Способ стимуляции инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema к переходу на питающуюся стадию Российский патент 2023 года по МПК A01N63/12 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения питающихся стадий инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema из непитающихся. Изобретение можно применять в сельском хозяйстве (как биологический способ борьбы с насекомыми-вредителями растений) и в фундаментальной биологии (для изучения биологии энтомопатогенных нематод).

Почвенных энтомопатогенных нематод рода Steinernema активно используют в качестве агентов биологической борьбы с насекомыми-вредителями сельского хозяйства, поскольку (в отличие от химических инсектицидов) нет губительного воздействия на полезную фауну насекомых, а необходимые количества нематод можно наработать в прихозяйственных биолабораториях (Спиридонов, С.Э. 2006 Глава 12. Применение энтомопатогенных нематод в защите растений,. В книге: Прикладная нематология: [Буторина Н.Н., Зиновьева С.В., Кулинич О.А. и др.; отв. ред.: д.б.н. Зиновьева С.В., к.б.н. Чижов В.Н.]. Москва, КМК, - 2006, С. 291-325).

В процессе размножения на искусственных средах живая культура нематод должна осуществить ключевой переход из т.н. инвазионных (непитающихся) личинок к питанию содержимым культурального сосуда.

Известен способ механического подсаживания непитающихся личинок энтомопатогенных нематод на агар с культурой симбиотических для них бактерий (Ehlers R.U. et al. Liquid culture of the entomopathogenic nematode-bacterium-complex Heterorhabditis megidislPhotorhabdus luminescens // BioControl. - 1998. - T. 43. - №.1. - C. 77-86).

Его существенным недостатком является низкий процент перехода личинок на питающуюся стадию. Так, в указанной статье он составил 55% на 6 день и 74% на 8-й для комплекса Heterorhabditis megidis (нематода) + Photorhabdus luminescens (симбиотическая бактерия) у нематод первого поколения и не превысил 23% у нематод второго поколения. Наши собственные эксперименты с нематодами рода Steinernema и симбиотическими для них энтеробактериями рода Xenorhabdus свидетельствуют о полном (0%) отсутствии перехода личинок из непитающейся стадии к питающейся при использовании такого способа (за 14-дневный период наблюдения).

Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ позволяет гарантированно стимулировать инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema к переходу на питающуюся стадию.

Технический результат достигается тем, что в агар Лурье для культивирования личинок добавляют 10% гомогената из гусениц большой вощинной огневки (Galleria mellonella), на которых в природе паразитируют Steinernema.

Способ реализуется следующим образом:

1) 50 г живых гусениц большой вощинной огневки {Galleria mellonella) умерщвляют путем помещения в морозильную камеру при температуре - 18°С на 1 час;

2) извлекают гусениц из морозильной камеры, помещают в гомогенизатор и изготавливают гомогенат;

3) готовят агар Лурье по общепринятой методике (в плоскодонную колбу на 100 мл помещают 0,5 г триптона + 0,25 г дрожжевого экстракта + 0,25 г поваренной соли + 0,75 г агара и 50 мл дистиллированной воды, смесь подогревают до полного растворения частиц);

4) вносят в агар Лурье 10% (весовых) гомогената из гусениц;

5) охлаждают смесь естественным путем, периодически взбалтывая колбу для лучшего перемешивания

6) разливают полученную среду по чашкам Петри;

7) автоклавируют смесь при 121°С в течение 25 минут;

8) на поверхность остывшей смеси наносят очищенную культуру бактерий рода Xenorhabdus;

9) спустя два дня на поверхность смеси (с двухдневной культурой бактерий) вносят личинок непитающихся энтомопатогенных нематод рода Steinernema;

10) визуально контролируют их переход к питающейся стадии по появлению мышечной активности пищевода и заглатыванию среды с бактериями.

Наши эксперименты показали, что внесение поверхностно стерилизованных (0,1 мертиолятом или 0,1% гипохлоритом с последующей трехкратной промывкой автоклавированной водой) инвазионных личинок на 2-3-дневный слой развивающихся на агаризованной среде бактерий рода Xenorhabdus при наличии в толще среды частиц гомогенизированных тканей гусениц вощинной моли приводило к почти 88-100% переходу нематод к питающейся стадии. Это позволяет обеспечить моноксенность развития нематод (присутствие в культуральной среде только одного вида бактерий нужного рода). Культивирование нематод в колбах Эрленмейера с 50 мл такой среды в течение 21 дня позволяет получить выход до 2,5 млн. личинок на колбу.

Таким образом, полезность предлагаемого изобретения заключается в том, что предлагаемый способ позволяет гарантированно стимулировать инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema к переходу на питающуюся стадию, что позволяет применять этих энтомопатогенных нематод в борьбе с насекомыми-вредителями растений.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ стимуляции инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema к переходу на питающуюся стадию, заключающийся в том, что 50 г живых гусениц большой вощинной огневки Galleria mellonella умерщвляют путем помещения в морозильную камеру при температуре -18°С на 1 час, затем помещают в гомогенизатор и изготавливают гомогенат; готовят агар Лурье по общепринятой методике; вносят в агар Лурье 10% весовых гохмогената из гусениц; охлаждают смесь естественным путем, периодически взбалтывая колбу для лучшего перемешивания; разливают полученную среду по чашкам Петри; автоклавируют смесь при 121°С в течение 25 минут; на поверхность остывшей смеси наносят очищенную культуру бактерий рода Xenorhabdus; спустя два дня на поверхность смеси вносят личинок непитающихся энтомопатогенных нематод рода Steinernema; визуально контролируют их переход к питающейся стадии по появлению мышечной активности пищевода и заглатыванию среды с бактериями. Заявленный способ позволяет стимулировать инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema к переходу на питающуюся стадию, что позволяет применять этих энтомопатогенных нематод в борьбе с насекомыми-вредителями растений.

Способ стимуляции инвазионных личинок энтомопатогенных нематод рода Steinernema к переходу на питающуюся стадию, заключающийся в том, что 50 г живых гусениц большой вощинной огневки Galleria mellonella умерщвляют путем помещения в морозильную камеру при температуре -18°С на 1 час, затем помещают в гомогенизатор и изготавливают гомогенат; готовят агар Лурье по общепринятой методике; вносят в агар Лурье 10% весовых гомогената из гусениц; охлаждают смесь естественным путем, периодически взбалтывая колбу для лучшего перемешивания; разливают полученную среду по чашкам Петри; автоклавируют смесь при 121°С в течение 25 минут; на поверхность остывшей смеси наносят очищенную культуру бактерий рода Xenorhabdus; спустя два дня на поверхность смеси вносят личинок непитающихся энтомопатогенных нематод рода Steinernema; визуально контролируют их переход к питающейся стадии по появлению мышечной активности пищевода и заглатыванию среды с бактериями.