Способ получения массовой культуры симбиотических бактерий Xenorhabdus энтомопатогенных нематод Rhabditida: Steinernematidae Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 A01N63/12 A01N63/20 A01P7/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения массовой культуры симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод (ЭПН) при промышленном производстве биомассы этих паразитов на искусственных питательных средах (ИПС) и применяемых в качестве биологических средств защиты растений от насекомых вредителей.

При культивировании энтомопатогенных нематод в питательной среде большое значение имеет подготовка чистой культуры симбиотических бактерий, которые встречаются в двух формах: первичной и вторичной. Нематоды размножаются в присутствии первичной формы, тогда как вторичные формы бактерий могут прекращать развитие нематод (1).

Из известных способов получения и хранения первичных форм является способ, при котором культуру симбиотических бактерий приготавливают и хранят на агаризированных косяках в пробирках. При этом чистые культуры первичных форм симбиотических бактерий получают по методу Г. Пойнара (2) путем заражения нематодами гусениц большой вощинной моли Galeria mellonella, выращенных по методу Датки и др. (3), с последующим отбором бактериальных клеток из гемолимфы насекомых и посевом их на питательный YS агар (NH₄H₂PO₄- 0,5 г; K₂HPO₄- 0,5 г; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2 г; NaCl - 5 г; дрожжевой экстракт - 5 г; агар - 12 г; вода - 1 л) (4), содержащий 2,3, 5-трифенил-тетразолиум хлорид (0,004%) и бромтимоловый голубой (0,025%).

Спустя трое суток после выращивания бактерий при 25°С проводят отбор колоний первичных форм по морфологическим признакам колоний и по характеру их окраски. Идентификация первичных форм симбиотических бактерий проводят по методу Акюрста (4). Для получения большого количества культуры симбиотических бактерий при массовом размножении энтомопатогенных нематод чистая культура бактерий хранится 10-15 дней при температуре 5-10°С, и более длительный срок бактерии хранятся в лиофилизированном состоянии (5).

В процессе массового производства энтомопатогенных нематод одновременно требуется значительный объем культуры их симбиотических бактерий. Наиболее близким, из известных и принятым за прототип, является способ получения массовой культуры симбиотических бактерий с высокой биологической активностью, при котором чистую культуру симбиотических бактерий выращивают в питательном (ГРМ-бульон) бульоне в колбах Эрленмейера на качалке при температуре 25-28°С ГРМ-бульон используется для культивирования различных микроорганизмов и который представляет собой микродисперсный, гигроскопичный порошок светло-желтого цвета. Состав: панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон сухой ферментативный, натрия хлорид (ТУ9398-021-78095326-206).

Недостатки прототипа определяются высокой стоимостью ГРМ-бульона, которая четырехкратно превышает стоимость всех компонентов питательной среды в определенном ее объеме, что существенно отражается на себестоимости промышленного производства биологических препаратов, изготавливаемых на основе энтомопатогенных нематод. Кроме того, компонентные составы бульонов, реализуемые в торговой сети, могут значительно различаться в зависимости от производителя, что может существенно отражаться на биологической активности нематодных препаратов, изготавливаемых на ИПС с использованием таких бульонов, и снижать эффективность способа.

Задача, решаемая изобретением - повышение эффективности способа и снижение себестоимости конечного продукта в условиях промышленного производства биопрепаратов, изготавливаемых на основе энтомопатогенных нематод, за счет нового питательного бульона, используемого при массовой наработке культуры симбиотических бактерий с высокой их биологической активностью.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности с одновременным снижением стоимости конечного продукта.

Поставленная задача решается следующим путем. Предлагаемый способ культивирования симбиотических бактерий заключается в том, что за основу нового питательного бульона взяты компоненты ИПС, используемые при приготовлении питательной среды для размножения нематодно-бактериального комплекса, которая дополнительно разбавляется водопроводной водой в соотношении 12% бульона искусственной питательной среды и 88% водопроводной воды.

При этом компонентный состав ИПС следующий, % от общего объема питательного бульона:

яичный порошок 7,4 масло подсолнечное нерафинированное 5,65 соевая мука 13,4 пивные дрожжи 0,8 соль 0,35 вода 72,4

Пример 1

Первоначальный процесс культивирования начинают с приготовления чистой культуры симбиотических бактерий и моноксенной культуры (т.е. культуры инвазионных личинок нематод, с одним видом бактерий - симбиотических) нематод, что также учитывалось при проведении сравнительной оценки качества различных форм питательных бульонов для размножения симбиотических бактерий и последующего развития нематодно-бактериального комплекса на ИПС.

Моноксенизация нематод осуществлена путем стерилизации инвазионных личинок нематод в 0.1% растворе мертиолата (C₂H₅HgSC₆H₄COONa), с последующим помещением их на питательный агар с чистой культурой симбиотических бактерий. Спустя пять дней на агаре развиваются половозрелые самки нематод, которые подвергались стерилизации путем проводки через мертиолат и набор антибиотиков (6). Полученных от самок аксенные личинки нематод первого возраста переносили на липидный агар (7) с симбиотическими бактериями. Спустя 15-20 дней после завершения цикла развития нематод проводили сбор моноксенной культуры инвазионных личинок нематод и инокулировали их в конические колбы (500 см³) с питательной средой, нанесенной на поролоновую губку с предварительно размноженными на ней симбиотическими бактериями Xenorhabdus bovienii (1,8 и 9).

Колбы содержали при температуре 25°С в течение 15 дней. После завершения цикла развития нематод в ИПС, полученных моноксенных инвазионных личинок использовали в качестве посевного материала по вариантам опытов.

Процесс культивирования нематодно-бактериального комплекса начинается со смешивания компонентов ИПС в отдельной емкости. Полученной гомогенной массой пропитывается поролоновая крошка, которая затем помещается в емкости и автоклавируется при температуре 121°С и давлении 1 атм. в течение 30 минут. В охлажденную питательную смесь в стерильных условиях инокулируется жидкая чистая двухсуточная культура симбиотических бактерий.

В процессе культивирования нематодно-бактериального комплекса и в качестве основы, при приготовлении бульонов ИПС, по вариантам опытов использована питательная среда из компонентов: яичный порошок - 6,4%; масло подсолнечное нерафинированное - 4,9%; соевая мука - 11,6%; пивные дрожжи - 0,7%; соль - 0,3%; вода - 62.7%, поролоновая крошка - 13,4%.

Интенсивность роста и развития чистой культуры симбиотических бактерий изучалась с использованием следующих питательных бульонов: 1) ГРМ - бульон питательный (прототип); 2) бульон ИПС без масла; 3) бульон ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O; 4) бульон ИПС 6 г + 94 мл Н₂О; 5) бульон ИПС 3 г + 97 мл H₂O.

При изучении возможности культивирования симбиотических бактерий на различных по составу питательных бульонах использованы колбы объемом 500 см³, которые заполняли питательным бульоном в расчете по 100 мл в каждую. После этого колбы с бульонами автоклавировали при температуре 121°С и давлении 1 атм. в течение 30 минут. В охлажденную питательную среду в стерильных условиях вносили по 5 мл чистой культуры симбиотических бактерий с количеством бактериальных клеток 1,0⋅10⁸ в 1 мл суспензии. После двухсуточной экспозиции при температуре 23-25°С по вариантам опыта определялась численность бактериальных клеток в расчете на 1 мл питательного бульона с использованием камеры Горяева.

Изучение эффективности культивирования симбиотических бактерий и нематод на ИПС в присутствии симбиотических бактерий, выращенных на различных питательных бульонах, проведено по одной методике, с использованием колб Эрленмейера объемом 500 см³ и биореакторов (10). Одна колба с 40 г и один биореактор с 400 г ИПС принимались за повторность. Повторность в опытах - 5-ти кратная.

После автоклавирования колбы и биореакторы с ИПС охлаждались и в них в стерильных условиях вносили чистую культуру симбиотических бактерий с количеством 1,0⋅10⁸ бактериальных клеток в 1 мл питательного бульона. Количества инокулюмов симбиотических бактерий в опытах выдерживались на следующих уровнях - 5 мл суспензии бактериальных клеток в питательном бульоне в расчете на одну колбу и в биореакторах, соответственно, в расчете на один биореактор - 100 мл суспензии бактериальных клеток.

Спустя двое суток после развития симбиотических бактерий на ИПС при температуре 23-25°С в каждую колбу с питательной средой в стерильных условиях внесено по 2 млн. стерильной культуры инвазионные личинки нематод в 10 мл дистиллированной воды и, соответственно, в каждый биореактор по 15 млн. нематод в 100 мл воды. Инвазионные личинки нематод перед внесением в емкости с ИПС стерилизовались в течение одного часа в 0,1% растворе формалина с последующей очисткой от химиката путем трехкратной промывки и осаждения в водопроводной воде. Температура в процессе развития симбиотических бактерий и нематодно-бактериального комплекса 23-25°С.

Оценку качества бактериальных культур после завершения их развития в питательных бульонах проводили по трем показателям: 1) по титру бактериальных клеток 2) выходу культуры нематод, после завершения процесса развития нематодно-бактериального комплекса на ИПС в присутствии бактерий симбионтов, размноженных на различных питательных бульонах; 3) инвазионной активности нематод после завершения процесса их развития на питательных бульонах в сравнении с прототипом.

После завершения цикла развития нематод в ИПС, полученные культуры нематод оценивали на инвазионную активность по методу Веремчук Г.В. и Данилова Л.Г. (11). Показатель инвазионной активности нематодно-бактериальных комплексов служил критерием окончательной оценки качества бактериальных культур. Гибель насекомых учитывали через каждые 4 часа после начала заражения. Во время учетов погибших насекомых выбирали из чашек, вскрывали в воде на часовом стекле под бинокуляром МБС-10 и определяли причину их гибели. Обнаруженных нематод подсчитывали и, таким образом, устанавливали интенсивность их проникновения в хозяина.

После оценки качества питательных бульонов не установлено существенных различий по интенсивности роста бактериальных клеток Xenorhabdus bovienii между ГРМ-бульон питательный (прототип) и бульоном в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O. Титр бактериальных клеток, соответственно, составлял 1,4⋅10¹¹ и 1,7⋅10¹¹. С уменьшением содержания ИПС в питательном бульоне снижался и титр бактериальных клеток до 6,7⋅10⁸ (Таблица 1).

При оценке качества бактериальных клеток после их развития на различных питательных бульонах по интенсивности развития нематодно-бактериального комплекса на искусственной питательной среде и инвазионной активности его в отношении насекомых-хозяев было установлено, что по выходу инвазионных личинок нематод и инвазионной активности у нематод, в присутствии симбиотических бактерий, развившихся в питательном бульоном в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O на 10% эти показатели превышали соответствующие в ГРМ бульоне питательном (Таблицы 1, 2 и 3).

Результаты оценки стоимости ГРМ бульона питательного с питательным бульоном в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O свидетельствуют о значительном снижении стоимости последнего по сравнению с прототипом (Таблица 4). При этом, например, стоимость компонентов ИПС для приготовления 10 литров ГРМ - питательного бульона без стоимости поролоновой крошки - составляет 918,86 руб., тогда как стоимость питательного бульона в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O, соответственно, 148,96 руб., т.е. достигается значительное снижение стоимости ИПС для массового культивирования биологических препаратов, изготавливаемых на основе ЭПН.

Источники информации

1. Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis J. Gen. Microbial. 1980. Vol. 121, №2. P.303-309.

2. Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neo aplectana sp. Nematologica. 1966. Vol. 12. №1. P.31-35.

3. Dutky S.R., Thompson J.V., Cantwel G.E. A technique for the mass propogation oe the DD-136 nematode. J. Insect Pathol. 1964. Vol. 6, №4. P. 417-422.

4. Dye D.W. A taxonomic study of the genus Eerwinia. The amylovora group. N.Z.J. Sci. 1968. Vol. 11, №4. P. 590-607.

5. Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г., Нащекина Т.Ю. Способ подготовки симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, выделенных из нематод вида Steinernema feltiae protense к хранению.Патент РФ №2053790, 2014.

6. Han R., Wouts W.M. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristics of possible Xenorhabdus luminescens subspecies. Rev. Nematol. 1990. Vol. 13. P. 411-415.

7. Han R., Wouts W.M., Li L. Development and virulence of Heterorhabditis spp. strains associated with different Xenorhabdus luminescens isolates. J. Invertebr. Pathol. 1991. Vol. 57. P. 1-6.

8. Bedding R.A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematode) for field control of insect pests. Nematologica. 1981. Vol. 27, №1. P. 109-114.

9. Wouts W.M. Mass production of the entomogenous Heterorhabditis heliothidis (Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media. Nematol. 1981. Vol. 13, №4. P. 467-469.

10. Данилов Л.Г. Способ для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод. Патент №2444195. Бюл. №7, 2012.

11. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Л., 1978, 7 с.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения массовой культуры симбиотических бактерий Xenorhabdus энтомопатогенных нематод Steinernematidae, включающий приготовление чистой культуры симбиотических бактерий и их культивирование на питательной среде, используемой для размножения нематодно-бактериальных комплексов и содержащей яичный порошок - 6,4%; масло подсолнечное нерафинированное – 4,9%; соевую муку – 11,6%; пивные дрожжи - 0,7%; соль - 0,3%; воду – 62,7%; поролоновую крошку - 13,4%; причем питательная среда дополнительно разбавляется водопроводной водой в соотношении 12% : 88%. Изобретение обеспечивает повышение выхода культуры энтомопатогенных нематод Steinernematidae и их инвазионной активности в отношении тест-насекомых в присутствии бактерий симбионтов. 4 табл., 1 пр.

Способ получения массовой культуры симбиотических бактерий Xenorhabdus энтомопатогенных нематод Steinernematidae, включающий приготовления чистой культуры симбиотических бактерий, отличающийся тем, что в качестве основы питательного бульона для культивирования бактерий взяты компоненты искусственной питательной среды, используемые для размножения нематодно-бактериальных комплексов, % от объема:

яичный порошок 6,4 масло подсолнечное нерафинированное 4,9 соевая мука 11,6 пивные дрожжи 0,7 соль 0,3 вода 62,7 поролоновая крошка 13,4;

которая дополнительно разбавляется водопроводной водой в соотношении 12% искусственной питательной среды и 88% водопроводной воды.