ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS SUBSP. ЦКМ В-4561, ОБЛАДАЮЩИЙ ФУНГИЦИДНЫМИ, БАКТЕРИЦИДНЫМИ И ИНСЕКТИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12N1/20 C12R1/55 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и сельскохозяйственной микробиологии, в частности для создания средств защиты растений от наиболее вредоносных болезней и вредителей.

В литературе описаны актиномицеты, продуцирующие антибиотики против фитопатогенных микроорганизмов и вредителей [1, 2]. В отличие от пестицидов антибиотики действуют избирательно, подавляя патогенные микроорганизмы и не подавляя при этом ткани и зародыши растений. Антибиотики обладают высокой активностью по отношению к фитопатогенам и вредителям, что дает возможность применять их в малых концентрациях и избежать накопления остаточных количеств вредных веществ в продуктах питания и внешней среде.

Известен штамм актиномицета Streptomyces griseochromogenae [2] эффективный для борьбы с перикуляриозом риса, но он обладает узким спектром действия.

Описан штамм Streptomyces casugaensis [2] не менее эффективный в борьбе с перикуляриозом риса. Однако, он избирательно подавляет бактерии рода Pseudomonas и не эффективен против других видов грибов.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является актиномицет Streptomyces higroscopicus var. limoneus, эффективный в борьбе с ризоктониозом и перикуляриозом риса [2].

Недостаток этого актиномицета в узком спектре действия. Не выявлена его активность против 300 видов испытанных грибов и бактерий.

Задача изобретения - получение нового штамма актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp., обладающего одновременно фунгицидными, бактерицидными и инсектицидными свойствами.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей, вызывающих следующие заболевания растений: фузариоз и увядание злаковых, масличных и овощных культур; увядание или вилт технических и овощных культур; резиновую и бурую гниль картофеля; корневые гнили злаковых; альтернариоз капусты; гнили плодов и винограда при хранении; аспергиллез и гнили плодов; бактериозы капусты; паршу картофеля. Штамм также обладает инсектицидными свойствами - он вызывает гибель личинок 1 возраста колорадского жука и гибель гусениц Galleria mellonella.

Штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат" под номером ЦКМ B-4561, как фунгицид широкого спектра действия, обладающий бактерицидными, а также инсектицидными свойствами против колорадского жука Leptinotarsa decemlineata и Galleria mellonella.

Предлагаемый штамм Streptomyces hygroscopicus subsp отличается от штамма - прототипа Streptomyces hygroscopicus var.limoneus антагонистическими и антибиотическими свойствами. Он обладает широким спектром действия на фитопатогенные микроорганизмы и проявляет инсектицидную активность. Продуцируемый им комплекс антибиотиков отличается от прототипа - антибиотика валидамицина.

Штамм Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 выделен из почвенных образцов Центрального региона России, идентифицирован по "Определителю актиномицетов" авторов Г.Ф.Гаузе, Т.П.Преображенская и “Краткому определителю бактерий Берги” [3, 4].

Культурально-морфологические свойства:

Штамм Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 имеет хорошо развитый субстратный и воздушный мицелий. Тонкие ценоцитные гифы диаметром 1,0-2,0 мкм. Воздушный мицелий в зрелом состоянии образует цепочки из трех или более спор 0,5-2,0 мкм в диаметре. Культура грамположительная. При выделении колонии небольшие (2-5 мм), обособленные, лишайниковидные; вначале поверхность относительно гладкая, но позднее образуется дымчатого цвета воздушный мицелий, который становится зернистым и легко превращается в порошок. Цвет зрелого спорулирующего воздушного мицелия серый, который на минеральном агаре 1 становится черным благодаря увлажнению и автолизу воздушного мицелия.

Морфология цепочек спор: цепочки спор в форме крючков, незамкнутых петель. Споры гладкие, овальной формы.

Минеральный агар 1: Воздушный мицелий (ВМ) серый, со временем поверхность становится черной благодаря увлажнению воздушного мицелия. Субстратный мицелий (СМ) светло-желтый; растворимый пигмент (РП) отсутствует. Колонии приподняты над агаром с волнистыми краями, мучнистые.

Глицерин-нитратный и овсяной агар:

ВМ серый с белыми краями; СМ кремовый; РП отсутствует. Колонии приподнятые с ровными краями, матовые до 2 мм в диаметре.

Органический агар2:

ВМ слабо развит беловатого цвета; СМ розовато-бежевого цвета; РП нет. Колонии складчатые диаметр 1-2 мм.

Меланоидные пигменты на пептонно-дрожжевом агаре с железом, на тирозиновом агаре и на дрожжевой среде с пептоном не образует.

Культура размножается путем прорастания спор воздушного мицелия или его фрагментов.

Физиолого-биохимические свойства:

Штамм Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 утилизирует следующие углеводы: глюкозу, арабинозу, сахарозу, рамнозу, галактозу, маннит, сорбит; не усваивает инозит, целлобиозу и ксилозу. Обладает протеолитической активностью. Не проявляет амилолитической и лецитиназной активности. Восстанавливает нитраты до нитритов.

Штамм устойчив к антибиотикам: рифампицину, метициллину, левомицетину, ампицилину, бензилпенициллину, слабо чувствителен к полимиксину; доксициклину, чувствителен к гентамицину, стрептомицину, тетрациклину, мономицину, цефаклору, амикацину, канамицину, ристомицину.

Подготовка посевного материала: штамм актиномицета выращивают в пробирках на среде с овсяным агаром. После пятисуточного выращивания в термостате при температуре 28°С методом микроскопии определяют чистоту и однородность культуры. С целью оценки антибиотической активности штамм выращивали на жидких средах различного состава. Была подобрана среда оптимальная для роста и проявления антагонистической и антибиотической активности культуры [5].

Биологическая активность:

Штамм Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 является антагонистом следующих видов фитопатогенных грибов и бактерий: представители рода Fusarium: Fus.graminearum, Fus.solani, Fus. oxysporum, Fus. Moniliforme, вызывающие фузариоз корневые гнили и увядание злаковых, масличных и овощных культур; Verticillium dahliae - увядание или вилт технических и овощных культур; Oospora lactis - резиновую гниль картофеля; Helminthosporium sativum - корневые гнили злаковых; Alternaria brassicae - альтернариоз капусты; Penicillium marfensi, Pen.purpurogenum -гнили плодов и винограда при хранении; Aspergillus niger - аспергиллез хлопчатника и гнили плодов; Ervinia carotovora pv. Carotovora - бактериозы капусты, Е. carotovora pv. chysanthemi - бурую гниль картофеля; Actinomyces scabies - паршу картофеля.

Штамм обладает инсектицидными свойствами - он вызывает гибель личинок 1 возраста колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata и гибель гусениц Galleria mellonella.

Проведена токсикологическая проверка штамма Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 и сделано заключение о патогенности его на теплокровных животных. В соответствии с Методическими указаниями N2620-82 и N4263-87 штамм B-4561 Streptomyces hygroscopicus subsp. не вирулентен, малотоксичный, малотоксигенный, относится к не патогенным штаммам для теплокровных животных - четвертому классу опасности.

Технологические свойства:

Гетеротроф. Обмен в высшей степени окислительный. В опытах по сбраживанию - кислоты не выявляются. Аэроб. При глубинном культивировании растет до образования пучков гиф, образующих мелкие комочки. Культура может расти при температуре от 28 до 37°С. Оптимальная температура роста при глубинном культивировании 28-30°C. Оптимум рН для роста 7.2. Время культивирования 115-120 часов.

Культура актиномицета поддерживается на косяках с овсяным агаром:

Овсяная мука 20,0 г

Агар микробиологический 20,0 г

Питьевая вода До 1,0 л

Рекомендуемый способ хранения: актиномицет Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 хранят на скошенном овсяном агаре в биологических пробирках или на чашках, края которых закрыты скочем при температуре +4°С в течение 3-4 месяцев; в лиофилизированном виде в запаянных ампулах с защитной сахарозожелатиновой средой.

Пример 1. Культивирование штамма и изучение его антагонистических свойств.

Штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 выращивают на твердой среде в биологических пробирках с овсяным агаром при температуре 28°С в течение 5 суток. Подготовленный посевной материал смывают стерильной водой или физиологическим раствором. Полученную суспензию вносят в качалочные колбы с жидкой питательной средой объемом 50 мл и помещают на качалку при температуре 28°С, количество оборотов мешалки равно 240 об/мин.

Для глубинного культивирования используется питательная среда, содержащая органические компоненты:

Соевая мука 10,0 г

БВК 5,0 г

Кукурузный экстракт 3,0 мл

Мел 2,0-3,0 г

Вода дистиллированная До 1000 мл

рН 7,2

Время культивирования 120 часов.

Проверку чистоты культуры и ее спорообразование проводили методом микроскопии.

Антагонистическая активность полученных партий культуральной жидкости штамма актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 определяли методом диффузии в агар лунок. Биотестирование проводили на большом наборе тест-культур фитопатогенных микроорганизмов. Данные по антагонистической активности штамма Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 приведены в таблице 1.

Результаты биотестирования культуральной жидкости штамма показаны на чертеже. Зоны подавления роста тест-культур определяются диаметром негативной зоны в мм.

Наибольшая биологическая активность предлагаемого штамма отмечена по отношению фитопатогенных грибов, вызывающих паршу картофеля; фузариозы и корневые гнили злаковых и овощных культур; гнили овощных и плодовых при хранении; увядание, гоммоз технических культур; аспергеллез, альтернариоз овощных, плодовых культур. Высокая активность наблюдается и в отношении бактериальных возбудителей, вызывающих бактериозы и гнили овощных культур.

Пример 2. Проверка биологической активности актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. штамма В-4561 на личинках колорадского жука, Leptinotarsa decemlineata.

Для испытаний готовили суспензии культуральной жидкости штамма в физиологическом растворе в концентрациях 10, 2, 0,4%. В контрольном опыте использовали чистый физиологический раствор. В опытах использовали личинок колорадского жука первого возраста через сутки после от рождения их из кладок, собранных в природе. Каждую концентрацию культуральной жидкости испытывали в двух повторностях. Для проведения опыта в чашку Петри помещали лист картофеля, смоченный суспензией культуральной жидкости (концентрации указаны выше), и 10 личинок жука. Чашки выдерживали при температуре 28°С. Учет гибели личинок производили через 2 и 4 суток, отдельно для каждой концентрации. Биологическую активность штамма, выраженную в ЛК₅₀, вычисляли по формуле Кербера в процентах концентрации культуральной жидкости (КЖ) в суспензии:

lgЛК₅₀=lgCм-s(SL-0,5),

где См - максимальная из испытанных концентраций;

s - логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведения);

SL - сумма значений L (доли погибших личинок от числа испытуемых), найденных для всех концентраций с учетом поправки на гибель в контроле по методу Аббота:

L=(ро-рк):(1-рк),

где ро - доля погибших личинок при испытании культуры; рк - доля погибших личинок в контрольном опыте.

Количества погибших и выживших личинок указаны в числителе и знаменателе соответственно.

На основании полученных результатов по формуле Кербера рассчитали значение ЛК₅₀ (концентрации, при которой наблюдается 50%-ная гибель личинок). Значение ЛК₅₀ для штамма Streptomyces hygroscopicus subsp.sp. B-4561: по отношению к личинкам колорадского жука Leptinotarsa decemlineata составляет 1,5%.

Пример 3. Действие штамма B-4561 на гусениц Galleria mellonella (отряд Lepidoptera).

Испытывали действие культуральной жидкости (КЖ) в концентрации 100% на гусеницах 4 возраста. Суспензию КЖ указанной концентрации перемешивали с приготовленным искусственным кормом в соотношении 2 мл суспензии на 10 г корма и раскладывали поровну в чашки Петри. В каждую чашку помещали по 10 гусениц. В контрольный опыт вместо КЖ добавляли питьевую воду. Чашки с гусеницами выдерживали при температуре 28°С. Количество погибших гусениц подсчитывали на 5-е сутки. Гибель гусениц по отношению контрольного опыта составляла 30%. Кроме того в опыте наблюдалось замедленное развитие гусениц по сравнению с контролем.

Пример 4. Испытание штамма актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 против комплекса болезней картофеля.

Схема опыта:

1. Предпосевная обработка клубней картофеля;

2. Двукратная обработка вегетирующих растений с интервалом в 10 дней.

Испытания проводили на сорте Санте в 2-кратной повторности по 100 кустов в каждой, по методике НИИКХ. Разведение культуральной жидкости штамма Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561 осуществляли в соотношении 1:5. В контроле клубни не обрабатывались. Эталоном служил биопрепарат крезацин.

Фенологические наблюдения проводились по методике НИИКХ.

Распространенность болезней рассчитывали по формуле:

Р=n·100/N,

где Р - распространенность болезней, %;

n - количество больных растений, шт.;

N - общее количество растений в пробах, шт.

Степень развития болезней рассчитывали по формуле:

R=E·(a+b)/(N·K)·100

R - развитие болезней, %;

Е - (а+b) - сумма произведений количества больных растений, клубней, (а) на соответствующий балл поражения (b);

N - общее количество учетных растений;

К - наибольший балл шкалы учета.

Результаты полевых испытаний представлены в таблицах.

В условиях испытуемого года распространение на картофеле болезни альтернариозом было сильным в течение всей вегетации, а развитие фитотфторозом - во второй половине вегетационного периода.

Данные учета представлены в таблицах 3-4.

Как видно из таблицы при первом учете при обработке растений КЖ распространенность и развитие болезни находились на уровне эталонного варианта, при последующих учетах развитие альтернариоза снизилось по сравнению с контролем в 1,5 раза и незначительно уступал эталонному варианту.

Как видно из таблицы при втором и третьем учетах степень развития болезни была в три раза меньше по сравнению с контролем. Так на 14 августа степень развития фитофтороза в опытном варианте составила 12.0%, в контроле 33.6%а, в эталонном варианте - 5.9%.

Количество больных клубней в варианте с обработкой клубней и растений КЖ штамма В-4561 значительно меньше в сравнении с контролем и эталоном. Штамм активно подавляет альтерианиоз и фитофтофтороз на растениях во время вегетации и в некоторой степени подавляет гнили клубней при хранении, поэтому урожай здоровых клубней на 9% выше контрольного варианта.

Источники информации

1. Второй Всесоюзный семинар "Актуальные направления поиска антибиотиков", Алма-Ата, 1989 г.

2. М.Т. Петрухина. Использование антибиотиков в борьбе с болезнями растений. Информационный бюллетень ВПС МОББ №12 Ленинград, 1985 г., стр. 26.

3. Г.Ф. Гаузе, Т.П. Преображенская, М.А. Свешникова, Л.П. Терехова, Т.С. Максимова. Определитель актиномицетов. М.: Наука, 1983 г., стр. 43.

4. Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир 1980 г.

5. Д.Н. Черменский. Авермектины: биотехнологические особенности штамма-продуцента Str.avermitilis BKM Ac 1301." Прикладная биохимия и микробиология. 1991. т.27, вып.6, стр. 838-844.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в качестве средства для защиты растений от болезней и вредителей. Штамм Streptomyces hygroscopicus subsp. 24 депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Государственного концерна “Биопрепарат” под номером ЦКМ В-4561, выделен из почвенных образцов Центрального региона России. Данный штамм обладает широким спектром действия на фитопатогенные микроорганизмы и проявляет инсектицидные свойства, вызывая гибель личинок 1 возраста колорадского жука Leptinotarsa decemlineata и гусениц Galleria mellonella. Штамм проявляет наибольшую биологическую активность. 5 табл., 1 ил.

Штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp., депонированный в Центральной коллекции микроорганизмов Государственного концерна “Биопрепарат” под номером ЦКМ В-4561, обладающий фунгицидными, бактериальными и инсектицидными свойствами.