СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ПРОБ ВОДЫ И ВОДНЫХ ВЫТЯЖЕК Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/02 G01N33/18 C12Q1/02 C12R1/90 

Настоящее изобретение относится к биологии и предназначено для биотестирования проб воды и водных вытяжек.

Любая патология (в том числе вызываемая токсикантами) развивается вследствие нарушения гомеостаза, который следует понимать как постоянное уравновешивание функций организма с колебаниями внешней среды, т.е. как поддержание структуры и функции организма в границах нормы.

Гомеостаз регулируется нервной и нейроэндокринной системами. Первой принадлежит решающая роль, поскольку она контролирует все процессы организма. Идеи нервизма, разработанные И.П.Павловым, нашли свое развитие во многих работах патологов [2, 3, 4, 6]. Принцип нервной регуляции распространяется и на токсикологию водных животных [7]. Действие токсических веществ основано на вмешательстве их в биохимические процессы организма, которые обеспечивают функционирование определенных органов и систем и определяют конечные ответные реакции.

Знания физиолого-биохимических основ действия токсичных веществ крайне важны для разработки мероприятий по диагностике, классификации отравлений водных животных. В последнее время они приобретают особую актуальность и практическую направленность в связи с необходимостью развития методов биотестирования токсикантов в водной среде.

Поведенческие реакции у животных - одно из средств приспособления к окружающей среде и ее изменениям. От тропизмов у растений они отличаются участием эффекторов - специальных органов или клеток, реализирующих полученные от рецепторов сигналы [1].

На фоне световых ритмов у гидробионтов вырабатываются определенные ритмы жизнедеятельности. Сюда относятся не только ритмы активности, но и другие: репродуктивная (спаривание, откладка яиц), онтогенетические (линька, вылупление молоди), метаболическая (питание, выделение дыхания), биохимическая и др. Наличие этих ритмов у водных беспозвоночных неоспоримо доказывает, что в водной среде свет играет такую же важную роль, как и на суше, изменяя количественные показатели жизненно важных процессов у ее обитателей.

Простейший пример поведенческой реакции - таксис, или двигательная реакция, осуществленная без участия центральной нервной системы в ответ на внешний стимул. В тех случаях, когда этим стимулом является свет, различают фототаксис, фотосинтез и фотофобную реакцию. Фототаксис представляет собой ориентированную реакцию по отношению к источнику света. Фотосинтез, или изменение скорости движения в зависимости от интенсивности освещения, может рассматриваться как по отношению к целому организму, так и по отношению некоторых органов, например фильтрационного аппарата у морских желудей. Фотофобные реакции заключаются в избегании освещенности (у простейших).

Наиболее широко изучено действие на фототаксис интенсивности освещения. Установлено изменение знака фототаксиса с положительного на отрицательный при воздействии максимальных (в пределах естественного интервала) величин освещенности у беспозвоночных [8, 9, 11]. В некоторых случаях отмечен порог фототаксиса [12], выраженный определенной величиной интенсивности освещения. Такой порог установлен для циклопов, креветок [10].

Оценка токсичности загрязняющих веществ для гидробионтов основывается на использовании тестов, которые наиболее полно и надежно отражают благополучие организма. Это - выживаемость, размножение, плодовитость и качество потомства. Однако исследование таких биологических процессов трудоемко, дорогостояще и возможно лишь на ограниченном числе видов. Поэтому в последнее время стали уделять все больше внимания физиолого-биохимическим и поведенческим реакциям, при помощи которых можно выявить патологию, вызываемую токсикантами задолго до нарушения целостных ответов организма [7].

Для широкого использования в качестве “экологически весомых” показателей должны применяться такие физиолого-биохимические параметры, которые отражают нарушения целостных реакций организма.

Обнаружено влияние качества воды на распределение водных животных по отношению к свету. В качестве прототипа выбрана методика определения отношения к свету у водных животных, заключающаяся в использовании альтернативных камер, где животному приходится выбирать между темнотой и светом. Причем животных помещают в камеру выбора, из которой есть достаточно большой выход в освещенную и неосвещенную камеру [7]. Если токсикант угнетает или, наоборот, усиливает подвижность животных, их распространение в камерах становится равномерным независимо от отношения к свету.

Целью изобретения является создание простого и доступного способа тестирования, основанного на поведенческой реакции фототаксиса.

Эта цель достигается благодаря способу биотестирования, основанному на оценке времени выхода дафний из “темновой” камеры на свет. Отличие прелагаемого способа заключается в том, что животным не представляется альтернативы выбора, все они помещаются в темновую камеру, из которой есть только один выход на источник рассеянного света. При данном способе принципиально иной механизм ориентации, состоящий в отыскании направления на источники стимуляции (свет) и движения по этому направлению. В связи с ограничением диаметра выходного отверстия у темновой камеры практически исключается перераспределение дафний в зависимости от изменения двигательной активности при воздействии токсичных веществ.

Порядок проведения тестирования следующий: в тестируемый раствор помещают садок из газа, в котором находятся 5 дафний. После нахождения в тестируемом растворе в течение 60 минут животных помещают в “темновую” камеру, которая предварительно погружена в лабораторный стакан емкостью 500 мл, заполненный водой для культивирования. Камера представляет собой куб с размерами 60×60×60 мм, изготовленный из черного органического стекла с крышкой из этого же материала. В центре боковой поверхности находится отверстие, через которое животные могут покидать “темновую” камеру. Диаметр отверстия зависит от размеров дафний, применяемых для биотестирования. Так, при использовании в эксперименте суточной молоди дафний диаметр выходного отверстия должен быть 1 мм, половозрелых особей - 2,5 мм. Диаметры этих отверстий обусловлены размерами животных. Выметанная молодь имеет размеры 0,7-0,9 мм в длину, к моменту половозрелости самки достигают 2,2-2,4 мм, самцы - 2,0-2,1 мм. При проведении эксперимента уровень жидкости в лабораторном стакане и камере тестирования должен быть одинаковым. При этом выходное отверстие должно быть в слое жидкости. Параллельно ставится опыт, в котором вместо тестируемого раствора используется вода для культивирования дафний.

Тест-функцией является время отклика на световой раздражитель. Средством испытания является “темновая” камера, а критерием токсичности достоверное отличие во времени поведенческой реакции (фототаксиса) опытной пробы по сравнению с контрольной пробой.

При обработке результатов эксперимента проводят сравнение показателей подопытных и контрольных дафний. Определение достоверности отклонения от контроля осуществляется методами вариационной статистики [5]. При этом вычисляют:

М - среднее арифметическое значение показателя

где Vi - отдельное значение показателя; n - количество повторностей;

Σ - знак суммирования; δ - среднеквадратичное отклонение

m - ошибка среднего арифметического

Δ - доверительный интервал

Где t_St - табличная величина, критерий Стьюдента. В данном случае для его определения принимают уровень значимости Р=0,05 и степень свободы n-1; t₄ - критерий достоверности разности

где M₁, М₂ - сравниваемые средние величины (в контроле и тестируемых пробах); m21

В данном случае для его определения принимают уровень значимости Р=0,05 и степень свободы n₁+n₂-2.

Если рассчитанное значение t4 больше или равно значению критерия Стьюдента (t₄>t_St), отклонение результатов биотестирования от контроля достоверно. На этом основании можно сделать вывод о том, что тестируемая проба воды оказывает токсическое действие на дафний.

Способ предназначен для быстрого контроля степени интегральной токсичности проб растворов экотоксикантов, воды и водных вытяжек различных объектов окружающей среды в лабораторных и полевых условиях.

Способ был использован при биотестировании проб воды и водных вытяжек, содержащих антихолинэстеразные соединения (фосфорорганические и карбаматы), в диапазоне среднелетальных концентраций этих веществ 1·10^-2-1·10^-5 мг/л, что приближает определение антихолинэстеразных соединений при помощи этих гидробионтов с применением предложенного способа биотестирования к чувствительности методов газожидкостного хроматографического анализа.

Литература:

1. Вилли К., Датье В. Биология, 1974.

2. Горизонтов П.Д. Вопросы патологической физиологии в трудах И.П.Павлова. М., 1952. - 314 с.

3. Горизонтов П.Д. Резистентность и поражение. Вопросы общей патологии // Патологическая физиология экспериментальных состояний. М., 1973. С.7-35.

4. Иванов-Смоленский А.Г. Очерки патофизиологии высшей нервной деятельности (по данным И.П.Павлова и его школы). М., 1952. - 387 с.

5. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии / учебно-метод. пособие. - М: МГУ, 1978, 340 с.

6. Сперанский А.Д. Элементы построения теории медицины /Избр. труды. М., 1955. - 404 с.

7. Флеров Б.А. Эколого-физиологические аспекты токсикологии пресноводных животных. - Л.: “Наука”, 1989.

8. Aiken D., Hailman G. // Can. J. Zool. 1978. Vol.56, №4. P.708-711.

9. Bourdilion A., Castelbon Ch. // Vision invertebres, Paris, 1984. P.202-209.

10. Бурба А., Максимов Ю., Плярпа А. // Acta hydrobiologia Lituanica. 1977, №6. S.93-100.

11. Rimet V // Bull. Sci. Zool. France. 1979. №2-3. Р.342-357.

12. Swift V., Forward R. // J. Plancton Res. 1983. Vol.5, №3. P.407-415.

Данный способ относится к биологии и предназначен для биотестирования проб воды и водных вытяжек. Дафний погружают сначала в тестируемый раствор или воду для культивирования, а затем дафний переносят в погруженную в воду для культивирования светонепроницаемую камеру с выходным отверстием, измеряют время выхода дафний из камеры тестирования на свет и по разнице времени выхода дафний оценивают токсичность тестируемого раствора. Способ позволяет быстро проводить контроль токсичности проб воды и водных вытяжек в лабораторных и полевых условиях.

Способ биотестирования проб воды и водных вытяжек, включающий оценку токсичности исследуемого раствора на основе реакции фототаксиса у Daphnia magna Straus, отличающийся тем, что дафний опытной и контрольной групп помещают на 60 мин сначала в тестируемый раствор или воду для культивирования дафний соответственно, а затем животных каждой группы переносят в погруженную в воду для культивирования дафний светонепроницаемую камеру с выходным отверстием размером от 1 до 2,5 мм, выбранным в зависимости от возрастных размеров дафний, применяемых для биотестирования, далее измеряют время выхода дафний из камеры тестирования на свет и по разнице во времени выхода дафний опытной и контрольной групп оценивают токсичность тестируемого раствора.