СПОСОБ ПРОГНОЗА ОФТАЛЬМОГЕРПЕСА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в медицинской практике для прогноза течения офтальмогерпеса.

Способы прогноза офтальмогерпеса основаны на изучении иммунопатологических изменений при этом заболевании, сопровождающихся нарушениями числа и спектра субпопуляций лимфоцитов крови и изменениями цитокинового статуса больного (В.Б.Мальханов, 1997; A.Biglino, 1996).

Известен способ прогноза офтальмогерпеса (В.Б.Мальханов, Т.Н.Куренкова, А.Э.Бабушкин, "Офтальмологический журнал", 1981, №3, с.142-143) путем определения субпопуляций лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами барана. Недостатками этого способа являются его трудоемкость, субъективность в оценке результатов и небольшое число одновременно проводимых исследований.

Более современные методы определения субпопуляций лимфоцитов базируются на их иммунофенотипировании. Функциональную активность клеток крови, связанную с характером течения офтальмогерпеса, определяют по уровню синтеза ими цитокинов.

Наиболее близким по технической сущности является "Способ профилактики послеоперационных осложнений при проникающих корнеосклеральных ранениях глаза" (О.С.Слепова с соавт., Вестник офтальмологии, 1998, №3, с.28-32). Сущность метода заключается в однократном определении содержания фактора некроза опухоли α в сыворотке крови и слезной жидкости у больных офтальмогерпесом, при корнеосклеральных ранениях, катаракте, глаукоме, отслойке сетчатки. Авторами показана патогенетическая роль одного из цитокинов - фактора некроза опухоли α при офтальмогерпесе, а также корнеосклеральных ранениях, катаракте, глаукоме, отслойке сетчатки.

Недостатком данного способа прогноза является то, что патогенетическая роль других цитокинов и возможность использования их в качестве показателей тяжести течения герпеса глаза не изучалась. Кроме того, исследование содержания фактора некроза опухоли α определяли лишь однократно.

Цитокин IL-4 является ключевым медиатором иммунного ответа, обеспечивает проявление хелперных функций Т-лимфоцитов, а увеличение его уровня, как правило, связано с его гиперпродукцией или с регуляторным воздействием со стороны других цитокинов.

Техническим результатом изобретения является повышение частоты и сокращение времени прогноза течения офтальмогерпеса на основе определение содержания интерлейкина (IL) 4 в сыворотке крови и слезной жидкости у больных герпесом глаза в острый период заболевания.

Технический результат достигается путем определения содержания интерлейкинов в острый период заболевания, отличающийся тем, что одновременно в сыворотке крови и слезной жидкости исследуют уровень противовоспалительного IL-4, при его содержании в сыворотке крови в пределах 60-70 пкг/мл и в слезной жидкости - 5-15 пкг/мл прогноз течения заболевания оценивают как неблагоприятный, а концентрации IL-4 в пределах 90-100 пкг/мл в сыворотке крови и 20-30 пкг/мл в слезной жидкости - как благоприятный.

Преимуществом предлагаемого способа прогноза течения герпеса глаза является одновременное определение содержания противовоспалительного IL-4 в сыворотке крови и слезной жидкости в острый период офтальмоинфекции, протекающей тяжело и наиболее часто приводящей к слабовидению и слепоте. Подтверждением предлагаемого способа прогноза является совпадение содержания исследуемого цитокина с клиническим течением офтальмогерпеса более чем в 90% случаев.

Способ осуществляется следующим образом.

Из локтевой вены больного берут кровь натощак в строго стерильных условиях в количестве 5 мл. Пробирка с кровью больного центрифугируется для получения сыворотки.

Слезную жидкость забирают микропипеткой из конъюнктивального мешка в количестве 1 мл.

Определение уровня противовоспалительного IL-4 в сыворотке крови и слезной жидкости больных проводят твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием тест-систем ProСоn (ООО “Протеиновый контур”, С-Петербург).

В микропланшет с иммобилизованными антителами вносят по 100 мкл стандартов IL-4 и по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки и слезной жидкости больных. Планшет инкубируют 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, затем трижды промывают буфером и дважды дистиллированной водой. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую ячейку микропланшета вносят по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, разведенного буфером. Планшет инкубируют в течение 30 мин при +20-25°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляют и трижды промывают буфером, затем дважды дистиллированной водой. Планшет осушивают путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте на шейкере. Наблюдается развитие голубой окраски. Реакция останавливается добавлением 50 мкл серной кислоты в каждую лунку. Общее время постановки исследования 2,5-3 часа.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра “Multiscan” при длине волны 450 нм, устанавливают нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл. Нормальный уровень исследуемых цитокинов у здоровых людей, как правило, не превышает 50 пкг/мл.

У 86 больных офтальмогерпесом изучено содержание противовоспалительного IL-4 в сыворотке крови и слезной жидкости в острый период заболевания. Из локтевой вены больных взяли кровь натощак в строго стерильных условиях в количестве 5 мл. Пробирки с кровью больных центрифугировали для получения сыворотки. Слезную жидкость забирали микропипеткой из конъюнктивального мешка в количестве 1 мл.

Определение уровня противовоспалительного IL-4 в сыворотке крови и слезной жидкости больных проводили твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.

В микропланшет с иммобилизованными антителами вносили по 100 мкл стандартов IL-4 и по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки и слезной жидкости больных. Планшет инкубировали 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, затем трижды промывали буфером и дважды дистиллированной водой. Проводили полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую ячейку микропланшета вносили по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, разведенного буфером. Планшет инкубировали в течение 30 мин при +20-25°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляли и трижды промывали буфером, затем дважды дистиллированной водой. Планшет осушивали путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносили по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубировали в течение 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте на шейкере. Наблюдалось развитие голубой окраски. Реакция останавливалась добавлением 50 мкл серной кислоты в каждую лунку.

Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра “Multiscan” при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражали в пкг/мл.

В пределах 90-100 пкг/мл в сыворотке крови и 20-30 пкг/мл слезной жидкости оно было выявлено у 51 больного. При этом у 47 (92,2%) человек течение заболевания было благоприятным, воспалительный процесс был купирован в течение 14 дней. У 4 (7,8%) больных течение офтальмогерпеса было неблагоприятным, в течение 3 недель не происходило эпителизации роговицы, сохранялась воспалительная реакция. К концу 4 недели было отмечено стихание воспалительного процесса в глазу.

Содержание цитокинов в острый период заболевания в сыворотке крови в пределах 60-70 пкг/мл и в слезной жидкости - 5-15 пкг/мл обнаружено у 35 больных офтальмогерпесом, причем неблагоприятное течение данного заболевания (более 30 дней) наблюдали у 33 (94,3%), тогда как у 2 (5,7%) было отмечено непродолжительное (до 14 дней) благоприятное течение герпеса глаза.

Таким образом предлагаемый способ делает прогноз офтальмогерпеса достоверным в 92,2% и неблагоприятным в 94,3% случаев, то есть в целом правильным у 80 больных из 86 (93%).

Пример 1. Больной Ф. находился на стационарном лечении по поводу герпетического древовидного кератита. Определение цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости проводилось по выше описанной методике. В разгар заболевания содержание интерлейкина-4 в сыворотке крови было равно 66,7 пкг/мл, в слезной жидкости - 6,2 пкг/мл. Несмотря на проводимое противовирусное лечение, было отмечено поражение глубоких слоев роговицы с вовлечением в воспалительный процесс сосудистой оболочки. Был поставлен диагноз: метагерпетический кератит, острый иридоциклит. Больной находился на стационарном лечении 21 день. Таким образом, невысокое содержание IL-4 в сыворотке крови и значительное его снижение в слезной жидкости в острой стадии свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе течения офтальмогерпеса.

Пример 2. Больной С. Диагноз: древовидный герпетический кератит. Определение цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости проводилось по выше описанной методике. В разгар заболевания содержание противовоспалительного IL-4 в сыворотке крови было равно 94,7 пкг/мл, а в слезной жидкости - 29,3 пкг/мл. Стихание воспалительного процесса, резорбцию инфильтратов роговицы, отмечали к 10 суткам после начала заболевания. В этот срок сохранялась незначительная перикорнеальная инъекция склеры, глубокие оптические среды были спокойны. Установленные выше уровни IL-4 в сыворотке и слезной жидкости свидетельствуют о благоприятном прогнозе течения офтальмогерпеса.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза офтальмогерпеса позволяет определить содержание противовоспалительного IL-4 в острый период заболевания одновременно в сыворотке крови и слезной жидкости: при его содержании в сыворотке крови в пределах 60-70 пкг/мл и в слезной жидкости - 5-15 пкг/мл прогноз течения заболевания оценивают как неблагоприятный, а концентрации IL-4 в пределах 90-100 пкг/мл в сыворотке крови и 20-30 пкг/мл в слезной жидкости - как благоприятный.

Изобретение относится к иммунологической диагностике и может быть использовано для прогноза течения офтальмогерпеса. Сущность изобретения состоит в том, что одновременно в сыворотке крови и слезной жидкости исследуют уровень противовоспалительного IL-4, при его содержании в сыворотке крови в пределах 60-70 пкг/мл и в слезной жидкости - 5-15 пкг/мл прогноз течения заболевания оценивают как неблагоприятный, а концентрации IL-4 в пределах 90-100 пкг/мл в сыворотке крови и 20-30 пкг/мл в слезной жидкости - как благоприятный. Техническим результатом является повышение точности прогноза течения заболевания.

Способ прогноза офтальмогерпеса путем определения содержания интерлейкинов в острый период заболевания, отличающийся тем, что одновременно в сыворотке крови и слезной жидкости исследуют уровень противовоспалительного IL-4, при его содержании в сыворотке крови в пределах 60-70 пкг/мл и в слезной жидкости 5-15 пкг/мл прогноз течения заболевания оценивают как неблагоприятный, а концентрации IL-4 в пределах 90-100 пкг/мл в сыворотке крови и 20-30 пкг/мл в слезной жидкости - как благоприятный.