СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для прогнозирования клинического течения увеальной меланомы с целью увеличения продолжительности и качества жизни этого тяжелого контингента больных.

В настоящий момент существует способ прогноза клинического течения раковых заболеваний с помощью выявления в сыворотке крови повышенного титра раково-эмбриональных антигенов (РЭА) или альфа-фетапротеинов (АФП). АФП-гликопротеин с молекулярным весом в 70 kD синтезируется в норме в неонатальном периоде в печени и желточном мешке. У взрослых эти белки присутствуют в сыворотке периферической крови на низком уровне (до 5 мг/мл). Однако их уровни могут существенно повышаться у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, гормонально-активными опухолями, раком желудка и поджелудочной железы и при рецидивах этих опухолей после лечения ["Cellular and Molecular Immunology" W. B.Saunders Company - Second edition., 1996-p.366]. РЭА выявляются в повышенных титрах в сыворотке больных с карциномами толстого кишечника. Особенно части это имеет место на стадии метастазирования.

Таким образом, указанный способ позволяет прогнозировать клинику (рецидивы или генерализацию) определенных типов опухолей. Однако указанные иммунологические показатели не могут служить прогностическим маркером для увеальной меланомы, поскольку их высокие уровни редко выявляют даже на терминальной стадии заболевания (раковой кахексии), когда имеет место поражение сливными метастазами значительной части печеночной паренхимы, а не на субклинической стадии метастазирования.

Вместе с тем выявление метастазов у больных увеальной меланомой в корне меняет тактику его лечения. Оперативное лечение при диссеминированных формах большинства опухолей не показано. Возможна лишь химиотерапия, адъювантная иммунокорректирующая терапия в комбинации с симптоматической. То-есть мы имеет дело с принципиально различными лечебными подходами при переходе неопластического процесса в стадию метастазирования.

На сегодняшний момент не существует достаточно информативного маркера увеальной меланомы, позволяющего прогнозировать течение клинического процесса и, что особенно важно, переход к генерализации и, следовательно, определять тактику лечения больного.

Согласно последним данным [Eskelin S. et al. Diagnosis and Screening of Disseminated malignant uveal melanoma. - in Symposium Ophthalmooncology, 1987, Erusalim] ранние первые признаки диссеминированных форм увеальной меланомы могут быть выявлены с помощью комплексного метода, включающего биохимическое исследование сыворотки периферической крови с определением уровня ряда ферментов (S-GOT, S-GPT, S-AFOS, S-LDH) и ультразвуковое исследование. Наличие метастазов может быть констатировано лишь при одновременном подтверждении двумя методами исследования. Однако, по данным автора, только у 54% больных на фоне уже диагностированных инструментальными методами метастазов зафиксированы в сыворотке повышенные уровни ферментов (LDH-13, GOT-10, AFOS-8, GPT-7). Ультразвуковые исследования были ложноположительны у 27 пациентов (77%), включая 14 больных с нормальными энзимными уровнями и у 2-х с ложноотрицательными. Однако, несмотря на высокий процент выявления больных с метастазами (57%), способ имеет существенные недостатки. Показатели крови можно принимать во внимание, если они совпадают с данными инструментальных методов (компьютерной томографией, УЗИ или сцинтиграфией), в противном случае повышение уровня ферментов может быть расценено как проявление заболеваний печени (гепатитом, циррозом и т.д.) Кроме того, достаточно высок процент больных (43%), у которых обнаружены на фоне явных метастазов нормальные уровни ферментативной активности печени (ложноотрицательные пробы).

Известно, что метастазы поражают печень только в 61% случаев [Zimmerman L. E. An evaluation of enucleation in management of uveal melanomas //Am.J. Ophthalmol. -1979-87. -p. 741-760. ; Zimmerman L.E. Do growth and onset of symptoms of uveal melanomas indicate subclinical metastasis?//Ophthalmol.-1984-Vol. 91.-N 6.-p.685-691]. По материалам Jensen, полученным при вскрытии 38 больных, только у 17 было изолированное поражение печени; причем об очередности органного появления метастазов информации не представлено [Jensen O. A. Malignant melanoma of the uvea in Denmark// Acta Ophthalmol-1970-48. -p. 1113-1128; Jensen O.A. Malignant melanomas of the human uvea: 25-year follow-up of cases in Demnark, 1943-1952// Acta Ophthalm.-1982-60-p. 161-182] . Реже поражаются легкие (55%), головной мозг (22%), почки (44%), желудочно-кишечный тракт, кожа, подкожная клетчатка [Einchorn L.H. "Metastasis patterns of choroidal melanoma".// Canser-1974-Vol 34, N 4-p 1001-1004] . В довольно большом числе случаев многие органы поражаются одновременно.

Таким образом для 49% больных увеальной меланомой, метастазирующей в другие органы (легкие, кожу, кости), вышеуказанный способ не может быть использован.

Кроме того, существуют и другие недостатки. Определяется одновременно несколько различных показателей и лишь выявление множественных отклонений от нормы указывает на ухудшение прогноза.

Предлагаемый нами способ базируется на экспериментальных данных о роли ИФН-α в механизмах иммунной защиты при онкологических заболеваниях вообще и при увеальной меланоме в частности; их специфических антипролиферативных функций, а также собственных результатах обследования и наблюдения 108 пациентов с различными стадиями этого заболевания на протяжении 4 лет. Полученные нами данные были сопоставлены с клиникой и данными инструментального обследования, подтверждающими или отрицающими наличие у них метастазов.

С момента открытия интерферонов их семейство является объектом пристального внимания ученых всего мира. К настоящему времени, несмотря на то, что основной спектр их биологической активности в основном изучен, есть ряд не установленных моментов, поскольку изучение велось либо in vitro, либо in vivo введением экзогенного рекомбинантного ИФН, что сопровождалось каскадным выходом других компонентов цитокиновой сети. Эффекты этих цитокинов, накладываясь друг на друга, путали картину [Ершов Ф.И. Интерфероны в норме и патологии. Москва, "Медицина", 1996, с.104].

Семья интерферонов включает в себя три известных типа: альфа-интерферон (ИНФ-α, лейкоцитарный), бета-интерферон (фибробластный) и гамма-интерферон (иммунный). Спектры биологического действия этих типов частично перекрываются.

Эффекты интерферонов при вирусной патологии у человека изучены достаточно полно, однако вопрос о их роли в неопластических процессах остается открытым. Механизм реализации биологических эффектов, как и у всех цитоксинов, единый и заключается во взаимодействии выделившегося интерферона с рецептором к нему, встроенным в мембрану воспринимающей сигнал клетки. Строение рецептора для разных типов интерферона различно, вследствие чего он приобретает исключительную специфичность и афинность.

Эндогенный ИНФ-α играет важную роль в естественном выздоровлении от вирусной инфекции, а блокада системы ИФН, напротив, приводит к увеличению заболеваемости и смертности. Кроме того, она может превращать авирулентные вирусные инфекции в крайне тяжелые или смертельно опасные [Ройт А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1991, с.297].

Основными эффектами ИНФ-α являются антипролиферативный и противовирусный. Однако спектр биологического действия ИФН-ов в настоящее время существенно расширен. Так, стало известно, что ИНФ-α способен модулировать активность и других клеток, например, нормальных киллеров (НК). Исследования in vitro показали, что в функции НК входит уничтожение зараженной вирусом или клетки-мутанта до того момента, как она начнет размножаться.

НК узнают определенные структуры высокомолекулярных гликопротеинов, которые экспрессируются на мембране инфицированных вирусом или мутировавших клеток. Благодаря этому НК отличают такие клетки от нормальных. В результате они активируются, и содержимое гранул выбрасывается во внеклеточное пространство. Гранулы НК содержат две сериновые протеиназы, которые могут функционировать как цитотоксические факторы, но не вполне ясно, принадлежит ли им главная роль в НК-зависимом лизисе. Различные ИФН усиливают цитотоксичность НК на различных уровнях.

Доказано, что многие ИФН или их антагонисты обладают терапевтическим потенциалом в процессах злокачественной трансформации. Ряд из них может оказывать цитостатический или цитотоксический эффект на опухолевые клетки [Vedantham S. "Mechanism of interferon action in hairy cell leukemia: A Model of effective cancer biotherapy". Cаncer Res 1992; 52; 1056-1066; Garbe C. "Effectes of interferons and cytokines on melanoma cells" J.Invest Dermatol, 1993, vol.100 p.239-244].

Дефекты системы ИФН влекут за собой расстройства функций естественной противоопухолевой резистетности и, как следствие, повышение риска развития онкологических заболеваний или невозможность избавления от них. Представители Одесской школы офтальмоонкологов приводят в качестве доказательства факты, свидетельствующие, что введение ИФН-α в комплексное лечение увеальной меланомы наряду с известными традиционными методами органосохранного лечения (фотокоагуляция, брахитерапия) повышает эффективность проводимой терапии. Препараты ИФН повышают факторы естественной противоопухолевой резистентности и способствуют опухолевой регрессии. Результат такого комплексного лечения суммируется из физической деструкции клеток, вызываемой локальным облучением, а также активации различных биологических механизмов, направленных на углубление деструкции поврежденных клеток, резобцию и выведение из организма продуктов клеточного распада, а также иммунных реакций, направленных на борьбу с возможным метастазированием [Величко Л.Н. и др. "Состояние системы естественной противоопухолевой резистентности у больных увеальной меланомой при проведении органосохранного лечения". - Офтальмологический ж-л, 1998, стр. 131-137].

При излучении действия ИФН in vitro на культурах различных меланомных увеальных линий установлен неоднозначный, ингибирующий пролиферацию эффект, например, он подавлял пролиферацию в концентрации 50 ЕД/мл в культуре меланомных опухолевых клеток увеальной линии 92-1 и не влиял на культуру Mel 202, в то время как ИФН-γ действовал одинаково интенсивно на обе клеточные линии. При этом отмечено, что ИФН-α увеличивал экспрессию мономорфного HLA I класса, но не HLA II класса [I de Waard-Siebinga et al "Establishment and characterisation of an uveal melanoma cell line". Int.J.Cancer, 1995, vol. 62, p.155-61].

Антипролиферативное действие ИФН осуществляется несколькими механизмами. Так, естественный и рекомбинантный ИФН-α подавляет пролиферативный ответ мононуклеаров крови человека на митогены и аллогены за счет регенерации специфической цитотоксичности.

Исходя из известных литературных данных, свидетельствующих о важных контрольно-регуляторных функциях ИФН-α, полученных на основе экспериментов in vitro и ex vivo с опухолевыми моделями и опухолевыми линиями, в также данных, свидетельствующих о возможности использования показателей системной продукции ИФН в качестве прогностического маркера при ряде инфекционных заболеваний [Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. 1996 стр. 133. Москва. Медицина], мы предположили, что определение уровня ИФН-α в периферической крови у больных с увеальной меланомой может оказаться существенным при определении прогноза.

Основанием для разборки способа послужили данные, полученные при обследовании 108 пациентов с различными стадиями увеальной меланомы (T₁N₀M₀-T₄N₀M_hep'cut.); 60 человек прослежено в динамике на протяжении от 6 месяцев до 4 лет.

37 пациентам произведены энуклеация глазного яблока, поскольку размеры опухоли и ее локализация не позволяли произвести органосохранную операцию. Еще двум пациентам произвели отсроченную энуклеацию спустя 6 месяцев - 1,5 года после брахитерапии из-за появления признаков вторичной гипертензии, неуправляемой медикаментозно. В трех случаях удаление глаза проведено в связи с обширной склеромаляцией постлучевого генеза (при наличии остаточной опухоли). Трем пациентам с поздним первичным обращением к врачу вынуждены были производить экзантерацию из-за прорастания опухоли в орбиту.

44 пациента получили только брахитерапию; причем у двух пациентов в связи с продолженным ростом в рубце спустя 1,5 - 2 года брахитерапию повторили; у четырех больных размеры опухоли позволили ограничиться только фотокоагуляцией опухоли. Одной пациентке с шестилетним стажем заболевания пришлось трижды проводить фотокуагуляцию и дважды брахитерапию.

Трем пациентам произведена блокэксцизия опухоли (локальное удаление опухоли радужки и цилиарного тела).

Под наблюдением также находились 11 пациентов с генерализованной стадией увеальной меланомы: два человека обратились к врачу уже имея метастазы в печени, в 9 случаях метастазирование наступило в различные сроки после энуклеации (6 месяцев - 5 лет).

Результаты иммунологических исследований больных прослежены в динамике до четырех лет, сопоставлены с клиническим течением неопластического процесса. Ретроспективный анализ полученных данных позволил установить определенную взаимосвязь иммунологических показателей с клиникой, что позволило использовать фактический материал для разработки предлагаемого нами способа прогноза.

Дифференцированный анализ показал, что начальная стадия увеальной меланомы характеризуется выраженным снижением продукции ИФН-α (6,6 - 23 пкг/мл) в сыворотке (p < 0,01), при частоте обнаружения аналогичной донорским показателям (50%). Донорские уровни колебались от 25,6 до 100 пкг/мл.

Стадия генерализации меланомы отличалась гиперпродукцией ИФН-α в 88,2% случаев. Уровни его колебания от 360 до 500 пкг/мл.

Больные с увеальной меланомой в стадиях T_2-3N₀M₀ составили как бы промежуточную группу. У большинства пациентов (62,6%) на этих стадиях отмечалась тенденция к усугублению дефицита интерферонопродукции по сравнению со стадией T₁N₀M₀. Это выражалось и в тенденции к более редкому выявлению ИФН-α в СК (36,8%). Однако в ряде случаев (2/19 - 10,5%) выявляемые уровни были выше донорских показателей (160-20 пкг/мл). В связи с этим представляют интерес особенности интерферопродукции двух пациентов, обследование которых было проведено в сроки за два и четыре месяца до диагностирования метастазов в печени. У них был обнаружен ИФН-α в концентрации 250 и 160 пкг/мл, что в целом было характерно для больных с диссеминированной формой меланомы и позволило заподозрить стадию субклинического метастазирования. Предположение подтвердилось дальнейшим развитием заболевания.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего прогнозировать клиническое течение заболевания у каждого конкретного больного.

Техническим результатом является объективизация и повышение точности прогнозирования.

Технический результат достигается за счет исследования ИФН-α как фактора неспецифической иммунной защиты, принимающего участие на различных патогенетических звеньях.

Тест по выявлению уровня ИФН-α производится с помощью иммуноферментного анализа (используют коммерческие тест-системы для определения ИФН-α "Протеиновый контур", Санкт-Петербург). Использование нами тест-системы позволили определить ИФН-α в интервале концентраций 5-1000 пкг/мл.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Забирают периферическую кровь из локтевой вены в сухую пробирку в объеме не менее 1 мл. Сыворотку и слезную жидкость получают обычным способом. Всего при постановке ELISA на ИФН-α нужно не более 200 μкл исследуемой пробы, которую можно получить из 1 мл сыворотки.

2. Путем центрифугирования после 30-минутной инкубации в термостате получают сыворотку, которую используют для последующих исследований.

3. После двухкратного промывания лунок планшета вносят 300 мкл буфера соответствующего разведения, предоставляемого тест-системой фирмой-изготовителем, в каждую лунку, затем аспирируют жидкость.

4. Растворяют содержимое ампул со стандартными препаратами, внося по 1 мл буфера для образцов в каждую лунку.

5. В ячейки планшета, предназначенные для нулевой пробы (Blank), вносят по 100 мкл буфера C. В ячейки планшета, предназначенные для калибровки значений, вносят по 100 мкл стандартов ИФН-α.
6. В оставшиеся ячейки планшета вносят исследуемые образцы сыворотки в объеме 200 мкл. Инкубируют.

7. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером B (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

8. Пипеткой вносят в каждую лунку по 100 мкл раствора вторых антител (находящихся в тест-системе). Вновь инкубируют 1 час.

9. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером B (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

10. Разбавляют необходимое для анализа количество конъюгатом стрептовидина с пероксидазой хрена (буфером C) и вносят по 100 мкл раствора в каждую ячейку планшета.

11. После инкубации удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером B (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

12. Дважды промывают ячейки путем постукивания по поверхности стока, покрытого фильтровальной бумагой.

13. Вносят во все лунки по 100 мкл раствора субстрата с красителями.

14. После инкубации в течение 15-30 минут в защищенном от света месте и развития голубой окраски реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора серной кислоты в каждую лунку.

15. Проводят учет результатов с использованием автоматического фотометра при длине волны 450 нанометров, устанавливая нулевое поглощение по нулевой лунке.

16. Строят калибровочную кривую - оптическая плотность/концентрация, на которой определяют графически концентрацию ИФН в образцах.

В случае превышения уровня ИФН-α ≥ 160 пкг/мл считают прогноз клинического течения увеальной меланомы неблагоприятным с повышением риска метастазирования. Такой больной нуждается в срочном проведении адекватной иммунокоррекции под контролем иммунологических показателей.

Пример 1. Больная 57 лет. Поступила с диагнозом увеальная меланома правого глаза в стадии T₃N₀M₀; вторичная болящая глаукома. Левый глаз здоров. Отсутствие метастазов в момент госпитализации подтверждено всеми доступными инструментальными методами. Сывороточный уровень ИФН-α в момент госпитализации 25 пкг/мл (нормальный уровень). Учитывая размеры опухоли, наличие неблагоприятных факторов в виде вторичной гипертензии и болевого синдрома, больной произведена энуклеация. Спустя 6 месяцев на контрольном осмотре больная вновь обследована с определением уровня ИФН-α в СК. Значение не превышало 50 пкг/мл. В момент осмотра больная имела заключение общего онколога об отсутствии метастазов. Данные подтверждены рентгенографией легких и томографией печени. Пальпация доступных лимфатических узлов не выявила отклонений от нормы. Год спустя больная вновь появилась на осмотр. Обследование сыворотки на ИФН-α обнаружило повышенные уровни - 500 пкг/мл. Направлена на обследование к вирусологам, поскольку возникло предположение о наличии у пациентки вирусной или бактериальной инфекции. Не обнаружено данных, подтверждающих факт хронической персистирующей инфекции (исключены гепатиты A, B, C, цитомегало-вирусная, герпес, токсоплазмоз, туберкулез и т.д.). Данных за наличие симптомов острой инфекции на момент осмотра также нет (жалоб не предъявляет, симптомов нет). Спустя 3 месяца после обследования почувствовала слабость, утомляемость, обратилась к онкологам, которые заподозрили метастазирование и провели сцинтиграфию. Предположение нашло подтверждение: в левой доле печени обнаружены два "холодных узла" (доказательства наличия метастазов). Уровень ИФН-α продолжал оставаться высоким 480 пкг/мл.

Как видим из приведенного примера, повышение исходных сывороточных уровней ИФН-α опережало клинику задолго до появления первых симптомов, как и диагностические возможности инструментальных методов исследования. Определение концентрации ИФН-α может служить диагностическим маркером метастазирующей увеальной меланомы, а возможно и других неопластических процессов.

Пример 2. Больной Н., 23 года. Поступил в стационар с диагнозом увеальной меланомы левого глаза в стадии T₂N₀M₀. Размеры опухоли составляли при ультразвуковом исследовании 4,1 мм в высоту и 9,2 мм² в диаметре, что позволяло провести плановую брахитерапию, которая прошла без осложнений. ИФН-α в сыворотке накануне лечения не обнаружен. На контрольном осмотре спустя 6 месяцев зафиксирована частичная регрессия опухоли с остаточными явлениями лучевой хориоретинопатии. Размеры опухоли на УЗИ: проминенция 2,2 мм, диаметр основания 7 мм². Иммунологический контроль проведен: ИФН-α в СК = 7,8 пкг/мл. При повторной явке год спустя после проведенной брахитерапии на глазном дне плотный рубец с хорошо выраженной пигментацией и приминенцией до 1 мм. Контрольный уровень ИФН-α- не обнаружен. Данные инструментального обследования подтвердили отсутствие метастазов в организме.

Пример 3. Больной В., 62 года. Диагноз: увеальная меланома левого глаза в стадии T₃N₀M₀ (юкстапапиллярной локализации и грибовидной формы). При исследовании сыворотки на ИФН-α до госпитализации (в порядке амбулаторного обследования) обнаружены повышенные уровни - 160 пкг/мл. Несмотря на отсутствие инструментальных данных, подтверждающих наличие метастазов (УЗИ печени и рентгенографии грудной клетки), больной отнесен в группу риска возникновения метастазов и взят под контроль; спустя 2 месяца вновь вызван в МНИИ ГБ им. Гольмгольца. Досрочно была проведена сцинтиграфия печени. Выявлен "холодный узел" в правой доле. Диагноз исправлен на T₃N₀M_hep. Учитывая отсутствие показаний для энуклеации, больному назначена адъювантная терапия, которую он до настоящего момента проводит.

Таким образом, полученные данные по продукции ИФН-α в сыворотке крови с ретроспективным анализом клинического течения позволяют утверждать, что с помощью иммунологических исследований в рамках указанного параметра возможно проведение прогноза клинического течения увеальной меланомы. Ценность предлагаемого нами способа заключается в том, что он также позволяет произвести оценку эффективности проводимого нами лечения, скорректировать его на каждом анализируемом этапе, осуществить отбор больных с повышенным риском метастазирования и провести своевременную адекватную иммунокоррекцию под иммунологическим контролем. Способ информативен, малотрудоемок при большой практической ценности.

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для прогнозирования клинического течения увеальной меланомы и оценки эффективности проводимого лечения с целью увеличения продолжительности и качества жизни этого тяжелого контингента больных. Способ включает исследование уровня ИФНα сыворотки и при концентрации, превышающей ≥160 пкг/мл, прогнозируют ухудшение клинического течения заболевания с повышением вероятности метастазирования. Констатация подобного состояния является показанием к проведению адекватного иммунокорректирующего лечения под контролем иммунологических показателей. Способ позволяет оценить состояние больного в отношении риска возникновения метастазов и своевременно назначить адекватное иммунокорректирующее лечение.

Способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, включающий количественное определение факторов неспецифической защиты в сыворотке крови, отличающийся тем, что в качестве такого фактора определяют концентрацию интерферона-альфа и при повышении его уровня до 160 пкг/мл и более прогнозируют ухудшение клинического течения.