СООБЩЕСТВО МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГУЛЯТОРА И РЕГУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ Российский патент 2001 года по МПК A01N63/00 A01N63/04 C12P39/00 C01C1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения средств, повышающих урожайность сельскохозяйственных культур из сообщества микроорганизмов, выделенных из корней жень-шеня.

Известно сообщество микроорганизмов для получения биорегулятора роста растений, включающее грибы-эндофиты, выделенные из корней жень-шеня, облепихи (1-2). Недостатком известных сообществ является неопределенный состав микроорганизмов, входящих в сообщество.

Известно сообщество микроорганизмов для получения регулятора роста растений, состоящее из микромицета Acremonium panaxeorum UHMU F-160, дрожжей Candida muscorum UHMU У-411, Rhodotorula glutinis UHMU У-42 и бактерий Azomonas macrocytogenes UHMU B-28 и Xantobacter sp UHMU B-29 (3).

Известны способы получения регуляторов роста растений путем культивирования одного из вышеуказанных сообществ на питательной среде, содержащей источник углерода, минеральные соли, аминокислоты с последующим выделением из биомассы биологически активных веществ, стимулирующих рост растений (1-4).

Известными способами получали препараты Симбионт - 1(1), Симбионт-Универсал (3). Данные препараты представляют собой спиртовые экстракты из биомассы сообществ микроорганизмов. Целью изобретения является расширение источников сырья из новых сообществ микроорганизмов и повышение эффективности и стабильности препаратов.

Цель достигается тем, что из корней жень-шеня выделено новое сообщество микроорганизмов, состоящее из микромицета Acremonium sp, дрожжей Rhodotorula glutinis, и бактерий вида Enterobacter agglomerans и Azotobacter beijerinckii. Микроорганизмы в сообществе находятся в соотношении 90:2:1:1. Сообщество хранится в коллекции МГУ под номером 452.

Входящие в сообщество микроорганизмы имеют следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки бактерий Enterobacter agglomerans. При выращивании на МПА и БСА образуют колонии белого цвета, слизистые, гладкие до 3-4 мм в диаметре. На среде Сабуро с высоким содержанием глюкозы образует экзополисахариды. Культура на жидкой среде представляет собой одиночные подвижные палочки иногда в парах. Клетки, растущие на твердой среде, через сутки образуют короткие цепочки, пары или представлены одиночными формами разной длины. Размеры палочек 1,2-3 мкм, в диаметре ~1 мкм. Эндоспор не образуют. Культура относится к группе "Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки". Оптимальная температура роста 25-30^oC, наблюдается рост как при 37^oC, так и при 15^oC. Желатину разжижает, казеин гидролизует, крахмал не гидролизует, пигментов не образует. Использует в качестве источника азота соли аммония, органические соединения и нитрат. Восстанавливает нитрат в нитрит. Хорошо растет на цитрате, уреазу не синтезирует (рост на среде с мочевиной отсутствует). Сероводород из цистина и индол из триптофана не образует. Хорошо растет на среде Эшби и жидкой безазотистой среде Федорова. Культура обладает способностью к азотофиксации. Использует следующие углеводы с образованием кислоты: глюкозу, глицерин, Д-маннозу, Д-ксилозу, мальтозу, мелибиозу, рафинозу, арабинозу, L-рамнозу, Д-сорбит и сахарозу. Из многих указанных углеводов образует газ. Идентификация вида бактерий проведена на основании определителя Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (in four volumes), 1984, Baltimore /London.

Культурально - морфологическая характеристика дрожжей Rhodotorula glutinis.

При выращивании дрожжей на твердой агаризованной среде, содержащей 10^o Б сусло, и глюкозо-пептонной среде с добавлением дрожжевого экстракта образуются мелкие колонии розового цвета диаметром 2-3 мм. Колонии округлые, края розовые, центр колонии приподнят, поверхность матовая, с возрастом заметны кольцевые бороздки. Штрих ярко-розового цвета, гладкий, блестящий. Псевдомицелия культура не образует. Клетки овальные или продолговатой формы, размером 1,5·2,0-3,0 мкм. Размножаются дрожжи почкованием. Спор не образуют. В качестве источника азота для роста использует как органические, так и неорганические формы азота. В качестве единственного источника углерода и энергии использует глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, рафинозу, маннит, этанол и сукцинат. Не ассимилирует лактозу, мелибиозу, инулин, растворимый крахмал, рамнозу, цитрат, метанол. Слабый рост наблюдается на арабинозе, ксилозе, глицерине, лактате. В витаминах не нуждается. Температурный диапазон роста 10-40^oC. Оптимум 15 - 28^oC.

Идентификацию культуры дрожжей осуществляли на основании определителя под редакцией Бабьева И.П, Голубев В.И. "Методы выделения и идентификации дрожжей", М.: Пищевая промышленность, 1979 г. The Yeasts/ A taxonomic stady/ Sec cd/ by у Lodder, Amsterdam-London, 1970.

Культурально-морфологические признаки микромицета Acremonium sp. При выращивании микромицета Acremonium sp на агаризованной среде Чапека образуются колонии белого цвета, через несколько дней колонии приобретают кремовую окраску, а в старых культурах темно-коричневую, вплоть до черной. Мицелий обильный ватообразный. Плохо снимается с агара. С возрастом обратная сторона колонии становится коричневой. А в старых культурах черной. На воздушном мицелии образуются конидиеносцы одиночные, иногда в мутовках. Конидии образуются на вершине конидиеносца, одиночные и/или в ложных головках. Конидии бесцветные, в основном цилиндрические с закругленными концами. Длина конидии достигает 17 мкм, толщина 5 мкм. Встречаются конидиеспоры с перегородкой. Наряду с крупными цилиндрическими конидиями встречаются мелкие от овальных до шаровидных. На жидкой среде мицелий гриба представлен септированными гифами с множеством тяжей, окруженных толстым слизистым чехлом, инкрустированным бактериальными клетками. Рост в жидкой культуре сопровождается образованием хламидоспор. Оптимальная температура роста 20^oC. Чистая культура микромицета поддерживается и хранится на агаризованной среде Чапека и на сусло-агаре. Микромицет хранится в коллекции микроорганизмов МГУ под N 441.

Идентификацию микромицета осуществляли на основании нижеприведенных источников: Литвинов М.А. "Определитель микроскопических почвенных грибов", Л. : Наука, 1967 г. Пидопличко Н.М. "Грибы-паразиты культурных растений", Киев, "Наукова Думка", 1977 г., том 2, Gilmal J.C. "A manial of soil fungi" Second ed. The Iowa State Univ. Press. Ames. Lowa, USA, 1984.

Культурально-морфологические и физиолого-бихимические признаки Azotobacter beijerinckii.

При культивировании бактерий Azotobacter beijerinckii на мясо-пептонном агаре (МПА) образует плотные белые и гладкие, слегка выпуклые колонии, при старении приобретающие бежеватый оттенок. Колонии диаметром 1-2 мм, с возрастом приобретающие волнистый край. Колонии мягкие и легко снимаются с агара. Клетки не менее 1,5 мкм в диаметре, кокковидные, располагаются парами, образуя как бы восьмерки. Клетки суточной культуры как на твердой, так и на жидкой средах неподвижные. При негативном окрашивании тушью хорошо видна слизистая капсула, окружающая клетки. При старении культура образует цисты. Культура грамотрицательная, каталазо- и оксидазоположительная, аэробная, способна расти при пониженном содержании кислорода в среде. Хорошо растет на среде Эшби. Культура образует много слизи. Фиксирует молекулярный азот в кислой среде при pH 5,5 - 6,0. Хорошо растет при 20-30^oC, при 37^oC роста нет. Использует нитрат и восстанавливает его до нитрита, сереводород из цистеина не образует. Желатину не разжижает. Крахмал и казеин не гидролизует. В качестве единственного источника углерода ассимилирует фруктозу, глюкозу, сахарозу, этанол, молочную и пропионовую кислоты. Рамнозу не использует.

Идентификацию данного вида бактерий осуществляли по Bergey's "Manual of systematic Bacteriology", 1984.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами:
Пример 1: получение регулятора роста растений "Симбионта".

Микробное сообщество, состоящее из микромицета Acremonium sp, дрожжей Rhodorula glutinis, бактерии Azotobacter beijerinckii и Enterobacter agglomerans, KM МГУ 452, засевают в среду, содержащую (%):
Глюкоза - 0,8
K₂HPO₄ - 0,03
MgSO₄ - 0,02
K₂SO₄ - 0,01
FeSO₄ и MnSO₄ - Следы
Аспарагин - 0,001
Вода дистиллированная - До 1 л
Культивируют в стационарных условиях при исходном pH 6,5 и температуре 20^oC в течение месяца. По окончании процесса культивирования биомассу отделяют. Из биомассы экстрагируют биологически активные вещества спиртом, выдерживают, удаляют образовавшийся осадок и получают препарат "Симбионта", представляющий собой водно-спиртовой бесцветный, прозрачный или слегка опалесцирующий со специфическим запахом раствор продуктов жизнедеятельности вышеуказанного сообщества микроорганизмов. Препарат содержит гиббериллины не менее 0,05 мг/мл, пуриновые основания не менее 0,02 мг/мл и аминокислоты не менее 1 мг/мл, содержание тяжелых металлов не превышает 0,001%, мышьяк и ртуть отсутствуют, pH 5,4-5,8.

Содержание этилового спирта 48-54%.

Сухой остаток не менее 0,25%.

Из аминокислот регулятор содержит глутамин, глицин, аланин, валин, гистидин, цитизин, гуанин.

Полученный препарат стимулирует развитие микоризы, что ведет к улучшению питания растений. Полученные микоризные грибы опережают в своем развитии патогенные, занимающие одну и ту же экологическую нишу, способствующие снижению степени поражения грибными фитопатогенами.

В основе защищает растение в период вегетации. Скорость воздействия через 8-10 дней после вегетации.

Регулятор совместим со всеми средствами защиты растений: протравителями, инсектицидами, фунгицидами, гербицидами и регуляторами роста растений. Препарат был испытан на различных растениях.

Исследования, проведенные при выращивании капусты сорта Слава, показали, что замачивание семян в растворе "Симбионта" с нормой расхода препарата 2 мл/1 кг в течение 30 минут и последующее опрыскивание растений через 3 недели после высадки рассады в грунт при норме расхода препарата 1 мл/га обеспечили достоверную прибавку урожайности капусты на 11-30%. Применение препарата способствовало повышению энергии прорастания семян, их всхожести и улучшению качества рассады. Пораженность рассады капусты "черной ножкой" снизилась на 15%, листьев капусты различными бактериозами на 15-20%, перноспорозом на 5-12%.

Проведены исследования биологической эффективности "Симбионта" на огурце (сорт Неженский). Наиболее эффективным оказалось замачивание семян в регуляторе роста растений с нормой расхода препарата 1 мл/кг, нормой расхода рабочего раствора 2 л/кг, время замачивания 30 минут, 2-х кратное опрыскивание: 1-е в фазу образования 1-2 листьев, 2-е в фазу образования 4-5 листьев. Норма расхода препарата 1 мл/га, норма расхода рабочего раствора 300 л/га. Прибавка урожайности огурца составила 16,7% или 1,53 кг/м². В полевых испытаниях урожайность огурца возросла на 33%.

В результате 2-х летних испытаний регулятора роста растений на перце сорта Бодрость определены наиболее эффективные регламенты применения регулятора роста: замачивание семян на 30 мин, расход препарата 2 мл/кг, расход рабочего раствора 2 л/кг и опрыскивание в фазу цветения 1 мл/га, при норме расхода рабочего раствора 300 л/га. Исследования показали, что использование "Симбионта" способствовало получению прибавки урожая перца - 31%, увеличилось количество плодов перца на растении, масса 1 плода.

Испытания, проведенные на баклажане сорта Универсал 3, показали, что наиболее эффективным приемом обработки баклажана является замачивание семян в течение 30 минут в растворе "Симбионта" и опрыскивание растений в фазе цветения при вышеприведенных нормах расхода. Урожайность баклажан возросла на 13,8-16,8% и составила 1,13 - 1,12 кг/м². Получена более развитая и здоровая рассада баклажана, увеличились масса 1 плода и количество в среднем на 1 растение.

Препарат повышает урожайность гречихи на 9-11%, при этом повысилась всхожесть и энергия прорастания семян, масса зерна в среднем с 1-го растения. Урожайность гречихи увеличилась на 9-11%. Препарат также повышает урожайность сахарной свеклы на 10-20%, сахаристость корнеплодов на 0,5-0,8%. Препарат испытан при выращивании астр. Применение регулятора обеспечило повышение высоты растения астры, увеличение количества соцветий и их диаметра, % распустившихся цветков, снижение пораженности рассады астры "черной ножкой".

Обработка семян арбуза сорта Огонек и Херсонский ранний регулятором роста в дозе 4 мл/кг, при расходе рабочего раствора 2 л/кг, способствовала повышению урожайности арбуза на 36-40%, прибавка урожайности составила 42-80 ц/га, при урожайности на контроле 105-220 ц/га, соответственно.

Из приведенных данных следует, что полученный препарат способствует повышению урожайности сельскохозяйственных культур и устойчивости растений к возбудителям заболеваний.

Источники информации:
1. Авторское свидетельство N 370932, 22.11.73, A 01 N 65/00.

2. Авторское свидетельство N 921488, 23.04.82, A 01 N 65/00.

3. Патент N 2100932, 10.01.98, A 01 N 63/00.

4. Авторское свидетельство N 1824148, 30.06.93, A 01 N 65/00.3

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения регулятора роста растений на основе микроорганизмов. Из корней женьшеня выделено сообщество микроорганизмов, состоящее из микромицета Acremonium sp, дрожжей Rhodotorula glutinis бактерий Enterobacter agglomerans и Azotobacter beijerinckii. Сообщество депонировано в коллекции микроорганизмов МГУ под 452. Оно предназначено для получения регулятора роста растений. Регулятор получают путем культивирования сообщества на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в течение 1 месяца. Из культуральной жидкости отделяют мицелий. Мицелий экстрагируют этиловым спиртом, выдерживают смесь, удаляют образовавшийся осадок. Получают бесцветный прозрачный или слегка опалесцирующий со специфическим запахом раствор, содержащий гиббериллины, пуриновые основания, аминокислоты. Препарат повышает всхожесть и энергию прорастания семян, урожай сельскохозяйственных культур и снижает степень заболеваемости растений. 3 с. и. 1 з.п.ф-лы.

1. Сообщество микроорганизмов, состоящее из микромицета Acremonium sp, дрожжей Rhodotortula glutinis, бактерий Enterobacter agglomerans и Azotobacter beijerinckii КМ МГУ 452 для получения регулятора роста растений. 2. Способ получения регулятора роста растений, предусматривающий культивирование сообщества микроорганизмов с последующим экстрагированием биологически активных веществ спиртом из полученной биомассы, отличающийся тем, что из сообщества микроорганизмов используют сообщество по п.1. 3. Регулятор роста растений, содержащий спиртовой экстракт биомассы сообщества микроорганизмов, отличающийся тем, что он содержит спиртовой экстракт из биомассы сообщества микроорганизмов по п.1. 4. Регулятор роста растений по п.3, отличающийся тем, что он содержит гиббериллины не менее 0,05 мг/мл, пуриновые основания не менее 0,02 мг/мл, аминокислоты не менее 1 мг/мл, спирт 48 - 54%, сухой остаток микроэлементов не менее 0,25%, при этом мышьяк и ртуть отсутствуют.