Штамм бактерий Streptomyces hygroscopicus Ac-2158 для получения биопрепарата против возбудителей грибных болезней сои Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к штамму Streptomyces hygroscopicus Ас-2158, обладающему выраженными фунгицидными и ростостимулирующими свойствами, который может быть использован для получения средств защиты сои от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и грибоподобными протистами, стимуляции роста и повышения урожайности сои.

Представители рода Streptomyces в настоящее время рассматриваются как одни из наиболее перспективных бактерий для биологической защиты сельскохозяйственных растений от болезней, однако отмечается, что потенциал p.Streptomyces в качестве средства защиты растений далеко не раскрыт.Одной из ключевых проблем является необходимость поиска штаммов, адаптированных к конкретным почвенно-климатическим условиям и к конкретным сельскохозяйственным культурам (см. ст.Pacios-Michelena S, Aguilar Gonzalez CN, Alvarez-Perez OB, Rodriguez-Herrera R, Chavez-Gonzalez M, Arredondo Valdes R, Ascacio Valdes JA, Govea Salas M and Ilyina A (2021) Application of Streptomyces Antimicrobial Compounds for the Control of Phytopathogens. Front. Sustain. Food Syst. 5:696518. doi:10.3389/fsufs.2021.696518).

Известен штамм Streptomyces felleus 8 ВИЗР для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов (см. патент RU 2052501 С1, публикация 1996 г.). Недостатком данного штамма является отсутствие доказанной эффективности в защите сои от грибных болезней, поскольку эксперименты выполнялись на огурцах, астрах, пшенице и крыжовнике.

Известен штамм Streptomyces lydicus WYEC 108 для защиты растений от грибной инфекции (см. патент RU 2127521 С1, публикация 1999 г.). Недостатком данного штамма является использование сложной технологии для приготовления препаративной формы, а также отсутствие доказанной эффективности в защите сои от грибных болезней, поскольку эксперименты выполнялись на турецком горохе и перце.

Известен штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-m, используемый для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria (см. патент RU 2261902 С2, публикация 2005 г.). Недостатком данного штамма является то, что он не предназначен для защиты сельскохозяйственных культур от грибных болезней.

Известен штамм бактерий Streptomyces resistomycificus sRECB-31 для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности (см. патент RU 2737140 С1, публикация 2020 г.) Недостатками данного штамма является то, что лабораторная оценка его эффективности проводилась на семенах яровой пшеницы и ярового рапса, а полевая - на посевах ярового ячменя и ярового рапса, то есть отсутствует доказанная эффективность против грибных болезней сои.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм

Streptomyces hygroscopicus subsp.В-4561, обладающий фунгицидными, бактерицидными и инсектицидными свойствами (см. патент RU 2243259 С2, публикация 2004 г). Недостатками штамма Streptomyces hygroscopicus subsp. В-4561, взятого за прототип, являются:

1. Отсутствие доказанной эффективности против комплекса грибных болезней сои, поскольку полевые испытания проводились на картофеле.

2. Необходимость трехкратной обработки растений: предпосевная обработка и двукратная обработка в течение вегетации.

Технической задачей заявляемого изобретения является выделение штамма, при однократной обработке семенного материала обеспечивающего прибавку урожая сои за счет снижения интенсивности развития грибных болезней, и не оказывающего негативного влияния на нодуляцию.

Технический результат - прибавка урожая сои за счет снижения интенсивности развития грибных болезней с помощью заявляемого штамма при однократной обработке семенного материала суспензией спор штамма с титром 10⁷ на 1 мл из расчета 10 л суспензии на 1 т семян.

Он достигается тем, что заявляемый штамм Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 предлагается в качестве средства для защиты сои от фитопатогенных грибов и грибоподобных протистов. Новый штамм выделен из почвы учебно-научного комплекса (УНПК) «Борский» ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ (Сухобузимский район Красноярского края, тип почвы - комплекс черноземов выщелоченных мало-, среднемощных тяжелосуглинистого гранулометрического состава) и депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, г. Москва, под регистрационным номером Ас-2158. Идентификация штамма проводилась с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Грамположительные аэробные актинобактерии. Подвижные стадии не выявлены. Споры - овальные, 1,4-1,8×0,9-1,2 мкм, формируются в закрученных спорангиях. Мицелий хорошо развитый, ветвящийся, субстратный и воздушный; толщина гиф варьирует от 0,8 до 1,7 мкм. На среде №2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ в разведении 1:1 и на среде Чапека-Докса с содержанием агара в обоих случаях 15-20 г/л колонии - белые, морщинистые, плотные, врастающие в агар, с бархатисто-мучнистой поверхностью за счет развития воздушного мицелия, диаметром до 10-12 мм. На агаризованной среде с пептоном (20 г/л) производства ФБУН ГНЦ ПМБ рост скудный, диаметр колоний не превышает 5 мм, профиль колоний - плоский, воздушный мицелий с органами спороношения не образуется. На среде №2 ГРМ (Сабуро) в разведении 1:1 и на среде Чапека-Докса на поверхности колоний образуются капли экссудата. Оптимальная температура культивирования +26…+29°С.

Чистая культура штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 хранится в пробирках на агаризованной среде №2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ в разведении 1:1 либо на среде Чапека-Докса при температуре+4..+10°С с пересевами 1 раз в 12 месяцев.

Пример 1. Изучение антифунгальной активности заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158.

Проверку антифунгальной активности in vitro штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 проводили методом совместного культивирования по наличию и размеру зоны подавления роста тест-культуры (см. ст.Qi D, Zou L, Zhou D, Chen Y, Gao Z, Feng R, Zhang M, Li K, Xie J and Wang W (2019) Taxonomy and Broad-Spectrum Antifungal Activity of Streptomyces sp.SCA3-4 Isolated From Rhizosphere Soil of Opuntia stricta. Front. Microbiol. 10:1390. doi: 10.3389/fmicb.2019.01390). Установлено, что штамм Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 обладает антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов, а также грибов, вызывающих плесневение семян, из родов Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Fusarium, Alternaria, Bipolaris, Acremonium, Rhizoctonia, Pythium (таблица 1).

Вышеприведенные данные свидетельствуют о широком спектре антифунгальной активности заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158.

Пример 2. Изучение лабораторной эффективности заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 в защите сои от фузариоза в сравнении с химическим протравителем.

Лабораторную эффективность Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 в подавлении развития фузариоза в сравнении с химическим протравителем изучали методом рулонных культур на сое сорта Заряница (скороспелый сорт, оригинаторы - ФГБНУ Омский аграрный научный центр, ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ; регион допуска - Восточно-Сибирский). В эксперименте использовали семена, полученные в УНПК «Борский» и характеризующиеся высоким (свыше 60%) уровнем естественной зараженности фузариозом. Схема эксперимента включала следующие варианты: 1) семена без обработки (контроль); 2) обработка штаммом Streptomyces hygroscopicus Ас-2158; 3) обработка химическим протравителем. В каждом варианте было 4 повторности, по 50 семян в повторности. В качестве химического протравителя использовали препарат "Оплот" (действующие вещества: дифеноконазол - 90 г/л, тебуконазол - 45 г/л) производства АО Фирма "Август", рекомендованный для защиты сои от комплекса грибных болезней (см. "Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации", 2018 год, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России), с. 205), обработку семян проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Бактеризацию проводили водной суспензией спор Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 с титром 10⁸ спор на мл, полученной смывом с колоний, выращенных на агаризованной среде, из расчета 1 мл суспензии на 100 г семян, что соответствует стандартному расходу 10 л на тонну при обработке семян в полевых условиях.

Учет распространенности фузариоза проводили в соответствии с Межгосударственным стандартом ГОСТ 12044-93 "Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями". Распространенность фузариоза вычисляли как выраженное в процентах отношение растений с признаками заболевания к общему числу растений. Кроме распространенности фузариоза, учитывали длину надземной части проростков сои. Значимость различий по распространенности фузариоза между вариантами с обработкой и вариантами без обработки проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2×2.

Результаты влияния обработки штаммом Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 в сравнении с химическим препаратом "Оплот" на распространенность фузариоза в эксперименте на проростках сои представлены в таблице 2.

Вышеприведенные данные свидетельствуют о высокой (сопоставимой с эффективностью химического протравителя) эффективности заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 в защите сои от фузариоза в лабораторных условиях, при этом снижение распространенности фузариоза за счет обработки заявляемым штаммом Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 в высшей степени статистически значимо (р<0,001).

Пример 3. Изучение влияния заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 на рост проростков сои.

Изучение влияния заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 на рост проростков сои проводили методом рулонных культур в эксперименте, описанном в Примере 2. Анализ результатов показал, что обработка заявляемым штаммом Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 к статистически значимому (р<0,01) увеличению длины проростков (таблица 3).

Вышеприведенные данные свидетельствуют об отсутствии у заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 лабораторной фитотоксичности и о наличии у него статистически значимых ростстимулирующих свойств.

Пример 4. Изучение влияния заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 на интенсивность развития грибных болезней, нодуляцию, накопление биомассы и урожайность сои в полевых условиях.

Полевые опыты по исследованию влияния штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 на развитие грибных болезней, нодуляцию и урожайность сои выполнены на базе УНПК «Борский» ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ в зернопаропропашном севообороте чистый пар-картофель-соя-яровая пшеница. В качестве тест-культуры использован сорт Эос (скороспелый сорт сои Восточно-Сибирского экотипа, созданный в ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ).

Основная обработка - осеннее плоскорезное рыхление на глубину 15-17 см. Весной выполнено ранневесеннее боронование и предпосевная культивация на глубину 5-6 см КПС-4. Посев сои выполнен 22 мая селекционной сеялкой ССФК-7, рядовым способом с учетом всхожести, чистоты и массы тысячи семян. Коэффициент высева оптимальный для зоны исследования (см. Чураков А. А. Влияние сорта и элементов агротехники на формирование урожайности сои в Красноярской лесостепи: автореф. дис…. канд. с. -х. наук / А. А. Чураков. - Новосибирск, 2009. - 17 с. ) и составил 0,8 млн. всхожих семян на 1 га. После посева выполнено прикатывание кольчато-шпоровыми катками. Для стимулирования нодуляции семена сои обрабатывали аборигенным штаммом ризобактерий, зарекомендовавшим себя в качестве эффективного микросимбионта сорта Эос в полевых опытах, проводившихся в 2019 г. Титр инокулята составлял 1×10⁷ клеток/мл. В опытном варианте семена дополнительно обрабатывали споровой суспензией заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 с титром 1×10⁷ клеток/мл из расчета 10 мл суспензии на 1 кг семян, контролем служили семена без обработки.

Повторность опытов 4-кратная, площадь делянки 6,7 м², размещение делянок - рандомизированное. Полевые опыты, наблюдения за развитием растений выполнены в соответствии с общепринятыми рекомендациями для полевых экспериментов с культурой (см. Коллекция генетических ресурсов зерновых бобовых ВИР: пополнение, сохранение и изучение. Методические указания. [Под ред. д-ра биол. наук М.А. Вишняковой] - СПб, 2010. - 141 с.; Синеговская В.Т. Методы исследований в полевых опытах с соей (Учебно-методическое пособие) / В.Т. Синеговская, Е.Т. Наумченко, Т.П. Кобозева // ФГБНУ ВНИИ сои. - Благовещенск, ООО "ИПК "ОДЕОН", 2016. - 115 с.). Уборку делянок проводили напрямую комбайном «Terrion» в период полной спелости культуры. Семена очищались на ситах с диаметром ячейки 4×20 мм, взвешивались с точностью до 1 г, урожайность приводилась к стандартной влажности 14%.

Влияние заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 на интенсивность развития грибных болезней сои в полевых условиях представлено в таблице 4.

Влияние заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 на высоту, биомассу, нодуляцию и урожайность растений сои на примере сорта Эос в полевых условиях показано в таблице 5.

Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что заявляемый штамм Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 в полевых условиях статистически значимо снижает интенсивность развития комплекса грибных болезней сои, статистически значимо стимулирует рост растений сои, не оказывает статистически значимого негативного влияния на нодуляцию и статистически значимо повышает урожайность сои на 36,2%.

Согласно Постановлению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 №4 "Об утверждении санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" Bacillus atrophaeus не относится к патогенным микроорганизмам, и, следовательно, не представляет опасности для человека.

Таким образом, штамм бактерий Streptomyces hygroscopicus Ас-2158 является новым, пригоден для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов и грибоподобных протистов и расширяет арсенал средств защиты сои от экономически значимых болезней.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению бактериальных штаммов, обладающих фунгицидными и ростстимулирующими свойствами. Предложен штамм бактерий Streptomyces hygroscopicus, депонированный в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов под номером Ас-2158 для получения биопрепарата против широкого спектра грибов и грибоподобных протистов - возбудителей грибных болезней сои. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств защиты сои от экономически значимых болезней. 5 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Streptomyces hygroscopicus ВКПМ Ас-2158 для получения биопрепарата против возбудителей грибных болезней сои.