопатогенным, не является фитопатогенным, не представляет опасности для окружающей среды.

Препарат на основе штамма НТН-1 получили при выращивании культуры в колбах. Культивирование в колбах проводили в два этапа - после первого цикла отбирали культуральную жидкость, добавляли свежую питательную среду в количестве 30% от первоначального объема и осуществляли второй цикл культивирования. При проведении биотестов и химических анализов использовали лиофильно высушенный фильтрат культуральной жидкости.

Содержание фитогормонов в препарате: индоуксусная кислота (ИУК), цитокинины (ЦК), гиббереллины (ГА) - определяли хроматографическим методом.

Цитокинины представляют собой наиболее активные природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений и характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток.

Гибберелловая кислота ГА₃ наиболее широко применяется в сельском хозяйстве как регулятор роста растений. Однако ГА₇ представляет наибольший интерес, т.к. имеет более широкий спектр действия и физиологическую активность выше.

Индоуксусная кислота (ИУК) является ростстимулятором, но из-за плохой растворимости в воде и относительно высокой стоимости имеет узкий спектр рекомендованных для обработки культур.

Все эти соединения, относящиеся к известным регуляторам роста растений, подробно описаны в литературе /Регуляторы роста растений. Под редакцией Г.С. Муровцева. М., 1979/.

Заявляемый штамм позволил получить одновременно все эти соединения, что значительно повысило биологическую активность препарата и одновременно повысило экономическую эффективность его применения.

Биологическая активность сухого препарата на основе заявляемого штамма на мятлике, сорт Деним, (контроль-вода) и содержание фитогормонов в этом препарате приведены в таблице 1.

В таблице 2 приведен элементный состав лиофилизированного препарата. Анализ элементного состава показал, что препарат не содержит тяжелых металлов. В препарате значительно по сравнению с питательной средой увеличилось содержание калия и молибдена, содержание остальных элементов уменьшается.

Содержание свободных углеводов, мг/г сух. веса: сахароза - 164, глюкоза - 396, фруктоза - 84, маннит - 97.

В препарате содержатся следующие аминокислоты: гистидин 0,0352, аспарагин 0,0207, серин 0,0068, глутамин 0,0115, глицин 0,0204, аланин 0,0164, валин 0,0091.

Аминокислоты определяли методом ионнообменной хроматографии. При проведении жесткого гидролиза (с целью определения связанных аминокислот) в препарате определяется довольно широкий спектр аминокислот, присутствующих в небольших количествах. Свободные аминокислоты по составу менее разнообразны, они также присутствуют в небольших количествах.

В препарате содержатся жирные кислоты, в том числе арахидоновая кислота, которая является важным компонентом комплекса метаболитов, стимулирующая рост и развитие растений. Содержание жирных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии.

В препарате также содержится аскорбиновая кислота и цитрин (витамин Р). Определялись методом цветных реакций.

Данные по химическому составу препарата мг/г сух. веса:

Фитогормоны 21,387

Аминокислоты 0,0970

Углеводы 679,000

Зольные элементы 21,637

Полученный биостимулятор осаждают этанолом, ацетоном, термоустойчив до 150°С, характеризуется биологической стабильностью, устойчив к воздействию микроорганизмов.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Штамм Mycelia radicis var. ginseng растет на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30°С, в течение 48 часов продуцирует 25 г вторметаболитов, проявляющих биостимулирующую активность. Культивирование штамма осуществляют на жидкой питательной среде Гельцер, продолжительность культивирования 20-30 дней при температуре 26±1°С.

Состав среды: жидкая питательная среда Гельцер, г/л, рН 6,0-6,4:

Глюкоза 8,0

КН₂РO₄ 0,6

К₂НРO₄ 1,8

MgSO₄ 0,2

К₂SO₄ 0,1

MnSO₄ Следы

FeSO₄ Следы

L-аспарагин 0,02

Вода, мл До 1000

В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5 вес.%.

При культивировании на жидкой питательной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста - ферментализат БВК в количестве 0,2%. Выращивание осуществляют при 28-30°С, в условиях аэрации и перемешивания в колбах объемом 750 мм³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 часов на качалках (220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Mycelia radicis var. ginseng 6,8-7,0 и для синтеза метаболитов - 6,8-7,2.

Процесс идет стабильно, ассоциация устойчиво сохраняет свойство синтезировать метаболиты в пяти последовательных ферментациях.

Метаболиты, состав которых указан в таблице 1, синтезируемые заявляемым штаммом, использовали при обработке посевов картофеля, огурцов, томата.

Полученный жидкий препарат на основе заявляемого штамма осторожно перемешивали и применяли для обработки (внесение в почву) посадок сеянцев ели (внекорневая подкормка), картофеля (полив всходов), капусты поздней (подкормка рассады накануне высадки в грунт), томаты (внекорневая подкормка), огурцы (полив всходов). Вели морфофизиологические и фенологические наблюдения, учитывали урожай продукции, определяли некоторые параметры, характеризующие качество продукции. Результаты приведены в таблице 3. Контроль (100%) - показатели продукции с участков, не обрабатываемых заявляемым штаммом.

Заявляемый штамм осуществляет положительное влияние на растения посредством прямой и непосредственной стимуляции роста растений за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений. Препарат, изготовленный на основе заявляемого штамма, найдет широкое применение в современной агробиотехнологии.

Заявляемый штамм при проведении патентного и информационного поиска на уровне техники не обнаружен, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения условиям патентоспособности, предусмотренной Патентным законом РФ.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм гриба Mycelia radicis var, хранящийся во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ F-860, является продуцентом комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами. Изобретение позволяет получить препарат, используемый в качестве биостимулятора роста растений. 3 табл.

Штамм гриба Mycelia radicis var. ginseng - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами, коллекционный номер ВКПМ F-860.