СПОСОБ МАРКИРОВАНИЯ СЕЛЕКЦИОННЫХ ДОСТИЖЕНИЙ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО НА ОСНОВЕ RAPD-МАРКЕРОВ Российский патент 2005 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к определению сортовой принадлежности партий семян клевера лугового.

С целью дальнейшего совершенствования селекционно-семеноводческой работы и интеграции в международную систему UPOV в 1995 году Государственная комиссия по сортоиспытанию в соответствии с П2 статьи Закона Российской Федерации "О селекционных достижениях" разработала новое положение о государственном испытании и районировании сортов (1). В соответствии с новыми требованиями селекционное достижение может быть зарегистрировано только после проведения испытания на отличимость. Это требование предполагает наличие у нового сорта одного или нескольких маркерных признаков, которые обеспечат ему отличимость среди однотипных сортов, а также легкую идентификацию примесей в случае механического или биологического засорения инородным материалом, поддержание сортовых признаков и свойств селекционного достижения в процессе репродуцирования и соблюдения авторских прав селекционера.

В настоящее время для маркирования сортов используются как количественные признаки (высота растений, количество междоузлий), так и качественные признаки (окраска венчика, листьев и стеблей, количество листочков у листа, характер рисунка на листовой пластинке и так далее), которые выявляются визуально в фенотипе растений (2). Одним из основных недостатков таких маркеров является существенная зависимость их проявления от условий выращивания. В результате заключение о принадлежности данной партии семян и посева к тому или иному сорту можно сделать лишь с определенной долей вероятности.

В настоящее время общепризнано, что наиболее перспективными системами маркирования селекционных достижений является способы, основанные на оценке ДНК-полиморфизма и выделении локусов, специфичных для данного сорта, линии или гибридной комбинации (3). Поскольку структура ДНК (последовательность нуклеотидов) не зависит от условий внешней среды, то ДНК-маркеры являются наиболее стабильными, следовательно, наиболее объективными маркерами. Более того, высокий полиморфизм ДНК позволяет создать очень сложные системы маркирования, обеспечивающие контроль за большей частью хозяйственно ценных признаков и свойств селекционных достижений в процессе их репродуцирования, легко выявлять случаи механического засорения или опыления инородным материалом.

Существует несколько принципиальных способов оценки полиморфизма ДНК. Один из них основан на оценке полиморфизма длины фрагментов ДНК после обработки рестриктазами (RFLP), а другой - на технике многократного увеличения небольших фрагментов ДНК с помощью полимеразы (PCR), где величина амплифицируемого фрагмента ограничена одним или несколькими праймерами (3). В последние годы из-за простоты детектирования и необходимости очень малого количества ДНК все более широкое применение приобретают методы, созданные на основе полимеразной цепной реакции, среди которых метод произвольно амлифицированной полиморфной ДНК рандомными десятичленными праймерами (RAPD) является простым и удобным в массовом применении.

Цель изобретения - идентификация сортовой принадлежности партий семян клевера лугового на основе ДНК-полиморфизма RAPD-методом.

Поставленная задача достигается тем, что на представительной выборке (не менее 100 шт.) 5-7-дневных проростков конкретного сорта с использованием набора десятичленных праймеров проводится оценка ДНК-полиморфизма RAPD методом, где специфичные для сорта профили продуктов аплификации служат маркером данного селекционного достижения.

Способ осуществляется следующим образом:

проращиваются семена набора сортов клевера лугового, выделяется ДНК из навески проростков, амплифицируется ДНК в реакционной смеси с последовательным участием нескольких рандомных десятичленных праймеров, разделяются продукты амплификации горизонтальным электрофорезом, визуализируются под ультрафиолетовым светом, для каждого сорта выявляются специфичные профили продуктов амплификации, которые служат маркерами данного селекционного достижения.

Пример

В эксперименте с использованием 5-ти сортов клевера лугового проводится проращивание семян на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой, при температуре 22°С в течение 5-7 суток, затем из корешков не менее 100 проростков каждого сорта длиной 0,1-0,3 см формируется навеска массой 100 мг.

Выделение ДНК проводится из навески проростков, которая растирается пестиком до образования однородной суспензии с добавлением 400 mk1 стандартного буфера для выделения ДНК (3).

ДНК осаждается на микроцентрифуге "СМ-50" в течение 5 минут при 13000 об/мин. Супернатант в объеме 300 mk1 переносится в чистую пробирку с добавлением 300 mk1 изопропанола с двухминутной выдержкой при комнатной температуре. Затем раствор перемешивается до образования "клубочка" ДНК, центрифугируется в течение 5 минут при 13000 об/мин, а затем удаляется жидкая фаза. Образовавшийся осадок промывается в два этапа:

1) добавлением 200 mk1 75% этанола, центрифугированием в течение 1 минуты при 13000 об/мин и удалением жидкой фазы;

2) добавлением 150 mk1 95% этанола, центрифугированием и удалением жидкой фазы.

Осадок сушится на фильтровальной бумаге при открытой крышке пробирки в течение 3-4 часов, затем ДНК растворяется добавлением 100 mk1 воды μQ и хранится в холодильнике при температуре -4°С. Амплификация ДНК проводится в реакционной смеси объемом 20,5 mk1, содержащей 10 × буфер: 10 mM Tris НСl (рН 8.3), 50 mМ - КСl, 2 mМ - MgCl₂, 0.001% gelatin, а также dNTP - 100 μМ для каждого основания, Tag полимеразу (5 ед/μМ) - 0.5 mk1, праймер - 0,2 μМ, исследуемый образец ДНК - 25-30 ng. Для предотвращения испарения пробы на поверх на поверхность водной фазы наслаивается 5 mk1 минерального масла (4).

В исследованиях желательно использовать набор из пяти - шести десятичленных RAPD-праймеров. Хорошие результаты по оценке полиморфизма сортов клевера лугового были получены при использовании праймеров фирмы "Operon Technologies, Inc": OPC 05 - ^5'GATGACCGCC^3'; ОРЕ 07 - ^5'AGATGCAGCC^3'; OPE 16 - ^5'GGTGACTGTG^3'; OPN 15 -^5'CAGCGACTGT^3'; OPQ-11 - ^5'TCTCCGCAAC^3'; OPQ-9 - ^5'GGСТААССGА3^3'; OPS-19 - ^5'GAGTCAGCAG^3'.

Полимеразная цепная реакция проводится в амплификаторе "AMPLY 4L" (Biokom, Россия) по следующей программе - 95°С в течение 5 мин (денатурация) и 35 циклов: - 97°С в течение 30 сек (денатурация), - 39°С в течение 55 сек (отжиг), - 74°С в течение 1 мин 35 сек (синтез).

Продукты амплификации разделяются горизонтальным электрофорезом в 1,4%-ном агарозном геле в 1 × ТАЕ буфере при напряженности электрического поля 100 V с последующим окрашиванием этидиум бромидом, визуализируются на трансиллюминаторе "UVT-1" (Biokom, Россия). Продукты амплификации фотографируются, сканируются и обрабатываутся в пакете графических программ для PC "Adobe Photoshop 7.0".

Выявление маркеров производится по следующей схеме:

сравниваются совокупности продуктов амплификации Д1-К, представленные на фиг.1, где можно видеть, что три сорта 1, 3, 4 легко идентифицируются праймером OPS-19, так как их продукты амплификации находятся на различной удаленности от загрузочных лунок, или же их профили содержат различное количество продуктов амплификации.

Однако профили продуктов амплификации сортов 2 и 5 идентичны, поэтому для их идентификации необходимо использовать RAPD-профили иного праймера. Как мы видим на фиг.2, праймер OPQ-9 дал существенно различающиеся профили продуктов амплификации, которые позволяют легко идентифицировать сорта 2 и 5.

Таким образом, предложенный способ, включающий проращивание семян набора сортов клевера лугового, выделение ДНК из навески проростков, оценка полиморфизма ДНК RAPD-методом с последовательным участием нескольких праймеров, с последующим разделением продуктов амплификации горизонтальным электрофорезом, их визуализацией под ультрафиолетовым светом и выявлением специфичных профилей позволит проводить идентификацию всей совокупности сортов клевера лугового, районированных в нашей стране.

Список литературы

1. Официальный Бюллетень Государственной комиссии по сортоиспытанию и охране селекционных достижений при Минсельхозпроде России. М., 1995, 3, с.149-220.

2. Paterson Andrew H. Genome Mapping in Plants. R.G.Landes, 1996.

3. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома //Сельскохозяйственная биология, №23, 1999, с.3.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Молекулярное клонирование, М., Мир, 1, 1984.

5. Williams J.G.K., Kubelik A.P., Livak K.J. e.a. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 1990, 18:6531-6535.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к приемам определения сортовой принадлежности партий семян клевера лугового. Способ заключается в оценке ДНК-полиморфизма RAPD-методом с использованием набора 10-членных праймеров: OPS-19 ^5'GAGTCAGCAG^3', ОРС 05 - ^5'GATGACCGCC^3', OPE 07 - ^5'AGATGCAGCC^3', ОРЕ 16 - ^5'GGTGACTGTG^3', OPN 15 - ^5'CAGCGACTGT^3', OPQ-11 - ^5'TCTCCGCAAC^3', OPQ-9 - ^5'GGCTAACCGA3^3'. На основе оценки продуктов амплификации ДНК выбирают присущие только для данного сорта профили, служащие маркерами селекционного достижения. 2 ил.

Способ маркирования селекционных достижений клевера лугового на основе RAPD-маркеров, включающий выделение ДНК, оценку ДНК-полиморфизма RAPD-методом, разделение продуктов амплификации горизонтальным электрофорезом и их визуализацию под ультрафиолетовым светом, отличающийся тем, что для каждого из набора сортов клевера лугового выделяется ДНК из 3-х миллиметровых сегментов корешков у выборки, сформированной на основе 100 и более проростков, причем амплификацию ДНК проводят с последовательным участием рандомных 10-членных праймеров:

OPS-19 - ^5'GAGTCAGCAG^3’,

ОРС 05 - ^5'GATGACCGCC^3’,

OPE 07 - ^5'AGATGCAGCC^3’,

OPE 16 - ^5'GGTGACTGTG^3’,

OPN 15 - ^5'CAGCGACTGT^3’,

OPQ-11 - ^5'TCTCCGCAAC^3',

OPQ-9 -^5'GGCTAACCGA3^3',

а на основе оценки продуктов амплификации ДНК выбирают присущие только для данного сорта профили, которые служат маркерами селекционного достижения.