ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 2001 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений.

Одним из основных источников возбудителей болезней растений является почва, в которой развиваются и сохраняются в виде спор фитопатогенные грибы, такие как Fusarium, Helminthosporium, Rhisoctonia, Pythium, Sclerotium, Alternaria, Verticillium. Для борьбы с почвенными патогенами используются главным образом химические фунгициды. Однако интенсивное использование химических препаратов приводит к экологическим нарушениям, к появлению более устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов и к другим нежелательным последствиям.

Все шире в практике сельскохозяйственного производства используется интегрированная система защиты растений, которая включает использование биологических препаратов, в том числе на основе антагонистов, подавляющих рост фитопатогенов.

Известен штамм Trichoderma harzianum, который обладает высокой биологической активностью против Sclerotium rolfsii, вызывающей корневые гнили овощных культур (1). Однако он эффективен против возбудителей болезней только овощных культур. Известен также штамм Trichoderma harzianum, который подавляет рост патогенов, вызывающих серую гниль виноградников и млечный блеск плодовых деревьев (2). Недостатком этого штамма является то, что он активен только против возбудителей болезней виноградников и плодовых деревьев.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Trichoderma viride-AL, эффективный против возбудителей болезней ячменя, овса, ржи, пшеницы, свеклы и картофеля (3). Его недостатком является также узкий спектр антагонистической активности.

Известен препарат Триходермин-10, сухой порошок, рекомендуемый против корневых и стеблевых гнилей овощных и зерновых культур, а также хлопчатника (3). Препарат изготавливают, наращивая биомассу гриба на твердом носителе (зерне, торфе, соломе) в течение длительного времени (до 14 суток). Недостатком этого препарата является неудобная товарная форма, так как, если необходима аэрозольная обработка (полив вегетирующих растений), перед применением необходимо смывать споры гриба с носителя водой.

Известен препарат на основе штамма Trichoderma harzianum, имеющий коммерческое название Фиор II, который используют для защиты виноградников и плодовых деревьев от некоторых болезней, вызываемых грибными патогенами (3). Препарат представляет собой споровую массу гриба и продуцируемые грибом пептиды. Получают препарат, культивируя гриб в жидкой среде, разлив ее тонким слоем на подносы, до полного созревания спор. Затем всю биомассу высушивают, тонко размалывают и просеивают. Порошок содержит живые споры, хорошо растворяется в воде, однако такой способ производства длителен по времени и трудоемок.

Известен жидкий препарат на основе Trichoderma viride-AL (3). Препарат представлен мицелиальной формой гриба, которая более эффективна при применении за счет лучшей приживаемости, чем конидиальная. В качестве препарата использовали культуральную жидкость, которая эффективно защищала ячмень, овес, рожь, пшеницу, свеклу и картофель от корневых и стеблевых гнилей. Однако недостатком этого препарата является отсутствие товарной формы, что не позволяет обеспечить хранение препарата.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является пастообразный препарат на основе гриба Trichoderma harzianum, используемый для борьбы с аскохитозом, белой и черной стеблевыми гнилями огурцов и томатов (4). Препарат готовят, выращивая биомассу на твердом субстрате (зерна ячменя, пшеницы) в течение 5-7 сут, затем сушат и размалывают. Для приготовления пасты в 3-5% раствор прилипателя, в качестве которого используется карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), добавляют 30-50 мас. % сухой размолотой биомассы гриба. КМЦ в этом препарате улучшает спороношение гриба и его приживаемость после нанесения на стебли, стимулирует рост гриба, а также всхожесть семян и развитие проростков огурцов и томатов. Недостатками этого препарата являются многостадийность, длительный срок и трудоемкость его приготовления.

Задачей изобретения является получение штамма Trichoderma viride Pers ex S. F.Gray, обладающего антагонистической активностью против широкого спектра грибных возбудителей болезней и использование этого штамма для защиты растений от болезней.

Задача решается тем, что предложен штамм гриба Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16, высоко активный против широкого спектра грибных патогенов, и на его основе получают препарат, содержащий мас.%:
Биомасса штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 - 85-92
Карбоксиметилцеллюлоза - 3-5
Соли магния - 5-10
Препарат обладает антагонистической активностью против возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.

Штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray выделен из почв Московской области в 1991 году. С природным штаммом была проведена селекция по признаку продуктивности и гиперпаразитической активности против возбудителей различных болезней. Выбранный активный клон описан как штамм Trichoderma viride Pers ex S. F.Gray под номером 16. Штамм депонирован Центральной коллекцией микроорганизмов Государственного концерна "БИОПРЕПАРАТ" (ЦКМК "Б") регистрационный номер - ЦКМ F-59M.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 является сапрофитным грибом зеленой окраски, в природе находится в почве и на мертвой древесине. Хорошо растет на стандартных средах (Чапека, картофельно-декстрозном агаре, сусло-агаре). На стандартной среде Чапека через 5 сут гриб в виде темно-зеленого газона покрывает всю чашку Петри. Поверхность колоний клочковатая, в центре окраска темно-зеленая, постепенно светлеющая к периферии до белой. Цвет обратной стороны серовато-зеленый. Конидиеносцы гладкие, ветвящиеся в виде рыхлых пучков. На протяжении конидиеносцев и веточек располагаются фиалиды в виде мутовок. Фиалиды прямые или слегка согнутые оканчиваются шейкой, образующей шаровидные головки из конидий. Конидии широко овальные, 3,6-4,5 мкм в диаметре, шиповатые.

На сусло-агаре гриб образует войлочные колонии белого цвета, которые в течение 3-х дней достигают размера 80х80 мм. Спороношение наблюдается на третий день роста и развитие мицелия достигает максимума на 5-е сутки. К этому сроку колонии гриба приобретают зеленый цвет. Цвет обратной стороны беловато-зеленый.

В зависимости от состава питательной среды и условий культивирования гриб может образовывать глубинные конидии и хламидоспоры.

Оптимальной температурой роста является 30^oC. Однако штамм растет в широком диапазоне температур от 20 до 35^oC. При 5 и 40^oC споры прорастают, но мицелий не развивается, спороношение отсутствует.

Предлагаемый штамм растет в интервале значений pH от 2,5 до 9,5. Оптимальное значение pH - 5,5-6,5. В более кислых условиях (pH 2,5 - 5,0) и в более щелочных (pH 7,0 - 9,5) изменяются морфологические характеристики культуры: замедлено спорообразование, структура поверхности газона становится крупинчатой (при щелочных pH) или крупно-клочковатой (при кислых значениях pH).

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает глюкозу, глицерин, сахарозу. Может расти на средах, содержащих галактозу, лактозу, мальтозу, крахмал. Не усваивает целлюлозу и хитин.

Отношение к источникам азота. Усваивает аммонийные формы азота и органический азот аминокислот, Восстанавливает нитраты.

Биологическая активность.

Штамм Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 обладает высокой гиперпаразитической активностью против широкого спектра возбудителей болезней растений, относящихся к родам Fusarium, Helminthosporium, Rhisoctonia, Pythium, Sclerotium, Alternaria, Verticillium. Эти грибные патогены вызывают такие заболевания растений, как фузариоз колоса и гельминтоспориоз зерновых культур, гнили и плесени столового винограда при хранении, гнили картофеля.

Гриб штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 действует на патогенные грибы, охватывая своими гифами их мицелий и затем проникая внутрь путем энзиматического лизиса.

Предлагаемый штамм устойчив к антибиотикам: ристомицину, бензилпенициллину, тетрациклину, левомицетину, неомицину, стрептомицину, гентамицину, полимиксину, ампициллину.

Штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 обладает устойчивостью к химическим инсектицидам карбафосу, висметрину, талстару, апплауду, а также к фунгицидам, которые ограничивают рост фитопатогенных грибов: ТМТД, байтану, байлетону.

Высокая степень устойчивости к химическим пестицидам позволяет использовать предлагаемый штамм в интегрированной системе защиты растений совместно с химическими препаратами.

Штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 безвреден, нетоксичен для теплокровных животных.

Биотехнологическая характеристика.

При глубинном культивировании на разных средах (синтетические, органические, органо-синтетические) выход биомассы составляет от 16 до 60 г/дм³.

Через 20 часов культивирования в жидкой питательной среде 90-100% всех поверхностных конидий, внесенных в среду, прорастают. Мицелий представляет собой в это время тонкие прозрачные несептированные гифы. Через 35-40 часов культура гриба представляет собой созревший мицелий, который становится зернистым, образуются глубинные конидии и хламидоспоры. Оболочки клеток утолщаются, начинают образовываться интеркалярные (внутренние) и терминальные (конечные) хламидоспоры, которые созревают к 40-50 часу. Интеркалярные споры соединены по 3-5 штук вместе, имеют овально-продолговатую форму. Терминальные хламидоспоры - одиночные, округлые. Через 40-50 часов начинается лизис мицелия.

Глубинные конидии начинают прорастать через 12 часов, к 21 часу практически все конидии прорастают. Хламидоспоры так же, как поверхностные конидии, начинают прорастать позже - только через 16 -18 часов.

Глубинные конидии менее устойчивы к повышенной температуре. Они не выдерживают прогревание при 60^oC даже в течение 5 мин. Прогревание при 50^oC в течение 10 мин сохраняет жизнеспособными только отдельные конидии. При 40^oC прорастаемость конидий зависит от времени обработки: чем дольше, тем больше гибельное воздействие температуры.

Пример 1. Штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray выделен из почвы, зараженной грибами рода Fusarium.

Образцы земли в количестве 1 грамм суспендировали в 100 граммах воды и гомогенизировали при 400 об./мин. После осаждения частиц почвы порции супернатанта разводили серией стерильного физиологического раствора. 0,1 мл этих серийных разведений высевали на чашки Петри со средой Чапека или картофельно-декстрозного агара. Полученные чистые клоны грибов рода Trichoderma оценивали по их антагонистической активности против различных штаммов фитопатогенных грибов (тест-объектов) методом "встречных культур". Для этого на плотной питательной среде (Чапека или картофельном агаре) петлей параллельно друг другу на расстоянии 2 см от диаметра чашки Петри засевали исследуемые штаммы и тест-объект. Чашки выдерживали в термостате при температуре 28^oC в течение 7 суток. Затем оценивали визуально площадь, занимаемую каждой культурой. Если штамм Trichoderma занимал больше половины чашки Петри, он считался активным по отношению к тест-объекту.

Наиболее активный штамм был определен как штамм Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16.

Пример 2. Культивирование штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 в жидкой среде.

3-5 миллионов поверхностных конидий гриба помещают в колбы объемом 750 мл с 150 мл органо-синтетической среды следующего состава (на 1 л среды):
Сернокислотный гидролизат БВК - 70 мл;
Глицерин - 30 мл
Двузамещенный фосфат калия - 0,5 г
Однозамещенный фосфат калия - 0,5г
Сернокислый магний 7-водный - 0,25 г
Сернокислый аммоний - 3,0 г
Вода питьевая - До 1 л
Культивируют на качалке при 180 об./мин при 30^oC в течение 40-60 часов. В регулярно отбираемых пробах культуральной жидкости контролируют значение pH и сухой вес биомассы гриба. Через 20 часов культивирования в жидкой питательной среде 90-100% всех поверхностных конидий, внесенных в среду, прорастают. Мицелий представляет собой в это время тонкие прозрачные несептированные гифы. Через 35-40 часов культура гриба представляет собой созревший мицелий, который становится зернистым, образуются глубинные конидии и хламидоспоры. При микроскопировании культура гриба в этот период представлена в основном мицелием, содержащим до 10% хламидоспор. pH при этом снижается с 6,9 до 2,5. Максимальный выход биомассы наблюдается к 40 часам культивирования и составляет 68 г/л. Биомассу гриба получают, отделяя остатки питательной среды сепарированием.

Пример 3. Изучение антагонистической активности штамма Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16.

Антагонистическую активность штамма Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 определяли методом "встречных культур", как описано в примере 1.

Клетки гриба штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 обладают высокой антагонистической активностью к широкому спектру грибных фитопатогенов, относящихся к родам Fusarium, Rhizoctonia, Helminthosporium, Colletotrichum, Alternaria, Sclerotinia, Verticillium, Botrytis, Phytophtora, Actinomyces, Cladosporium, Aspergillus, Risopus, Epicoccum и Penicillium (таблицы 1-4). Эти патогены являются возбудителями болезней зерновых культур, в частности фузариоза колоса и корневых гнилей. Характеристика поражений в таблицах 1, 2, 3 и 4 дана по Отраслевому классификатору вредителей болезней с/х культур, разработанному Центральным институтом Агрохимического обслуживания сельского хозяйства.

Таким образом, штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 обладает высокой гиперпаразитической активностью к широкому спектру грибных патогенов, относящихся к родам Fusarium, Rhizoctonia, Helminthosporium, Colletotrichum, Alternaria, Sclerotinia, Verticillium, Botrytis, Phytophtora, Actinomyces, Cladosporium, Aspergillus, Risopus, Epicoccum и Penicillium.

Пример 4. Изучение совместимости штамма Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 с химическими пестицидами.

Совместимость штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 с химическими пестицидами изучали, выращивая гриб при посеве уколом в центр чашки Петри со средой Чапека, в которую добавлены химические пестициды в концентрациях, используемых в полевых условиях (таблица 5).

Как видно из таблицы 5, штамм Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 совместим со всеми вышеперечисленными химическими пестицидами в концентрациях, рекомендованных для применения. Карбафос, висметрин и талстар слегка задерживают рост культуры гриба.

Пример 5. Получение препарата на основе штамма Trichoderma viridePers ex S. F.Gray 16.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют натриевую соль карбоксиметил целлюлозы (КМЦ) в качестве прилипателя в количестве 5% от объема биомассы и прокаленный хлористый магний (стабилизатор) в количестве 10%. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на сутки для разбухания целлюлозы. Массу периодически перемешивают. Препарат имеет следующий состав мас.%:
Биомасса штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 - 85
КМЦ - 5
Хлористый магний - 10
Полученный таким образом препарат на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S. F. Gray 16 может храниться до 3-х месяцев при температуре +15 - +30^oC и до 6-ти месяцев при +4^oC. Влияние состава препарата на сохранение биологической активности гриба приведены в таблице 6.

Как следует из данных табл. 6, КМЦ способствует сохранению биологической активности препарата.

Пример 6. Получение препарата на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16.

К биомассе, полученной, как описано в примере 2, добавляют КМЦ (прилипатель) в количестве 3% от объема биомассы и прокаленный сульфат магния (стабилизатор) в количестве 5%. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на сутки для разбухания целлюлозы. Массу периодически перемешивают. Препарат имеет следующий состав мас.%:
Биомасса штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 - 92
КМЦ - 3
Сульфат магния - 5
Полученный таким образом препарат на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S. F. Gray 16 может храниться до 3-х месяцев при температуре +15 - +30^oC и до 6-ти месяцев при +4^oC.

Пример 7. Испытания фунгицидной активности препарата на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16.

Препарат на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 был приготовлен, как описано в примере 5. Эффективность его оценивали путем предпосевной обработки семян ярового ячменя сортов Абава и Прима против корневых гнилей, вызываемых грибами родов Fusarium и Helminthosporium. Испытания проводили на делянках площадью 10 м² и 25 м² опытных полей ВНИИ сельскохозяйственного использования мелиоративных земель и Белорусского института защиты растений. Опыты проводили в 4-х кратной повторности. Результаты приведены в таблицах 6 и 7, 8.

Обработка семян препаратом на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16 способствовала снижению семенной инфекции грибов родов Fusarium, Helminthosporium на уровне химических протравителей фенорама и байтана. Отмечено биостимулирующее действие препарата (более высокая кустистость продуктивных стеблей и число зерен в колосе). Благодаря большему количеству продуктивных стеблей на 1 м² прибавка урожая по отношению к контролю составила 3,5 ц/га, что на 1,8 ц/га больше, чем у химического протравителя.

Таким образом, на основе штамма Trichoderma viride Pers ex S.F.Gray 16, обладающего антагонистической активностью к широкому спектру грибных возбудителей болезней (относящихся к родам Fusarium, Rhizoctonia, Helminthosporium, Colletotrichum, Alternaria, Sclerotinia, Verticillium, Botrytis, Phytophtora, Actinomyces, Cladosporium, Aspergillus, Risopus, Epicoccum и Penicillium) получен препарат, эффективный против болезней растений. Препарат может храниться до 3-х месяцев при температуре +15 - +30^oC и до 6-ти месяцев при +40^oC. Препарат совместим с химическими пестицидами (ТМТД, Байлетон, Байтан, Карбафос, Висметрин, Талстар, Апплауд) в концентрациях, рекомендуемых для применения. Препарат можно применять путем предпосевной обработки семян зерновых культур в дозе 15-30 грамм на тонну семян.

Источники информации
1. Wells H.D., Bell D.K., Jaworski C.A. Efficacy of Trichoderma harzianum as a biocontrol Sclerotium rolfsii, Phytopathology, 62, 442, 1972.

2. Патент Франция N 2545099, C 12 N 1/14. Новый штамм Trichoderma harzianum, способ его выделения и культивирования, пептиды, продуцируемые этим штаммом, и применение штамма и новых пептидов или продуктов, полученных в процессе культивирования, как средство биологической борьбы в форме фитосанитарных препаратов - 1984.

3. Апсите А.Ф., Швинка Ю.Э., Стрикауска С.В., Виестурс У.Э., Лисовска А. Я. , Бичевскис Е.Я., Свока И.М., Беника Р.Г. Использование триходермина для защиты растений от фитопатогенных микромицетов, Вест. с.-х. науки N 9(397), с. 114-118, 1989.

4. Патент РФ N 2094991, A 01 N 63/04, A 01 G 7/00. Способ защиты растений огурца и томата от фитопатогенов.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений. Препарат для защиты растений против болезней содержит, мас.%: биомассу штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 ЦКМ F-59М 80-90; микрокристаллическую целлюлозу 5-10; соли магния 5-10. Препарат обладает антагонистической активностью против широкого спектра возбудителей болезней сельскохозяйственных культур и может применяться совместно с химическими пестицидами. 8 табл.

Препарат для защиты растений от болезней, содержащий активное начало на основе штамма гриба Trichoderma и карбоксиметилцеллюлозу, отличающийся тем, что он дополнительно содержит соли магния, а в качестве активного начала - биомассу штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 ЦКМ F-59M при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Биомасса штамма гриба Trichoderma viride Pers ex S.F. Gray 16 ЦКМ F-59M - 85 - 92
Карбоксиметилцеллюлоза - 3 - 5
Соли магния - 5 - 10и