Штамм актиномицета Streptomyces pratensis - продуцент антибиотиков, используемый для защиты овощных культур от мягкой гнили, вызываемой фитопатогенными бактериями Pectobacterium caratovorum Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A01N63/28 C12R1/465 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и растениеводстве для биологического контроля от фитопатогенов вида Pectobacterium caratovorum - возбудителей мягкой гнили, и обеззараживания от фитопатогенных бактерий овощехранилищ.

Основу изобретения составляет штамм актиномицета Streptomyces pratensis 55T ВКПМ Ac-2188, депонированный в Биоресурсный центр Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» под регистрационным номером Ac-2188.

Фитопатогенные бактерии Pectobacterium carotovorum одни из 10 наиболее экономически важных бактериальных патогенов растений [Источник: Mansfield, J.; Genin, S.; Magori, S.; Citovsky, V.; Sriariyanum, M.; Ronald, P.; Dow, M.; Verdier, V.; Beer, S.V.; Machado, M.A.; et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Mol. Plant Pathol. 2012, 13, 614–629]. Они обычно вызывают серьезные заболевания мягкой гнилью ряда основных сельскохозяйственных овощных культур, из-за высокого уровня секреции ферментов, разрушающих клеточную стенку. Причем мягкая гниль встречается не только в поле, но и в местах хранения овощных культур или во время сбыта, что приводит к большим экономическим потерям.

Для борьбы с большинством бактериальных болезней растений, включая заболевания мягкой гнилью, как правило, широко используются химические бактерициды, такие как антибиотики и соединения на основе меди. Хотя эти соединения показали свою эффективность, они отрицательно влияют на окружающую среду и вызывают резистентность фитопатогенных микроорганизмов [Источник: Durso, L.M.; Cook, K.L. Impacts of antibiotic use in agriculture: What are the benefits and risks? Curr. Opin. Microbiol. 2014, 19, 37–44; Bonaterra, A.; Badosa, E.; Daranas, N.; Francés, J.; Roselló, G.; Montesinos, E. Bacteria as Biological Control Agents of Plant Diseases. Microorganisms 2022, 10, 1759. https://doi.org/10.3390/ microorganisms10091759].

Таким образом, поиск продуцентов среди микроорганизмов-антагонистов и разработка экологичных подходов управления бактериальными болезнями растений представляется актуальным.

Преобладающая часть известных в настоящее время продуцентов антибиотиков микробного происхождения, активных в отношении фитопатогенных грибов и бактерий, была выделена из актинобактерий (около 10000 антибиотических соединений), при этом лидером по производству антибиотиков является род Streptomyces [Источник: Jackson, S.A.; Crossman, L.; Almeida, E.L.; Margassery, L.M.; Kennedy, J.; Dobson, A.D.W. Diverse and Abundant Secondary Metabolism Biosynthetic Gene Clusters in the Genomes of Marine Sponge Derived Streptomyces spp. Isolates. Mar. Drugs 2018, 16, 67. https://doi.org/10.3390/md16020067]. Известны штаммы вида Streptomyces badius - продуценты антибиотиков, эффективных против фитопатогенного гриба Colletotrichum gloeosporioides – возбудителя антрактноза, антимикробная активность в отношении других микроорганизмов не исследовалась [Источник: Zhang K., Gu L., Zhang Y., Liu Z., Li X. Dinactin from a new producer, Streptomyces badius gz-8, and its antifungal activity against the rubber anthracnose fungus Colletotrichum gloeosporioides. Microbiological Research, 2020, 240:126548. https://doi.org/10.1016/j.micres.2020.126548]. Штамм S. badius B192 UFL изолированный из почв Сахары, проявлял антимикробную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе фитопатогенных.

Известен штамм Streptomyces sp. JCK-6131, который проявлял антагонистическую активность широкого спектра против различных фитопатогенных бактерий. Обработка JCK-6131 эффективно подавляла развитие бактериального ожога яблони, бактериального увядания томатов и фузариозного увядания огурцов. Штамм JCK6131 продуцирует несколько противомикробных соединений, три из которых были идентифицированы как стрептотрицины D-Е и 12-карбамоилстрептотрицин D [Источник: Le KD, Kim J, Nguyen HT, Yu NH, Park AR, Lee CW and Kim J-C (2021) Streptomyces sp. JCK-6131 Protects Plants Against Bacterial and Fungal Diseases via Two Mechanisms. Front. Plant Sci. 12:726266. doi: 10.3389/fpls.2021.726266].

Известен штамм Streptomyces pratensis LMM-15, подавляющий развитие серой гнили на томатах, вызываемое фитопатогенными грибами Botrytis cinerea [Источник: https://downloads.hindawi.com/journals/bmri/2017/9486794.pdf].

В настоящее время в ЕС зарегистрированы биопестициды для контроля бактериальных и грибковых заболеваний на основе бактерий рода Streptomyces - штаммы Streptomyces sp. K61 и штамм Streptomyces lydicus WYEC 108 [Источник: https://food.ec.europa.eu/plants/pesticides/eu-pesticides-database_en, https://www3.epa.gov/pesticides/chem_search/reg_actions/registration/decision_PC-006327_15-Feb-05.pdf].

В отечественной патентной литературе известен штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-M, используемый для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria. [Патент РФ № 2261902, заявлено 08.01.2003, опубл.27.07.2004].

Известен штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. B-4561, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей, вызывающих следующие заболевания растений: фузариоз и увядание злаковых, масличных и овощных культур; увядание или вилт технических и овощных культур; резиновую и бурую гниль картофеля; корневые гнили злаковых; альтернариоз капусты; гнили плодов и винограда при хранении; аспергиллез и гнили плодов; бактериозы капусты; паршу картофеля. Штамм также обладает инсектицидными свойствами - он вызывает гибель личинок 1 возраста колорадского жука и гибель гусениц Galleria mellonella [Патент РФ № 2243259, заявлено 01.11.2002, опубл .27.12.2004].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению, принимаемый за прототип, является штамм Streptomyces sp., выделеный из эндемичных амфипод рода Brandtia sp. оз. Байкал. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ Ac-2736D в качестве продуцента антибиотика актифенола. Штамм проявляет выраженную антагонистическую активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов. [Патент РФ № 2704862 заявлено 26.10.2018, опубл. 31.10.2019].

К настоящему времени неизвестно о каких - либо продуцентах биопестицидов на основе вида Streptomyces pratensis или других видов стерптомицетов, проявляющих активность в отношении фитопатогенных бактерий Pectobacterium, вызываемых заболевания мягкой гнили. Таким образом, отсутствует штамм-продуцент биопестицидов, с антибиотической активностью в отношении фитопатогенных бактерий Pectobacterium caratovorum.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является выделение нового штамма актиномицета Streptomyces pratensis, который продуцирует антибиотики с высокой активностью к условно-патогенным бактериям и фитопатогенным бактериям вида Pectobacterium caratovorum.

Техническая проблема решается тем, что выделен новый штамм актиномицета Streptomyces pratensis 55T ВКПМ Ac-2188 – продуцент антибиотиков, используемый для защиты овощных культур от мягкой гнили, вызываемой фитопатогенными бактериями Pectobacterium caratovorum.

Штамм Streptomyces pratensis 55 Т под номером ВКПМ Ac-2188 характеризуется следующими свойствами:

Культурально-морфологические особенности штамма.

Штамм растет на всех средах с оптимумом роста при 25 – 28°С; рост на органическом агаре Гаузе №2: воздушный мицелий от белого до бледновато-розового цвета, субстратный мицелий от бежевого до коричневого цвета, диффундирующий пигмент отсутствует; рост на овсяном агаре: воздушный мицелий белого цвета, субстратный мицелий от бежевого до светло-коричневого цвета, диффундирующий в агар пигмент отсутствует, рост на минеральном агаре Гаузе №1: воздушный мицелий белый, субстратный мицелий бежевый, бежево-желтый, светло-коричневый, диффундирующий в агар пигмент отсутствует. Микроморфологические признаки: на воздушном мицелии формируются длинные прямые цепочки спор.

Физиолого-биохимические признаки.

В состав клеточной стенки входит LL – диаминопимелиновая кислота: I тип клеточной стенки. Штамм продуцирует активные вещества - антибиотики, обладающие фунгицидными действием в отношении грибов Fusarium oxysporum и Fusarium solani, антибактериальным действием в отношении фитопатогенных бактерий Pectobacterium carotovorum.

Штамм хранят под слоем вазелинового масла, рост на минеральном агаре Гаузе №2, состава (г/Л): Бульон Хоттингера 30 мл; Пептон - 5; NaCl - 5; Глюкоза - 10; агар - 30; рН среды: 7,0 -7,4 температура хранения: 18-20 °С; срок хранения: 1 год. Для длительного хранения используют стандартные методы лиофилизации и криоконсервации.

Штамм Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188 является моноспоровым клоном, полученным из исходного дикого изолята, выделенного из донных отложений засоленого озера Тамбукан (Кабардино-Балкарская республика, Россия) традиционным методом посева на органическую среду Гаузе №2. Штамм 55 Т ВКПМ Ac-2188 идентифицирован как Streptomyces pratensis согласно анализу гена 16S rRNA и имеет гомологию 99,48% с несколькими видами близкородственных микроорганизмов. Видовые названия культур: Streptomyces flavofuscus, Streptomyces acrimycini, Streptomyces caviscabies, Streptomyces baarnensis, Streptomyces fimicarius являются синонимами. Видовые названия культур: Streptomyces anulatus, Streptomyces praecox являются синонимами (https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijs.0.012419-0#tab2).

Степень сходства нового штамма с коллекционными штаммами вида составляет 98,0 %, что указывает наряду с культурально-морфологическими свойствами его принадлежность к виду Streptomyces pratensis Rong et al. 2014type strain of Streptomyces pratensis: personal: ch24, CGMCC:4.6829, NRRL:B-24916, DSM:105114 (согласно материалам NCBI (National Center for Biotechnology Information). На основании сходства морфологических и микробиологических признаков депонируемый штамм отнесен к Streptomyces pratensis. Штамм не является генетически модифицированным. Штамм Streptomyces pratensis 55T ВКПМ Ac-2188 относится к актинобактериям: рода Streptomyces, семейства Streptomycetaceae, порядка Streptomycetales, класса Actinomycetia, отдела Bacteria (Rong X., Huang Y. Taxonomic evaluation of the Streptomyces griseus clade using multilocus sequence analysis and DNA–DNA hybridization, with proposal to combine 29 species and three subspecies as 11 genomic species. 2010. https://doi.org/10.1099/ijs.0.012419-0; Ronga X, Doroghazib J.R., Chenga K., Zhanga L, Buckleyb D.H., Huanga Y. Classification of Streptomyces phylogroup pratensis (Doroghazi and Buckley, 2010) based on genetic and phenotypic evidence, and proposal of Streptomyces pratensis sp. nov. 2013. https://doi.org/10.1016/j.syapm.2013.03.010). Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом.

Заявленный штамм Streptomyces pratensis 55 Т депонирован в Биоресурсный центр Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» под регистрационным номером Ac-2188, дата депонирования 11.08.2022.

Возможность использования предлагаемого штамма иллюстрируется примерами:

Пример 1.

Выделение штамма.

Штамм Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188 выделен из донных отложений засоленого озера Тамбукан, собранных зоне уреза воды, шириной около 10 м, лишенной какой-либо растительности, на глубине 10-12 см. Образцы были доставлены в лабораторию, где были гомогенизированы в 10 % стерильном глицероле в объеме 1 мл. Штамм выделен путем посева 100 мкл гомогенизированной суспензии в разбавлении 10^-2 – 10^-7 на органическую среду Гаузе 2. На Фиг.1 показан штамм Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188, выделенный из донных отложений озера Тамбукан (Кабардино-Балкария, Россия). Видовую идентификацию штамма проводят по морфологическим признакам, а также на основании анализа последовательности гена 16S рРНК. При морфологическом описании фиксируют строение спороносцев, пигментацию воздушного и субстратного мицелия, выделяемый в среду пигмент. Для микроскопирования используют световой микроскоп Микмед-6 (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия).

Для выделения ДНК используют культуральную жидкость, полученную после трех суток роста в среде Гаузе 2. Выделение бактериальной геномной ДНК проводят с использованием набора PowerSoil DNA Kit (MO BIO, Карлсбад, Калифорния, США). Амплификацию гена 16S рРНК проводили с использованием набора реагентов PCR Master Mix (Thermo Scientific, Фостер-Сити, Калифорния, США) с универсальными бактериальными праймерами 27f (aga gtt tga tcc tgg ctcag) и 1492r (tac ggy tac ctt gtt acg act t). ПЦР проводили на амплификаторе Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, США) по программе: (1) 94°C – 5 мин, (2) 30 циклов с чередующимися температурными интервалами 94°C – 1 мин, 51°C – 1 мин, 72°C –2 мин, (3) 72°C – 7 мин. Анализ продуктов ПЦР проводят методом электрофореза в 1% агарозном геле (с использованием трис-боратного буфера TBE) при напряженности электрического поля 7.6 В/см.

Очистку продуктов ПЦР проводят путем переосаждения ДНК в мягких условиях с использованием 0.125 М ацетата аммония в 70% этаноле. Нуклеотидные последовательности определяют методом Сэнгера на автоматическом генетическом анализаторе 3500 (Applied Biosystems, Беверли, Массачусетс, США) с использованием универсальных бактериальных праймеров 27f, 341f (cct acg gga ggc agc ag), 785f (ggm tta gat acc tgg tag tcc), 1114f (gca acg agc gca acc c), 519r (gta tta ccg cgg ctg ctg), 907r (ccg tca att cct ttg agt tt), 1100r (ggg ttg cgc tcg ttg), 1392r (acg ggc ggt gtg trc) и 1492r. Для сборки нуклеотидных последовательностей используют программу Mega 7. Полученные последовательности сравнивают с нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК типовых штаммов бактерий, полученных из баз данных GenBank (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и Ribosomal Database Project (RDP, http://rdp.cme.msu.edu/).

Пример 2.

Культивирование штамма Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188 и выделение антибиотиков. Для поверхностного культивирования используют среды следующего состава (%):

№1 Гаузе: крахмал растворимый – 2, KNO3 – 1, K2HPO3 – 0,5, MgSO4 – 0,5, NaCl – 0,5, FeSO4 – 0,01, агар – 2, pH = 7,2–7,4;

№2 Гаузе: глюкоза – 1, пептон – 0,5, триптон – 0,3, NaCl – 0,5, агар – 2; рН 7,2–7,4.

Для глубинного культивирования используют среду следующего состава (г/л): соевая мука - 15, глицерин – 30, NaCl – 2, CaCO3 – 5, pH 7,0, которая является оптимальной для накопления антибактериальных метаболитов.

Параметры культивирования: время культивирования - 24 часа, температура - 28°С, колбы конические, объемом 1000 мл, объем среды в колбах – 100 мл (10 % от объема). Культивирование проводят при постоянном перемешивании 180 об/мин в шейкер–инкубаторе ThermoStable IS-20 DAIHAN Scientific (Co.,Seoul, Korea). Для получения основной культуры, содержащей в своем составе антибактериальные метаболиты, маточную культуру в количестве 2 мл вносят в конические колбы с дефлекторами со стерильной жидкой средой. Параметры культивирования: время культивирования – 168 часов, температура – 28°С, колбы конические, объемом 1000 мл, объем среды в колбах – 100 мл (10 % от объема) в течение 5 суток при 25°С. По окончанию культивирования штамма супернатант культуральной жидкости отделяют от клеточной биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут в центрифуге LMC-3000, Biosan (Латвия). Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральной жидкости (КЖ) экстрагируют этилацетатом (при соотношении экстрагента и культуральной жидкости 3:1). Активные соединения секретируются штаммом в культуральную жидкость.

Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе «Rotavapor-RBǘchi» (Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют диско-диффузионный метод. Диски пропитывают препаратом, растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Антимикробную активность определяют в исходной культуральной жидкости, в спиртовых концентратах КЖ с помощью стерильных бумажных дисков (бумага фильтровальная Ф ГОСТ 12026-76, Россия), смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях.

Для оценки активности используют следующие коллекционные тест-штаммов: грамположительные бактерии Bacillus subtilis АТСС 6633, Bacillus pumilis NCTC 8241, Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177, Micrococcus luteus NCTC 8340, Mycobacterium smegmatis VKPM Ac 1339, Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA), S. aureus ИНА 00761 (MRSA), грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, фитопатогенные тест-культуры Pectobacterium savastanoi и Pectobacterium сarotovorum VKM-B1247. Контролем служат стандартные диски с ампициллином («НИИ Пастера», 40 мкг/диск). Культивирование микробных тест-культур проводят на среде LB (состав: 25 г/л LB – среда, pH – 7,5; Difco Кат.244620) для бактерий и на среде YPD (Состав: дрожжевой экстракт – 10 г; пептон – 20 г; декстроза – 20 г; агар бактериологический – 15 г; pH – 6,5). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 2 сутки. Чашки с условно-патогенными тест-культурами инкубируют при 37°С на среде, с фитопатогенными бактериями при 28°С на среде.

Экстракты культуральной жидкости штамма обладают широким спектром антибактериальной активности в отношении условно-патогенных и фитопатогенных бактерий. Экстракты ингибируют рост всех тест-культур бактерий, но особенно эффективны против возбудителя мягкой гнили Pectobacterium caratovorum VKM-B1247 (Фиг. 2). Антибиотическая активность экстрактов из культуральной жидкости штамма в отношении других тест-объектов подавляющем большинстве случаев превышает активность ампициллина (таблица 1).

Таблица 1.

Диаметр зон подавления роста тест-культур метаболитами культуральной жидкости Streptomyces pratensis 55 Т на различных средах, мм

Тест-культура
бактерий Среда LB Среда YPD Ампициллин
20 мкг/диск Bacillus subtilis АТСС 6633 14±0,1 10±0,2 12±0,1 Bacillus pumilis NCTC 8241 15±0,1 18±0,2 14±0,2 Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177 0 0 12±0,1 Micrococcus luteus NCTC 8340 12±0,2 14±0,3 10±0,1 Staphylococcus aureus FDA 209P 11±0,1 16±0,2 11±0,3 S. aureus ИНА 00761 (MRSA) 10±0,2 10±0,1 11±0,2 Escherichia coli ATCC 25922 16±0,1 14±0,2 10±0,1 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 20±0,1 22±0,1 10±0,1 Pectobacterium savastanoi 10±0,1 12±0,1 10±0,1 Pectobacterium. сarotovorum VKM-B1247 15±0,1 12±0,1 10±0,1

Пример 3.

Выделение, разделение фракций антибиотических соединений штамма Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188. Штамм Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188 секретирует антимикробные вещества в культуральную жидкость. Для выделения антибиотических веществ культуральную жидкость (КЖ) продуцента экстрагируют этилацетатом в соотношении органический растворитель - КЖ 5:1. Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе “Rotavapor RBüchi” (Швейцария) при 42°C досуха, остаток растворяют в водном 70%-ном этаноле и получают спиртовые концентраты.

Для фракционирования антибиотического комплекса экстракта используют прямофазную флеш-хроматографию в системе хлористый метилен - метанол. Разделение фракции с помощью прямофазной флеш-хроматографии проводят последовательно в системах: хлористый метилен - метанол (50:1→ 20:1→ 10:1→ 5:1→ 3:1), метанол, метанол/вода 50:50.

Последовательное разделение антибиотического комплекса экстракта из КЖ на силикагеле методом флэш-хроматографии позволяет получить 7 обогащенных фракций, у которых оценивают спектр антибактериальной активности. Последовательное разделение антибиотического комплекса экстракта из КЖ на силикагеле методом флэш-хроматографии позволяет получить 6 обогащенных фракций, у которых оценивают спектр антибактериальной активности в отношении условно-патогенных и фитопатогенных бактерий. Три фракции F_II, F_III, F_IV проявляют активность в отношении бактерий Pectobacterium сarotovorum VKM-B1247 (Таблица 2).

Таблица 2.

Антимикробная активность фракций штамма Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188 после прямофазной флеш-хроматографии

№n/n Элюент Ø зон ингибирования роста, мм Bacillus subtilis АТСС 6633 Escherichia coli ATCC 25922 Pectobacterium. сarotovorum VKM-B1247 F_I Хлористый ме лен/метанол 50/1 - - - F_II 20/1 25 24 13 F_III 10/1 20 30 14 F_IV 5/1 0 16 17 F_V 3/1 0 0 0 F_VI Чистый метанол 0 0 0 F_VII метанол/вода 50/50 - - -

Штамм Streptomyces pratensis 55 Т ВКПМ Ac-2188 синтезирует антибиотики с антибактериальной активностью в отношении условно-патогенных и фитопатогенных бактерий Pectobacterium. сarotovorum VKM-B1247, вызывающих развитие мягкой гнили растений.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм актиномицета Streptomyces pratensis 55T, продуцирующий антибиотики с активностью в отношении условно-патогенных бактерий и фитопатогенных бактерий вида Pectobacterium caratovorum, депонирован под регистрационным номером ВКПМ Ac-2188. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств защиты растений в сельском хозяйстве и растениеводстве. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Штамм актиномицета Streptomyces pratensis 55T ВКПМ Ac-2188 – продуцент антибиотиков, используемый для защиты овощных культур от мягкой гнили, вызываемой фитопатогенными бактериями Pectobacterium caratovorum.