Изобретение относится к области медицины и, в частности, касается средства, обладающего антикоагулянтным и иммунотропным действием.
Среди известных фармацевтических препаратов антикоагулянтного действия широко применяется гепарин - антикоагулянт прямого действия. Однако гепарин является лекарственным препаратом животного происхождения, а его применение в клинике может вызывать ряд побочных эффектов. Наибольшую опасность при гепаринотерапии представляет снижение свертываемости крови, тромбоцитопения, возникновение желудочно-кишечных кровотечений, гематурия, кожные геморрагии, аллергические реакции, а после его отмены у больных могут возникать тромбоэмболитические осложнения в виде так называемых "рикошетных" тромбозов [1, 2, 3]. Кроме того, гепарин в высоких дозах (100-200 мг/кг) проявляет иммунодепрессивные свойства путем угнетения формирования антителобразующих клеток [4], а также индуцирует депрессию в системе нейтрофильных гранулоцитов [5].
В настоящее время следует считать актуальной задачей необходимость поиска новых высокоэффективных, малотоксичных физиологически активных препаратов из доступных природных источников, в том числе антикоагулянтов прямого действия растительного происхождения. Наибольшее признание в качестве таких веществ получили соединения полисахаридной природы. Их низкая токсичность для организма, большая степень свободы дозирования, экологически чистые и экономичные технологии производства привлекают внимание исследователей.
Известен антикоагулянт растительного происхождения, представляющий собой гепариноподобный полисахарид, связанный с пептидом, характеризующийся молекулярной массой 5-6 кДа, и выделенный экстракцией водой корней пиона древовидного [6].
Бурые водоросли являются богатым и легко возобновляемым сырьевым источником интересных по структуре и физиологической активности полисахаридов. Эти источники, наряду с широко известной альгиновой кислотой, содержат уникальные водорастворимые полисахариды - ламинараны и фукоиданы, которые пока не нашли широкого практического использования. Из этих полисахаридов наибольший интерес представляют фукоиданы, которым принадлежит основная роль в биологическом действии водорослей. У фукоиданов обнаружены антикоагулянтная, противоопухолевая, гиполипидемическая, антивирусная (в том числе против ВИЧ-инфекции) активности [7-9].
Несмотря на то что антикоагулянтные свойства сульфатированных полисахаридов известны давно, существует проблема их терапевтического применения, с одной стороны, по причине сравнительно высокого остаточного содержания протеинов, что чревато риском иммунногенных явлений, а с другой стороны, по причине их высокого молекулярного веса (100-800 кДа), результатом которого является плохая растворимость, которая в значительной мере ограничивает их применение в высоких концентрациях.
Обнаружено, что для фукоиданов величина оптимальной молекулярной массы для проявления ими антикоагулянтной активности лежит в диапозоне 10-50 кДа. Чтобы получить фракции с оптимальной молекулярной массой дополнительно проводят кислотный или радикальный гидролиз в присутствии соли меди. Это требует дополнительных затрат и усложнения процесса получения фукоиданов с антикоагулянтными свойствами [7]. Кроме того, рассечение на фрагменты длинной полисахаридной цепи фукоидановых молекул требует использования процесса лизиса, который необходимо контролировать таким образом, чтобы избежать чрезмерного разложения фукоидана, ведущего к потере его свойств.
В связи с этим поиск в бурых водорослях низкомолекулярных фукоиданов, обладающих антикоагулянтным и иммунотропным действием, является актуальной задачей.
Описана антикоагулянтная и стимулирующая липолиз активность сульфатированных полисахаридов из дальневосточных бурых водорослей, таких как Laminaria japonica, L. cichorioides, Sphaerotrichia divaricata, Costaria costata и Pelvetia wrightii [10]. При этом только сульфатированный полисахарид из Sphaerotrichia divaricata показал сравнимую с гепарином антикоагулянтную активность. Этот сульфатированный полисахарид выделен в виде соли кальция путем экстракции водоросли смесью метанол, хлороформ, вода, затем хлористым кальцием, высаждением солевого продукта цетавлоном с последующим получением кальциевой соли фукоидана и высаждением этанолом [11]. Полисахариды, выделенные из остальных водорослей, показали слабое антикоагулянтное действие.
Сульфатированный полисахарид из Sphaerotrichia divaricata охарактеризован следующими параметрами: содержание SO3Са
Задачей изобретения является расширение арсенала лекарственных средств из бурых водорослей с антикоагулянтным и иммунотропным действием.
Задача решена новым средством, обладающим антикоагулянтным и иммунотропным действием, характеризующимся тем, что оно представляет собой фукоидан, полученный путем экстракции водой бурой водоросли Fucus evanescens при температуре 20-60°C с последующим осаждением этанолом. Средство имеет молекулярную массу 20000-40000 дальтон и содержит нейтральные моносахариды: фукозы - 70-80%, галактозы - 2-9%, ксилозы - 5-10% и глюкозы - 2-7%, а также - сульфатов - 20-22%, при этом интенсивные сигналы в спектре 13С-ЯМР при 16,0-18,0 м.д. и полосу поглощения в ИК-спектре при 820-822 см-1.
Антикоагулянтное действие заявляемого фукоидана из Fucus evanescens характеризуется следующими параметрами при испытании in vitro: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) от 80 до 900 с, тромбиновое время (ТВ) от 40 до 400 с в зависимости от дозы. По антикоагулянтному действию оно сравнимо с гепарином, который также оказывает дозозависимый эффект.
Экспериментально установлено, что заявляемое средство в большом диапазоне доз в отличие от гепарина обладает иммунотропным действием.
Источник получения нового средства - бурая водоросль Fucus evanescens с практической точки зрения имеет преимущество перед другими видами водорослей, и, в частности, перед Sphaerotrichia divaricata. Это преимущество заключается в том, что водоросль Fucus evanescens имеет обширный ареал распространения, растет на мелководье и легко доступна.
Получение фукоидана.
Свежую или замороженную (после дефрастации) водоросль Fucus evanescens обрабатывают этанолом с целью ее обезжиривания и удаления пигмента. Затем водоросль сушат на воздухе, грубо измельчают и обрабатывают водой (1:20 вес/объем) сначала при комнатной температуре (5 часов), а затем при 50-60°С при перемешивании в течение 5 часов. Экстракт концентрируют при пониженном давлении до 1/4-1/5 первоначального объема и доводят рН суспензии до значения 3,0. Затем отделяют образовавшийся осадок центрифугированием, доводят рН супернатанта до нейтрального титрованием гидроокисью натрия, диализуют против воды. Затем высаждают натриевую соль фукоидана двумя объемами 96% этанола. Осадок трижды промывают 50% водным этанолом и сушат 96% этанолом. Получают целевой продукт с выходом 7,5-10% (от веса сухой водоросли).
Фукоидан, полученный из бурой водоросли Fucus evanescens, имеет следующие физико-химические характеристики:
- порошок кремового цвета хорошо растворим в воде, диметилсульфоксиде,
- нерастворим в спирте, ацетоне, гексане, серном эфире;
- молекулярная масса: 20000-40000 дальтон (определена методом гель-фильтрации с применением Superdex 75 HR 10/30 Amersham Pharmacia Biotech AB, анализ фракций фенол-сернокислотным методом [12]);
- содержание сульфатов: 20-22%; степень сульфатирования определена после гидролиза образцов 4N HCl при 100°С, используя турбидиметрический метод [13];
- содержание нейтральных моносахаридов: фукозы - 70-80%, галактозы - 2-9%, ксилозы 5-10%, глюкозы 2-7%.
Моносахаридный состав определен высокоэффективной жидкостной хроматографией. Образцы полисахаридов (5 мг) подвергали гидролизу 4N HCl при 100°С (2 ч). Моносахаридный состав продуктов кислотного гидролиза определяли методом ВЭЖХ на углеводном анализаторе IC-5000 Biotronik (смола Durrum DA-Х8-11, колонка 385×3,2 мм, 60°С), обнаружение проводили бицинхонинатным методом [14]; интегрирующая система Shimadzu С - R2 АХ). Моносахариды (Rha, Rib, Man, Fuc, Gal, Xyl, Glc) использовали как стандарты для ВЭЖХ.
- ИК-спектр (КВr), см-1: 1230-1255 (S=O), 900-950 (ОН), 820-822 (C-O-S);
ИК-спектры полисахаридов регистрировались для КВr таблеток исследуемого образца на спектрометре Carl Zeiss IR-75 (фиг.1);
- 13С-ЯМР-спектр представлен в виде кривой (фиг.2);
13С-ЯМР спектры были получены при 60°С на ЯМР-спектрометре Bruker-Physic WM-250 с рабочей частотой 62,9 МГц в D2O при температуре 70°С. Образцы полисахаридов растворяли в D2O.
Острую токсичность исследовали на неинбредных мышах. Заявляемое средство нетоксично при его внутрибрюшинном введении в дозах от 0,05 до 100 мг/кг.
Исследование антикоагулянтного действия.
Влияние фукоидана на показатели коагулограммы изучали в тестах in vivo и in vitro. Исследования in vitro проводили на бедной тромбоцитами плазме, полученной от здоровых доноров. Фукоидан вносили в плазму в дозах от 1 до 1000 мкг/мл плазмы, гепарин - в дозе 1,0 Ед/мл плазмы. Исследования in vivo проводили на мышах линии BALB/c, которым вводили фукоидан внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг. Смесь образцов плазмы крови получали от 10-15 животных через 15, 30, 60 и 180 мин после введения препарата.
Изучали следующие параметры коагулограммы с использованием реактивов фирмы "Технология-Стандарт" (Россия) и коагулометра CD-4 фирмы "Diamed" (Швейцария): 1) активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) для оценки внутреннего механизма свертывания; 2) протромбиновое время (ПВ) для оценки внешнего механизма свертывания; 3) тромбиновое время (ТВ) для оценки конечного этапа свертывания. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Влияние фукоидана на показатели АПТВ и ТВ у мышей BALB/c in vivo
Однократное внутрибрюшинное введение мышам фукоидана в дозе 5 мг/кг приводило к гипокоагуляции, о чем свидетельствует увеличение по сравнению с контролем времени свертывания в АПТВ в 3,3 раза и по ТВ - в 4,7 раза через 15 мин после инъекции. По истечении же 30 мин время свертывания в этих тестах отличалось от контрольного в 1,8 раза, а через 60 мин исследованные показатели возвращались к нормальному уровню.
Изучение влияния фукоидана in vitro на показатели АПТВ, ПВ и ТВ в пулированной контрольной, нормальной плазме здоровых людей представлены в таблице 2.
Влияние фукоидана на показатели АПТВ, ТВ и ПВ in vitro
Под влиянием фукоидана наблюдалось дозозависимое удлинение времени свертывания во всех использованных коагуляционных тестах. Из представленного материала следует, что оптимальная концентрация фукоидана для проявления максимального антикоагулянтного эффекта находится в интервале 50-100 мкг/мл. Аналогичным дозозависимым эффектом обладает, как известно, и гепарин.
Исследование иммунотропного действия.
Нами проведено сравнительное изучение не только антикоагулянтного, но и иммунотропного действия средства из Fucus evanescens при условии внутрибрюшинного введения неинбредным мышам в большом диапазоне доз (от 5 до 100 мг/кг) и гепарина в дозе 100 мг/кг на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов перитонеального экссудата. С этой целью использовали тесты по изучению фагоцитарной функции нейтрофилов (фагоцитарный показатель - ФП и фагоцитарное число - ФЧ) и активности кислородзависимых механизмов их бактерицидности (тест восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест спонтанный). Под влиянием фукоидана как в малой (5 мг/кг), так и в большой (100 мг/кг) дозах наблюдалось статистически достоверное по сравнению с контролем увеличение ФП и ФЧ, тогда как при введении гепарина выявлено значительное снижение (р≤0,01) этих показателей (табл.3).
Фагоцитарная активность и уровень кислородзависимых механизмов бактерицидности (НСТ-тест) нейтрофилов перитонеальной полости мышей.
Под действием фукоидана повышались также показатели НСТ-теста: на 33% при введении малой дозы (р≤0,05) и на 71% при введении большой дозы (р≤0,01), а под действием гепарина наблюдалось угнетение активности кислородзависимых механизмов бактерицидности (до 70%, р≤0,01). Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени различий (р≤0,01) всех показателей функциональной активности нейтрофилов в группах животных, которым вводили фукоидан в сравнении с группой мышей, получивших гепарин.
Таким образом, фукоидан как в большой, так и в малой дозах стимулировал фагоцитарную и бактерицидную активность нейтрофилов, а гепарин в большой дозе оказывал депрессивный эффект на эти функции. Последнее согласуется с результатами [5] по индуцированию иммунодефицита в системе нейтрофильных гранулоцитов путем внутрибрюшинного введения гепарина в дозах 100-200 мг/кг.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что заявляемое средство проявляет сравнимую с гепарином антикоагулянтную активность, но в отличие от последнего обладает иммуностимулирующим действием в широком диапазоне доз. Низкий молекулярный вес обеспечивает его растворение в воде и кислых растворах даже при высокой концентрации, что обуславливает возможность терапевтического применения нового средства из бурых водорослей.
Литература
1. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. - М.: "Ньюдиамед". 2001. 296 С.
2. Макацария А.Я., Смоляницкий А.С. Проблемы лечения гепарином // Клин. мед., 1980, 10, с.18-21.
3. Godel H.C. In Heparin. Chemical and biological properties. Clinical applications. Ed. D.A. Lane and U. Lindahl, Edward Amold, London, p.533-548.
4. Sztein M.B., Serrate S.A. Characterization of immunoregulatory properties of thimosin alfa 1 on interleukin-2 production and reseptor expression in normal lymphocytes // lnt. J. lmmunopharmacol.1989, v.11,7, p.789-900.
5. Колесникова Н.В., Нестерова И.В. Способ моделирования иммунодефицита по системе нейтрофильных гранулоцитов. Патент РФ №2107330 от 20.03.1998.
6. Патент РФ 2068702, А 61 К 35/78, опубл., 10.11.1996.
7. Nagumo Т., Nishino Т. Fucan Sulfates and Their Anticoagulant Activities // In: Polysaccharides in Medicinae Applications. (Ed. S. Dumitriu). University of Sherbrooke. Quebes, Canada. N. -York-Basel-Hong Kong. 1996. P.545-574.
8. Zhuang С., Itoh H., Mizuno Т., Ito H. Antitumor active fucoidan from the brown seaweed, umitoranoo (Sargassum thunbergii) // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. Vol.59. P.563-567.
9. Beress A., Wassermann O., Bruhn T. et al. A New Procedure for the Isolation of Anti-HIV Compounds (Polysaccharides and Polyphenols) from the Marine Alga Fucus Vesiculosus // Natural Products-Lloydia. 1993. V.56.4. - P.478-488.
10. Розкин М.Я., Левина М.Н., Ефимов B.C., Усов А.И. Антикоагулянтная и стимулирующая липолиз активность полисахаридов из бурых морских водорослей. // Фармакология и токсикология. 1991. Т.54. С.40-42.
11. Усов А.И., Кирьянов А.В. Полисахариды водорослей. 47. Выделение фракций фукоидана из бурой водоросли Laminaria cichorioides Miyabe // Биоорган. химия. 1994. Т.20. С.1342-1348.
12. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. // Anal. Chem. 1956. Vol.28. P.350-356.
13. Craigie, J.S., Wen, Z.C. and Van der Meer J.P. // Anal. Biochem. 1987. Vol.165. P.337-340.
14. Waffenschmidt S., Jaenicke L. // Anal. Biochem. 1987. Vol.165. P.337-340.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Фармацевтическая композиция на основе фукоидана для перорального применения и способ её получения | 2017 |
|
RU2657615C1 |
СУХОЙ ЭКСТРАКТ ФУКУСА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ МАЗЬ НА ЕГО ОСНОВЕ | 2012 |
|
RU2506089C1 |
ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS ISSACHENKONII КММ 3549 - ПРОДУЦЕНТ ФУКОИДАН-ГИДРОЛАЗЫ И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ | 2002 |
|
RU2207370C1 |
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2006 |
|
RU2304443C1 |
Адъювант для противовирусных вакцин | 2017 |
|
RU2676266C2 |
Средство, обладающее антиагрегационным и антикоагулянтным действием, и способ его получения | 2023 |
|
RU2808110C1 |
СРЕДСТВО, ИНДУЦИРУЮЩЕЕ СОЗРЕВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК | 2008 |
|
RU2361598C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ | 1998 |
|
RU2135518C1 |
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРОДУКТ ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ, БЕЗАЛКОГОЛЬНЫЙ НАПИТОК, ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО | 2006 |
|
RU2315487C1 |
СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЭКСТРАКТА ИЗ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ, ЭКСТРАКТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, БИОМАТЕРИАЛ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТА И КОМПОЗИЦИИ | 2013 |
|
RU2686088C2 |
Изобретение относится к области создания антикоагулянтов растительного происхождения. Средство, обладающее антикоагулянтным и иммунотропным действием, представляет собой фукоидан, полученный путем экстракции водой бурой водоросли Fucus evanescens при температуре 20-60°С с последующим осаждением этанолом, с молекулярной массой 20000-40000 дальтон и содержит нейтральные моносахариды: фукозы 70-80%, галактозы 2-9%, ксилозы 5-10% и глюкозы 2-7%, а также - сульфатов - 20-22%, при этом интенсивные сигналы в спектре 13С-ЯМР при 16,0-18,0 м.д. и полосу поглощения в ИК-спектре при 820-822 см-1. Фукоидан как в большой, так и в малой дозах стимулирует фагоцитарную и бактерицидную активность нейтрофилов, обладает иммуностимулирующим действием в широком диапазоне доз. 2 ил., 3 табл.
Thromb Haemost | |||
Металлический водоудерживающий щит висячей системы | 1922 |
|
SU1999A1 |
Thromb Res | |||
Электрическое сопротивление для нагревательных приборов и нагревательный элемент для этих приборов | 1922 |
|
SU1997A1 |
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
Thromb Res | |||
Металлический водоудерживающий щит висячей системы | 1922 |
|
SU1999A1 |
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
Thromb Res | |||
Топчак-трактор для канатной вспашки | 1923 |
|
SU2002A1 |
СПОСОБ ПЕРЕРАБОТКИ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ | 1998 |
|
RU2132622C1 |
Авторы
Даты
2005-03-10—Публикация
2002-12-26—Подача