Тест-система для идентификации, оценки генетического полиморфизма и генетической паспортизации сортов и линий тимофеевки луговой Phleum pratense L. Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Область техники

Основой изобретения является тест-система базирующаяся на SSR-ПЦР и сравнении размеров полученных ампликонов SSR-локусов при помощи электрофореза в полиакриламидном геле для оценки генетического разнообразия, идентификации, а также паспортизации сортов и линий кормовой культуры тимофеевки луговой Phleum pratense L. и который может быть использован в агропромышленном комплексе, селекции и семеноводстве, а также в фундаментальных исследованиях.

Уровень техники

В мире известен лишь один близкий по целям и задачам прототип тест-системы для идентификации видов растений рода тимофеевка, состоящей лишь из одной пары SSR-праймеров (Sai Koi, Yuyama Nana, Hirata Tamako. SSR marker primer pair for identifying species of timothy and method for identifying species of timothy using primer set. Patent JP 2010082133 (31.03.2010, Япония)). Недостатком данной тест-системы является возможность идентификации лишь отдельных видов тимофеевки, но не сортов и тем более линий. Для генетической идентификации отдельных сортов и линий тимофеевки луговой необходимо использование нескольких SSR-праймеров, которые обеспечивают наибольший уровень полиморфизма. Для этого требуется провести отбор таких эффективных праймеров в ходе специальных предварительных исследований.

Одним из часто используемых в мире методов оценки генетического полиморфизма культурных растений является SSR-анализ (SSR-ПЦР), результаты которого могут быть оценены при помощи электрофореза в полиакриламидном геле или на капиллярном автоматическом секвенаторе (Сухарева А.С., Кулуев Б.Р. ДНК-маркеры для генетического анализа сортов культурных растений // Биомика. 2018. Т. 10. № 1. С. 69-84). В мире пока опубликовано очень мало даже научных статей по SSR-анализу каких-либо кормовых злаковых культур. К примеру, были проведены работы по SSR-анализу 9 подвидов ежи сборной с использованием 21 пары праймеров, что позволило их разделить на 3 группы и 5 кластеров, что совпало с их географическим происхождением (Yan D., Zhao X., Cheng Y., Ma X., Huang L., Zhang X. Phylogenetic and diversity analysis of Dactylis glomerata subspecies using SSR and IT-ISJ markers // Molecules. 2016. V. 21(11). 13 p.). SSR-анализ также использовался при изучении генома житняка (Li N., Wang X.P., Cao S.H., Zhang X.Q. Genome constitution of Agropyron elongatum 4x by biochemical and SSR markers // Yi Chuan Xue Bao (Article in Chinese). 2005. V. 32(6). P. 571-578). Также была проведена работа по анализу микросателлитных локусов у тимофеевки луговой (Cai H.W., Yuyama N., Tamaki H., Yoshizawa A. Isolation and characterization of simple sequence repeat markers in the hexaploid forage grass timothy (Phleum pratense L.) // Theoretical and Applied Genetics. 2003. V. 107(8). P. 1337-1349). Стоит отметить, что все эти исследования являются фундаментальными, в литературе не сообщается о применении этих методов на практике. Для генетической идентификации может быть использован одновременный анализ наиболее вариабельных SSR-локусов этого растения. Удобно пользоваться наборами в виде тест-систем для проведения генетических анализов, включающих все компоненты ПЦР и соответствующие праймеры. На сегодняшний день ни в России, ни в мире такие тест-системы остаются не разработанными. Такие тест-системы должны позволять однозначно идентифицировать не только вид, но и любой сорт изучаемой кормовой культуры, также необходимо идентифицировать и отдельные селекционные линии.

Сущность изобретения

Технической проблемой является не эффективность проведения SSR-ПЦР только с одной парой праймеров для однозначной идентификации сортов тимофеевки луговой. Технической задачей для решения этой проблемы является постановка SSR-ПЦР с несколькими парами праймеров. Эта техническая задача достигается включением в разрабатываемую тест-систему двух пар наиболее эффективных праймеров и постановкой двух ПЦР, где поочерёдно используются два ПЦР-микса. Итак, разработанная тест-система представляет собой два ПЦР-микса для постановки двух параллельно или последовательно идущих SSR-ПЦР, каждый из которых включает стандартный буфер для Taq-полимеразы (10х, 750 mM Tris-HCl (pH 8.6); 200 mM (NH₄)₂SO₄; 0.1% (v/v) Твин 20, pH 8.6), все 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP, 10 мМ), Taq-полимеразу (5 ед/мкл), два олигонуклеотидных праймера (каждая по 2 мкМ). Два ПЦР-микса отличаются лишь использованием разных пар праймеров. Последовательности праймеров ПЦР-микса 1: праймер 1 - TCTGTTGCCTATTCTGCTG и праймер 2 - GCATTTCACTAAGACTGTGACA. ПЦР-микс 2 с другой парой праймеров (праймеры 3 и 4) необходим для постановки второй реакции SSR-ПЦР. Последовательности праймеров ПЦР-микса 2: праймер 3 - CACTGGTGATCTTACACGC и праймер 4 - AGATCATCCACGAATTGATC.

Осуществление изобретения

Для постановки обеих SSR-ПЦР необходима деионизированная вода, которая не входит в состав тест-системы. Для SSR-анализа образцов тимофеевки полевой необходимо использование ДНК, выделенной любым подходящим способом, к примеру, из листьев. SSR-ПЦР может проводиться в объемах от 10 до 100 мкл. Пример ПЦР-смеси для объема 30 мкл: ПЦР-микс 1 или ПЦР-микc 2 (буфер для Taq-полимеразы, dNTP, праймеры, Taq-полимераза) - 9 мкл, анализируемая ДНК - 1 мкл, деионизированная вода - 20 мкл. Далее проводится стандартный ПЦР на любом ДНК-термоциклере по конечной точке или в режиме реального времени по следующим параметрам реакции: 94°C - 3 мин.; 35 циклов: денатурация при 94°С - 30 сек., отжиг праймеров при 55°C - 30 сек., элонгация при 72°С - 1 мин.; конечная элонгация при 72°С - 10 мин. Продукты амплификации можно разделить методом вертикального электрофореза в 10% полиакриламидном геле в течение 4-5 часов при напряжении 400 В. Визуализацию и документирование результатов электрофореза осуществляют при помощи любой гель-документирующей системы.

Данная тест-система была испытана нами на примере 9 линий тимофеевки луговой, которые проходят оценку у селекционеров в коллекционном питомнике Башкирского научно-исследовательского института сельского хозяйства УФИЦ РАН. Названия этих селекционных линий следующие: 53748, 52744, 38157, 52745, 29813, 52633, 29702, 29778, 29779, которые соответствуют номерам переданных образцов: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 и 19 (Фигура 1, Фигура 2). Семена исследуемых растений проращивали в чашках Петри. ДНК выделяли из 10 дневных проростков (высушенные в течение суток при температуре +55°С) с использованием ЦТАБ (Doyle J. J., Doyle J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochemistry bulletin. 1987. V. 19(1). P. 11-15). При выделении ДНК использовали 50-70 мг гомогенизированной смеси проростков пяти растений каждого сортообразца для выявления возможного внутрисортового полиморфизма. ПЦР проводили в амплификаторе «Т-100» («Bio-Rad Laboratories», США). ПЦР с каждым образцом проводили не менее 3 раз. Продукты амплификации разделяли методом вертикального электрофореза в камере VE-20 («Хеликон», Россия) в 10% полиакриламидном геле в течение 5 часов при напряжении 400 В. Визуализацию и документирование результатов электрофореза осуществляли при помощи гель-документирующей системы Gel Doc™ EZ Imager (Bio-Rad, США). Результаты испытаний тест-системы с использованием ПЦР-микса 1 выявили множество ампликонов разного размера (фиг. 1), причем все анализируемые образцы отличались друг от друга по размерам и сочетанию различных бэндов (SSR-ампликонов). Выбранный участок генома оказался высокоинформативным для сортовой идентификации (фиг. 1): линий тимофеевки, полностью совпадающих по сочетанию ампликонов, вовсе не выявилось. Далее проводили ПЦР тех же образцов ДНК с использованием ПЦР-микса 2. При использовании данного компонента тест-системы также была обнаружена очень высокая степень генетического полиморфизма, однако выявилась схожесть образцов 15 и 16 (фиг. 2). Остальные линии отличались друг от друга по сочетанию ампликонов (фиг. 2).

Проведенные на реальных селекционных линиях испытания разработанной тест-системы показали, что при использовании двух ПЦР-компонентов тест-системы достигается высокая степень выявляемого генетического полиморфизма, который позволяет однозначно идентифицировать не только сорта, но и отдельные линии тимофеевки полевой. Получаемые изображения результатов гель-электрофореза могут использоваться в качестве генетических паспортов. Данные гель-электрофорезов могут быть переведены в цифровой формат по принципу присутствия (1)/отсутствия (0) того или иного ампликона, что и станет основой генетического паспорта сорта. Такие тест-системы будут востребованы, прежде всего, в селекционных центрах, семеноводческих организациях, агрохолдингах и т.д. Также такие тест-системы могут быть использованы для проверки сортов на любом этапе производства: от покупки семян до получения урожая любыми заинтересованными службами, лабораториями и самими производителями.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Электрофоретические спектры, полученные после SSR-ПЦР с использованием ПЦР-микса 1 испытываемой тест-системы. 11 - линия 53748, 12 - линия 52744, 13 - линия 38157, 14 - линия 52745, 15 - линия 29813, 16 - линия 52633, 17 - линия 29702, 18 - линия 29778, 19 - линия 29779. М - маркер молекулярной массы 100 bp (Евроген, Россия).

Фигура 2. Электрофоретические спектры, полученные после SSR-ПЦР с использованием ПЦР-микса 2 испытываемой тест-системы. 11 - линия 53748, 12 - линия 52744, 13 - линия 38157, 14 - линия 52745, 15 - линия 29813, 16 - линия 52633, 17 - линия 29702, 18 - линия 29778, 19 - линия 29779. М - маркер молекулярной массы 100 bp (Евроген, Россия).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<?xml version=“1.0” encoding=“UTF-8”?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC “-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN” “ST26SequenceListing_V1_3.dtd”>

<ST26SequenceListing dtdVersion=“1_3” fileName=“Invention_SEQL.xml”

softwareName ”="WIPO Sequence" softwareVersion=“1.0” productionDate=“2022-

05-10” originalFreeTextLanguageCode=“en”onEnglishFreeTextLanguageCode=“jа”>

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023134534/10(075854)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-22-12</FilingDate>

<ApplicantName languageCode=“en”>UFRC RAS</ApplicantName>

<InventorName languageCode=“en”>Kuluev Bulat</InventorName>

<InventionTitle languageCode=“en”>TEST SYSTEM FOR IDENTIFICATION, EVALUATION OF

GENETIC POLYMORPHISM AND GENETIC CERTIFICATION OF PHLEUM PRATENSE L

VARIETIES AND LINES</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber=“1”> {TCTGTTGCCTATTCTGCTG}* </SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber=“2”> {GCATTTCACTAAGACTGTGACA} </SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber=“3”> {CACTGGTGATCTTACACGC} </SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber=“4”> {AGATCATCCACGAATTGATC} </SequenceData>

</ST26SequenceListing>*

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена тест-система, основанная на SSR-ПЦР и сравнении размеров полученных ампликонов SSR-локусов при помощи электрофореза в полиакриламидном геле для оценки генетического разнообразия, идентификации, а также паспортизации сортов и линий кормовой культуры тимофеевки луговой Phleum pratense L. Тест-система состоит из двух ПЦР-миксов: 1 и 2. Для генетического анализа линий и сортов тимофеевки луговой необходимо выделить ДНК из их листьев и по 1 мкл экстракта ДНК использовать для двух ПЦР, первый с использованием ПЦР-микса 1 и второй с использованием ПЦР-микса 2. Далее ампликоны, полученные в двух реакциях, анализируются в двух отдельных гель-электрофорезах в 10%-ном полиакриламидном геле. По результатам двух гель-электрофорезов делаются выводы о генетическом разнообразии и родстве линий и сортов тимофеевки луговой. Результаты двух электрофорезов могут быть объединены и переведены в цифровой формат 1/0, что может служить генетическим паспортом анализируемого сорта. 2 ил.

Генетическая тест-система, предназначенная для однозначной идентификации и паспортизации сортов тимофеевки луговой Phleum pratense L., основанная на методе SSR-ПЦР с последующим вертикальным электрофорезом в полиакриламидном геле, отличающаяся наличием в составе двух ПЦР-миксов, содержащих пары праймеров TCTGTTGCCTATTCTGCTG, GCATTTCACTAAGACTGTGACA, CACTGGTGATCTTACACGC и AGATCATCCACGAATTGATC.