СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2008 года по МПК A61K36/28 A61K31/715 A61P37/02 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

В настоящее время в терапии заболеваний, обусловленных дисфункцией иммунной системы, используются [Энциклопедия лекарств, 2004а]: препараты на основе цитокинов, интерфероны и интерфероногены (например, неовир, тилорон, криданимод), синтетические вещества с иммуностимулирующими свойствами (например, декарис, циклоферон, тимоген, ликопид), препараты растительного происхождения, препараты на основе нуклеиновых кислот (натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеинат, оксиметилурацил), препараты, содержащие микроорганизмы или их производные (имудон, ИРС 19, рибомунил) и препараты на основе ферментов (вобэ-мугос Е, вобэнзим).

Препараты растительного происхождения представлены в основном лекарственными средствами на основе растения эхинацеи - иммунал, иммунорм, доктор Тайсс экстракт эхинацеи. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной [Энциклопедия лекарств, 2004б; Энциклопедия лекарств, 2004в], а доктор Тайсс экстракт эхинацеи - экстракт листьев эхинацеи [Энциклопедия лекарств, 2004 г]. У этих препаратов имеется общее побочное действие: аллергические реакции на эхинацею. Некоторые авторы полагают, что у препаратов растительного происхождения, таких как вышеуказанные лекарственные средства на основе эхинацеи, отсутствует избирательность в отношении иммунной системы [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003а]. Вероятно, это связано с наличием в них различных по своим фармакологическим эффектам веществ.

Наиболее близким (базовым) препаратом является ликопид, поскольку в основе механизма его иммуномодулирующего действия лежит активация антиген-презентирующих клеток и фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003б]. Известно, что основным цитокином, активирующим Т-хелперы 1 типа (Th1), является интерлейкин-12, который вырабатывается антиген-презентирующими клетками в раннюю фазу инфекции. Благодаря этому цитокину макрофаги могут направлять дифференцировку Т-хелперов, создавая условия для предпочтительного развития Th1 in vitro и in vivo. Ликопид активирует клетки моноцитарно-макрофагального звена, стимулируя продукцию ими воспалительных цитокинов.

Для стимулирования активности макрофагов мы предлагаем использовать водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, поскольку известно, что полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами антиген-презентирующих клеток [Schepetkin I.A., et al., 2006]. Кроме того, в ряде работ показано, что полисахариды растительного или микробного происхождения могут оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток, при этом полисахариды могут способствовать как развитию Th1-, так и Th2-зависимого иммунного ответа.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств растительного происхождения, повышение их эффективности путем избирательной стимуляции Th1-зависимого типа иммунного ответа.

Поставленная цель решается путем применения водорастворимых полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, в качестве стимулятора Th1-зависимого типа иммунного ответа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи.

Новое свойство водорастворимых полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, было обнаружено в результате экспериментальных исследований.

Новое свойство полисахаридов явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве иммуномодулирующего средства водорастворимые полисахариды, выделенные из листьев мать-и-мачехи, можно использовать для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью TH1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Полисахариды получены по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975]. Сырье листья мать-и-мачехи измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96% этиловым спиртом и высушивали. Выход водорастворимых полисахаридов составлял 0,7 г (7%). Сумма водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, представляла собой порошок молочно-белого цвета с кремовым оттенком, а полисахариды, полученные из листьев календулы, имели вид мелкозернистых тяжелых гранул темно-коричневого цвета с диаметром частиц до 1,5 мм.

Эксперименты проведены на 90 линейных мышах BAlb/с массой 20 г, возраст 8 недель. В предварительных экспериментах было выявлено, что оптимальной суточной дозой полисахаридов, полученных из мать-и-мачехи, для иммуномодуляции является 10 мг/кг массы тела.

Для индукции Th1-зависимого типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, которые, как известно, вызывают развитие именно этого типа иммунного ответа. Для изучения влияния водорастворимых полисахаридов на гуморальный и клеточный иммунный ответ мышам вводили раствор полисахаридов по 10 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Через 5 дней от начала введения животных иммунизировали эритроцитами барана (по 5×10⁶ внутрибрюшинно при определении числа АОК и титра антител, по 1×10⁸ при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа).

Влияние полисахаридов на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей [Хаитов P.M. с соавт., 1999] и по титру антител в сыворотке крови. Для этого животных забивали через 5 дней после иммунизации, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ной взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа. Титр антител в сыворотке крови определяли в реакции агглютинации [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого животных забивали цервикальной дислокацией, вскрывали грудную полость и забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку раститровывали в 96-луночном планшете с шагом 1/2, добавляли эритроциты барана, инкубировали при 37°С 2 часа и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдается агглютинация.

Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10⁸ эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Индекс реакции (ИР) вычисляли для каждой мыши по формуле:

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при p<0,05.

Пример 1.

Курсовое введение полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, привело к увеличению в 2,1 раза числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей (табл.1).

Таблица 1Влияние курсового введения полисахаридов (ПС), выделенных из листьев мать-и-мачехи, на количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей и продукцию ими антител (Х±m)Группа животныхЧисло АОК, 10³/селезенкуТитр антител, log₂Контроль36,7±6,05,5±0,5Ликопид (10 мг/кг)66,9±9,3*6,0±0,8Ликопид (2 мг/кг)72,9±9,7*8,5±0,5*ПС мать-и-мачехи77,1±8,2*7,50±0,67*Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

У животных, не получавших исследуемого вещества, количество АОК составило 36,7 тыс. из расчета на 1 селезенку, в то время как у мышей после курсового введения полисахаридов их число составило 77,1 тыс. на 1 селезенку. Количество антител, вырабатываемых В-лимфоцитами в ответ на введенный антиген (эритроциты барана), под влиянием курсового введения полисахаридов повышалось на 36% (табл.1). Ликопид также повышал количество АОК и уровень антител, однако это стимулирующее действие было выражено в той же степени, что и у полисахаридов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изучаемое вещество обладает способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ, повышая количество антителообразующих клеток и их функциональную активность. Следует отметить, что по стимулирующей активности полисахариды не уступают ликопиду.

Пример 2.

Курсовое введение полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, усиливало эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана (табл.2). У мышей, которым вводили только растворитель (изотонический раствор хлорида натрия), индекс реакции составил 9,85%. У животных в результате курсового введения полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, индекс реакции был увеличен в 2 раза и составил 20,4%. Водорастворимые полисахариды, выделенные таким же способом, но из другого растительного сырья - листьев календулы, стимулирующей активности в данной иммунологической реакции не проявили.

Таблица 2Влияние полисахаридов, выделенных из листьев мать-и-мачехи, на реакцию ГЗТ на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (Х±m)Группа животныхИР (%)Контроль9,85±1,73ПС календулы11,46±2,71ПС мать-и-мачехи20,40±2,81*Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, стимулируют протекание иммунного ответа, вызванного эритроцитами барана, а следовательно, являются активаторами Th1 типа иммунного ответа.

Водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, являются активаторами Th1-зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционно-воспалительных процессах любой локализации.

Литература

1. Методы исследования углеводов (пер. с английского В.А.Несмеянова, под. ред. проф. Харлина). М.: Мир, 1975. С.274.

2. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. 1996. №8. С.7-12.

3. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. №1. С.31-36.

4. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003а. №3. С.198.

5. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003б. №3. С.199.

6. Энциклопедия лекарств. 2004а. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.1081-1082.

7. Энциклопедия лекарств. 2004б. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.360.

8. Энциклопедия лекарств. 2004в. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.362.

9. Энциклопедия лекарств. 2004г. №11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.320.

10. Schepetkin I.A., Quinn M.T. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol.6, №3. P.317-733.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему иммуностимулирующей активностью. Применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1-зависимый тип иммунного ответа. Водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, обладают иммуномодулирующей активностью, эффективно стимулируют Th1-зависимый тип иммунного ответа. 2 табл.

Применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1-зависимый тип иммунного ответа.