СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ IN VITRO СОЕДИНЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 G01N33/15 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для определения in vitro различных соединений, обладающих иммунотропной активностью.

Известен способ определения in vitro соединений, обладающих иммунотропной активностью, путем определения действия этих соединений на антителообразующую функцию В-лимфоцитов и цитотоксическую функцию Т-лимфоцитов. Способ заключается в выделении селезенки, приготовлении взвеси спленоцитов, выделении из взвеси спленоцитов Т- и В-лимфоцитов, преинкубировании выделенных клеток в культуральной среде с исследуемым веществом и дальнейшем инкубировании культуры клеток с эритроцитами барана [1].

Однако данный способ недостаточно информативен при отборе лекарственных средств, обладающих иммунотропной активностью. Способ не дает возможности оценить, как будет вести себя исследуемое соединение не только в условиях, близких к физиологическим, но и в условиях экзогенного патологического воздействия на иммунную систему. Для скрининга лекарственных средств способ достаточно сложен в его исполнении.

Задачей предлагаемого изобретения является упрощение способа и повышение его информативности, позволяющее оценить иммунотропную активность соединений и в условиях, близких к физиологическим, и в условиях экзогенного патологического воздействия.

Поставленная задача достигается способом определения in vitro соединений, обладающих иммунотропной активностью, путем иммунизации животного эритроцитами барана за 5 суток до выделения селезенки, приготовления взвеси спленоцитов, определения количества розеткообразующих клеток в контрольных пробах взвеси спленоцитов иммунизированного животного, проведения преинкубации проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и определения в ней числа розеткоообразующих клеток, и при изменении количества розеткообразующих клеток по сравнению с контрольными пробами констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях, близких к физиологическим; проведения преинкубации проб взвеси спленоцитов с циклофосфаном и определения числа розеткообразующих клеток, затем проведения преинкубации проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном, который вносят в пробу взвеси спленоцитов после исследуемого соединения, и определения числа розеткообразующих клеток и при увеличении количества розеткообразующих клеток в пробах взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном в сравнении с пробами взвеси спленоцитов с циклофосфаном констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях экзогенного патологического воздействия. Причем соотношение объемов исследуемого соединения, циклофосфана к объему пробы взвеси спленоцитов равно 1:1:10-11, а преинкубацию проводят при температуре 36,5-37,0°С в течение 10-20 минут.

Новым в предложенном способе является то, что используют взвесь спленоцитов предварительно иммунизированных животных и определяют в ней число розеткообразующих клеток; используют преинкубацию проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и определение в ней числа розеткообразующих клеток; используют преинкубацию проб взвеси спленоцитов с циклофосфаном, который вносят в пробу взвеси спленоцитов после исследуемого соединения и определяют число розеткообразующих клеток.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию "новизна".

Данное предложение не вытекает явным образом для специалиста из уровня техники, таким образом, оно соответствует критерию "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ можно использовать в экспериментальной медицине, таким образом, он соответствует критерию "промышленно применимо".

Способ осуществляют следующим образом.

Производят иммунизацию животного 0,2 мл 15% взвеси эритроцитов барана. На 5 сут после иммунизации выделяют селезенку. Получают взвесь спленоцитов [2] и определяют число розеткообразующих клеток в контрольных пробах взвеси спленоцитов объемом 100 мкл по общепринятой методике [3]. Вносят исследуемое соединение объемом 10 мкл в пробы взвеси спленоцитов объемом 100 мкл и инкубируют 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С. Затем определяют число розеткообразующих клеток по общепринятой методике и сравнивают с контрольными результатами. Изменения количества розеткообразующих клеток под влиянием исследуемого соединения по сравнению с контрольными данными свидетельствуют о наличии у исследуемого соединения иммунотропной активности в условиях, близких к физиологическим. Инкубируют пробы взвеси спленоцитов объемом 100 мкл 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С с циклофосфаном объемом 10 мкл и определяют число розеткообразующих клеток. Инкубируют пробы взвеси спленоцитов объемом 100 мкл 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С с исследуемым соединением объемом 10 мкл и циклофосфаном объемом 10 мкл, который вносят в пробу после исследуемого соединения, и определяют число розеткообразующих клеток. Полученные результаты сравнивают с числом розеткообразующих клеток в пробах взвеси спленоцитов с циклофосфаном и при увеличении количества розеткообразующих клеток в пробах взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном в сравнении с пробами взвеси спленоцитов с циклофосфаном констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях экзогенного патологического воздействия.

Конкретные примеры выполнения способа.

Пример 1. Мышь линии СВА иммунизировали 0,2 мл 15% взвеси эритроцитов барана внутрибрюшинно, на 5 сут животное забивали методом цервикальной дислокации шейных позвонков, выделяли селезенку и приготавливали взвесь спленоцитов [2]. В группе контроля к 100 мкл проб взвеси клеток добавляли по 10 мкл физиологического раствора, в опытной группе - к 100 мкл проб добавляли по 10 мкл исследуемого соединения - экстракта эхинацеи пурпурной, разведенного в физиологическом растворе, в концентрации 10^-5 г/мл и инкубировали пробы 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С. Далее проводили постановку реакции определения числа розеткообразующих клеток [3]. В контрольной группе количество розеткообразующих клеток находилось на уровне (30,80±3,08)×10⁶/opгaн. Преинкубация клеток селезенки с экстрактом эхинацеи пурпурной в концентрации 10^-5 г/мл приводила к увеличению количества розеткообразующих клеток до (41,65±2,08)×10⁶/opгaн (в среднем на 35%). Полученные данные указывают на наличие у экстракта эхинацеи пурпурной иммунотропной активности.

Дозировка исследуемого соединения подобрана с учетом методических рекомендаций по экспериментальному изучению иммунотропной активности фармакологических препаратов [4].

Пример 2. Мышь линии СВА иммунизировали 0,2 мл 15% взвеси эритроцитов барана внутрибрюшинно, на 5 сут животное забивали методом цервикальной дислокации шейных позвонков, выделяли селезенку и приготавливали взвесь спленоцитов [2]. В группе контроля к 100 мкл проб взвеси клеток добавляли по 10 мкл физиологического раствора, в группе с циклофосфаном - к 100 мкл проб добавляли по 10 мкл циклофосфана, разведенного в физиологическом растворе, в концентрации 10^-5 г/мл и инкубировали пробы 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С, в опытной группе - к 100 мкл проб добавляли по 10 мкл исследуемого соединения - экстракта эхинацеи пурпурной, разведенного в физиологическом растворе, в концентрации 10^-5 г/мл. Затем для воспроизведения экзогенного патологического воздействия химической природы в пробы опытной группы вносили по 10 мкл циклофосфана в концентрации 10^-5 г/мл. Пробы инкубировали 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С. Далее проводили постановку реакции определения числа розеткообразующих клеток [3]. В контрольной группе количество розеткообразующих клеток находилось на уровне (35,24±2,21)×10⁶/орган. Под действием циклофосфана происходило значительное снижение показателя до (18,06±1,22)×10⁶/opгaн. Изменения носили достоверный характер, падение числа розеткообразующих клеток составляло в среднем 48,8% по сравнению с контрольными значениями. Применение экстракта эхинацеи пурпурной в концентрации 10^-5 г/мл нивелировало цитотоксическое действие циклофосфана - количество розеткообразующих клеток оставалось на уровне контрольных значений и составляло в среднем (35,46±3,56)×10⁶/opгaн. Полученные данные указывают на наличие у экстракта эхинацеи пурпурной иммунотропной активности.

Таким образом, данная модель позволяет оценить in vitro действие различных соединений на процесс розеткообразования, характеризующий состояние иммунного ответа, в условиях, близких к физиологическим, и также при экзогенном патологическом воздействии. Это дает возможность проводить скрининг соединений на наличие у них иммунотропной активности.

Литература

1. Thomas J.K., Imamura Т. "Immunosuppressive efect of an impurity of malathion: mhibithion of murine T- and B-lymphocyte responses by О,О,S-trimetil phosphorothioate" // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1986. Vol.83, N 3. P.456-464.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры тканей. Томск, 1992.

3. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К. и соавт. Иммунология: Практикум. Киев, 1989.

4. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. 1999. № 1. С.31-37.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии. Сущность способа: выделяют селезенку животного, предварительно (за 5 дней) иммунизированного эритроцитами барана, определяют количество розеткообразующих клеток в контрольных пробах взвеси спленоцитов. Проводят преинкубацию проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и определяют в них число розеткообразующих клеток. При изменении количества розеткообразующих клеток по сравнению с контрольными пробами констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях, близких к физиологическим. Проводят преинкубацию проб взвеси спленоцитов с циклофосфаном, определяют число розеткообразующих клеток, проводят преинкубацию проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном и определяют число розеткообразующих клеток. При увеличении количества розеткообразующих клеток в пробах взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном в сравнении с пробами взвеси спленоцитов с циклофосфаном констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях экзогенного патологического воздействия. Соотношение объемов исследуемого соединения, циклофосфана и объема пробы взвеси спленоцитов равно 1:1:10-11. Преинкубацию проводят при температуре 36,5-37°С в течение 10-20 мин. Способ позволяет упростить определение иммунотропности соединений и повысить его информативность. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ определения in vitro соединений, обладающих иммунотропной активностью, заключающийся в выделении селезенки животного, приготовлении взвеси спленоцитов, преинкубировании проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и дальнейшем инкубировании проб взвеси спленоцитов с эритроцитами барана, отличающийся тем, что за 5 суток до выделения селезенки проводят иммунизацию животного эритроцитами барана, определяют количество розеткообразующих клеток в контрольных пробах взвеси спленоцитов иммунизированного животного, проводят преинкубацию проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением циклофосфаном и определяют в них число розеткообразующих клеток, при изменении количества розеткообразующих клеток по сравнению с контрольными пробами констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях, близких к физиологическим, проводят преинкубацию проб взвеси спленоцитов с циклофосфаном и определяют число розеткообразующих клеток, затем проводят преинкубацию проб взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном, который вносят в пробу взвеси спленоцитов после исследуемого соединения, и определяют число розеткообразующих клеток и при увеличении количества розеткообразующих клеток в пробах взвеси спленоцитов с исследуемым соединением и циклофосфаном в сравнении с пробами взвеси спленоцитов с циклофосфаном констатируют наличие иммунотропной активности у исследуемого соединения в условиях экзогенного патологического воздействия.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение объемов исследуемого соединения, циклофосфана и объема пробы взвеси спленоцитов равно 1:1:10-11.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что преинкубацию проводят при температуре 36,5-37°С в течение 10-20 мин.