СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2010 года по МПК A61K36/185 A61P37/04 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную систему.

Назначение с лечебной или профилактической целью при заболеваниях, связанных с нарушениями иммунитета, препаратов химической или биологической природы, обладающих иммунотропной активностью, называется иммунотерапией, а сами препараты можно разделить на четыре большие группы: иммуномодуляторы, иммунокорректоры, иммуностимуляторы, иммунодепрессанты [9]. Иммуностимуляторы - средства, усиливающие иммунный ответ. К синтетическим иммуностимуляторам относится левамизол, ряд пептидных иммуностимуляторов (тимоген, иммунофан и др.) [5]. Из растительных препаратов, стимулирующих реакции иммунитета, наиболее известны препараты на основе эхинацеи пурпурной (иммунал, иммунорм, доктор Тайсс настойка эхинацеи) [8, 12]. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной, Доктор Тайсс - настойку листьев эхинацеи. Использование лекарственных растений представляется перспективным направлением дальнейшего развития, совершенствования методов иммунореабилитации, так как препараты природного происхождения не обладают токсическими свойствами, характерными для синтетических лекарственных средств, и не вызывают дисбаланса системы иммунитета [1, 2].

Целью изобретения является расширение арсенала иммуностимулирующих средств.

Поставленная цель достигается использованием в качестве иммуностимулирующего средства жидкого экстракта корней алтея лекарственного, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола.

Основными биологически активными веществами корней алтея лекарственного являются полисахариды, органические кислоты, дубильные вещества, минеральные соли. В современной медицинской практике корни алтея лекарственного используются в качестве противовоспалительного, обволакивающего, отхаркивающего средства [7].

Новым в предлагаемом изобретении является то, что жидкий экстракт корней алтея лекарственного впервые предложен для использования в качестве иммуностимулирующего средства.

Использование жидкого экстракта корней алтея лекарственного, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, в качестве иммуностимулирующего средства в литературе не описано. Применение по новому назначению стало возможно благодаря обнаружению у него новых свойств, а именно стимуляции гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа и неспецифической резистентности. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Жидкий экстракт корней алтея лекарственного можно использовать у больных с иммунной недостаточностью, ассоциированной с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, на фоне лучевой терапии и лечения цитостатиками.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".

Новые свойства жидкого экстракта корней алтея лекарственного были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.

Для установления иммуностимулирующих свойств жидкого экстракта корней алтея лекарственного было изучено его влияние на гуморальный иммунный ответ, клеточный иммунный ответ, а также на неспецифическую резистентность организма. Жидкий экстракт корней алтея лекарственного получали методом реперколяции с помощью 40% этанола. Для получения экстракта: 0,450 кг воздушно-сухого сырья корня алтея лекарственного измельчают на измельчителе типа траворезки до частиц размером 3-4 мм. Затем измельченное сырье при помощи сита со стороной отверстия 0,25 мм освобождают от пыли (частиц менее 0,25 мм) и получают 0,400 кг готового сырья. Экстракцию ведут методом реперколяции в 4 перколяторах. Для этого 0,100 кг измельченного и освобожденного от пыли сырья помещают в перколятор 1 и заливают 500 мл 40% этанола до образования "зеркала" и оставляют на 12 ч при температуре 18-20°С. После 12 часов настаивания из перколятора 1 сливают 500 мл извлечения и заливают им 0,100 кг готового сырья в перколяторе 2 до образования "зеркала" с одновременной подачей в перколятор 1 аликвотного количества свежего экстрагента. После 12 часов настаивания из перколяторов 1 и 2 сливают последовательно по 500 мл извлечения. При этом перколятор 1 пополняется свежим экстрагентом, а перколятор 2 - извлечением из перколятора 1, перколятор 3 - извлечением из перколятора 2. Таким образом, повторяют операцию до четвертого перколятора через каждые 12 ч. После 12 часов настаивания осуществляют последовательную передвижку извлечений в объеме 500 мл от перколятора 1 к перколятору 4, из перколятора 4 сливают в отдельную склянку 100 мл извлечения - готового продукта стадии экстракции сырья, а из перколятора 1 сливают остатки извлечения (побочный продукт) в отдельную емкость, после чего оставшийся в сырье этанол вымывают двукратным количеством воды (рекуперат). Перколятор 1 освобождают от отработанного сырья. Далее в таком же порядке через каждые 12 часов производят передвижку извлечений, исключая из работы сырье из перколятора 2, 3, и производят слив готового продукта (жидкого экстракта) из перколятора 4. В остановочном периоде из последнего перколятора (4) через 12 часов сливают 100 мл извлечения и объединяют с извлечениями, полученными в рабочий период, и получают 400 мл жидкого экстракта, который отстаивают при температуре 3-5°С в течение 3-4 суток и фильтруют через 3 слоя бязи. Перед введением экстракт подвергают деалкоголизации путем выдерживания в термостате при температуре 37°С в течение 30 минут. Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ X1, том 2, стр.160).

В качестве препарата сравнения использовали настойку эхинацеи пурпурной («ГаленоФарм», г.Санкт-Петербург, разрешена к применению на территории России, рег. №000167.01-2000).

Эксперименты по изучению влияния экстракта корней алтея лекарственного (ЭА) на гуморальный иммунный ответ были проведены на 60 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 20 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 20 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурупурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 20 мышей получали деалкоголизированный ЭА, который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. При изучении гуморального иммунного ответа мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) - 6×10⁸/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения ЭА, ЭП или дистиллированной воды. На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общепринятыми методами [4] общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10⁶) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cunningham [11] и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА) [3].

Эксперименты по изучению влияния экстракта корней алтея лекарственного на клеточный иммунный ответ были проведены на 18 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 6 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 6 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурупурной (ЭП), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 6 мышей получали деалкоголизированный экстракт корней алтея лекарственного (ЭА), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. Для оценки влияния препаратов на клеточный иммунный ответ использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [9]. Через 24 часа после последнего введения экстрактов животных сенсибилизировали эритроцитами барана подкожно 1×10⁷ в объеме 100 мкл. Разрешающую дозу антигена (1×10⁸ в объеме 20 мкл) вводили на 5 день после сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей. В контралатеральную лапу в качестве контроля вводили физиологический раствор в равном объеме. Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена. Индекс воспаления (ИВ) определяли по разнице масс опытной и контрольной лап.

Эксперименты по изучению влияния экстракта корней алтея лекарственного на неспецифическую резистентность организма были проведены на 18 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 6 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 6 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 6 мышей получали деалкоголизированный экстракт корней алтея лекарственного (ЭА), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. Оценку неспецифической резистентности проводили путем изучения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови в тесте поглощения частиц латекса [4].

Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты, подтверждающие иммуностимулирующие свойства жидкого экстракта корней алтея лекарственного.

Пример 1. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт корней алтея лекарственного в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Затем мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана - 6×10⁸/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общее количество спленоцитов (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10⁶) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови. Курсовое введение настойки эхинацеи пурпурной приводило к достоверному увеличению относительного количества антителообразующих клеток на 4 и 7 сут после иммунизации и абсолютного числа антителопродуцентов на 4 сут эксперимента по сравнению с контролем (табл.1). Кроме того, отмечалось повышение титра иммуноглобулинов класса G на 4 сут. Анализ результатов, представленных в табл.1, показывает, что курсовое 5-дневное введение экстракта корней алтея лекарственного приводило к увеличению общей клеточности лимфоидного органа, абсолютного числа антителообразующих клеток и титра IgM относительно животных контрольной группы на 4 сут эксперимента. По сравнению с мышами, получавшими настойку эхинацеи, количество клеток-антителопродуцентов статистически значимо не возросло, однако увеличилась их функциональная активность, что выражалось в нарастании титров специфических гемагглютининов. Так, титр антител класса IgM в этой экспериментальной группе был достоверно выше во все сроки исследования.

Таблица 1 Влияние экстракта корней алтея лекарственного (ЭА) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m) Группа мышей Показатели Сроки исследования 4 сут 7 сут Контроль (ЭБ) ОКС, 10⁶/орган 159,20±16,50 149,8±7,71 АОК, % 7,36±0,10 7±0,21 АОК, 10⁶/орган 11,72±1,23 10,47±0,57 IgM, log₂T 2±0,32 2,2±0,32 IgG, log₂T 8,4±0,75 7,30±0,50 Опыт 1 (ЭП+ЭБ) ОКС, 10⁶/орган 190,00±22,67 163,00±10,85 АОК, % 11,44±0,49* 5,64±0,19* АОК, 10⁶/орган 21,89±3,20* 9,22±0,77 IgM, log₂T 2±0,32 1,2±0,49 IgG, log₂T 10,4±0,25* 10±0,32* Опыт 2 (ЭА+ЭБ) ОКС, 10⁶/орган 193,40±8,47* 171,50±25,47 АОК, % 7,44±0,76 # 7,00±0,41# АОК, 10⁶/орган 14,26±1,19*# 11,98±1,73# IgM, log₂T 4,00±0,32*# 4,25±0,25# IgG, log₂T 7,60±0,40# 7,50±0,50# Примечания: здесь и в табл.2, 3 * - различия с соответствующими значениями контроля достоверны; # - различия с соответствующими значениями группы «опыт I» достоверны.

Пример 2. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); животные 1-ой опытной группы получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно; мыши 2-ой опытной группы получали деалкоголизированный экстракт корней алтея лекарственного (ЭА), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Через 24 часа после последнего введения экстрактов животных сенсибилизировали эритроцитами барана подкожно 1×10⁷ в объеме 100 мкл. Разрешающую дозу антигена (1×10⁸ в объеме 20 мкл) вводили на 5 день после сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей. В контралатеральную лапу в качестве контроля вводили физиологический раствор в равном объеме. Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена. Индекс воспаления (ИВ) определяли по разнице масс опытной и контрольной лап. Приведенные в табл.2 результаты эксперимента свидетельствуют о существенном стимулирующем влиянии экстракта корней алтея лекарственного на процесс образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов.

Таблица 2 Влияние экстракта корней алтея лекарственного и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на клеточный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m) Группы мышей Контроль Опыт 1 (ЭП) Опыт 2 (ЭА) Индекс воспаления 18,05=1,04 18,53=1,96 28,63=2,85*#

Пример 3. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт корней алтея лекарственного (ЭА) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Через 24 ч оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей всех групп по способности этих клеток поглощать частицы латекса (концентрация взвеси частиц - 60 млн/мл); учитывали процент нейтрофилов, поглотивших частицы (фагоцитарный индекс - ФИ), и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ).

Приведенные в табл.3 результаты этих опытов показывают, что экстракт корней алтея существенно стимулирует поглотительную активность нейтрофилов периферической крови (по сравнению с контрольной группой) на 4 сут эксперимента. К 7 сут фагоцитарная активность исследуемых клеток у животных 2-й опытной группы была достоверно выше, чем у мышей контрольной и 1-й опытной групп, как за счет повышения доли нейтрофилов, способных поглощать латекс (ФИ), так и за счет увеличения количества поглощенных каждой клеткой частиц (ФЧ).

Таблица 3 Влияние экстракта корней алтея (ЭА) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей линии СВА/Са Lac (X±m) Группа мышей 4 сут 7 сут ФИ (%) ФЧ ФИ (%) ФЧ Контроль 22±1,22 2,06±0,23 17,25±1,80 3,79±0,62 Опыт 1 (ЭП) 32±3,91* 4,72±0,45* 23,8±2,13 4,52±0,23 Опыт 2 (ЭА) 18,4±1,99# 5,81±0,68* 32,2±1,93*# 6,76±0,35*#

Таким образом, жидкий экстракт из корней алтея лекарственного проявляет иммуностимулирующие свойства, что выражается в усилении гуморального иммунного ответа (повышение общей клеточности лимфоидного органа, количества антителообразующих клеток и титра специфических гемагглютининов), клеточного иммунного ответа (стимуляция процесса образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов) и фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, сравнимые по выраженности с настойкой эхинацеи пурпурной.

Источники литературы

1. Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. - 2003. - Прил.2. - С.24-34.

2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - №2. - С.145-151.

3. Иммунологические методы. / Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.211-218.

4. Иммунология: Практикум. / Е.У.Пастер, В.В.Овод, В.К.Позур, Н.Е.Вихоть. - К.: Выща шк. Изд-во при Киев. ун-те, 1989. - С.202-204.

5. Лесков В.П. Иммуностимуляторы // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 1999. - №4. - С.12-25.

6. Линов Б.М., Барнаулов О.Д., Крылов В.А. и др. Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1986. - С.89-90.

7. Положий А.В., Гольдберг Е.Д., Гуреева И.И. Лекарственные растения Сибири. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1995. - 325 с.

8. Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацеа (Echinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №4. - С.32-37.

9. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.

10. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996. - Т.74. - №8. - С.7-12.

11. Curnningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single anti-bodyforming cells // Nature. - 1965. - V.207, №5001. - P.1106-1107.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства, обладающего иммуностимулирующим действием, представляющего собой жидкий экстракт корней алтея, полученный методом реперколяции 40% этанолом. Средство расширяет арсенал иммуностимулирующих средств, усиливает гуморальный иммунный ответ, клеточный иммунный ответ и фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови. 3 табл.

Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой жидкий экстракт корней алтея, полученный методом реперколяции 40% этанолом.