Средство, обладающее антиагрегационным и антикоагулянтным действием, и способ его получения Российский патент 2023 года по МПК A61K36/28 B01D11/02 A61P7/02 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и фармакогнозии, и касается средства растительного происхождения, обладающего антиагрегационной и антикоагулянтной активностью.

Цель: расширение ряда средств, обладающих антиагрегационными и антикоагулянтными свойствами. В качестве средства, обладающего антиагрегационным и антикоагулянтным действием, применяют экстракт из воздушно-сухой травы трёхреберника продырявленного, собранной до цветения.

Известно средство «Патримин», обладающее антиагрегационным, седативным, гипотензивным, антикоагулянтным и гиполипидемическим действием по патенту РФ на изобретение №2189241 от 20.09.2002 г. Оно представляет собой сухой экстракт тритерпеновых гликозидов-патринозидов Д, В и С, полученный из корней патринии средней (Patrinia intermedia (Horn.) Roem et Schult), при этом содержание олеаноловой кислоты 10-19% на абсолютно сухой экстракт. Средство обладает низкой токсичностью и широким диапазоном активности.

Также известно средство Ангионорм®, содержащее сухой растительный экстракт, обладающее антиагрегационными, ангиопротективными, венотонизирующими, противовоспалительными, гиполипидемическими, кардиотоническими, антиаллергическими, спазмолитическими, желчегонными, антиоксидантными, общеукрепляющими (витамины С и Р) свойствами. Действие препарата обусловлено входящими в его состав основными биологически активными компонентами: тритерпеновые гликозиды каштана (эсцин) и солодки (глицирризин, глицирризиновая кислота), флавоноиды боярышника (кверцетин, гиперозид) и шиповника (кверцетин, кемпферол) (Воскобойникова И.В., Колхир В.К., Сокольская Т.А., Быков В.А., Сакович Г.С., Багинская А.И., Лескова Т.Е. Изучение АнгиоНорма® - нового антиагрегационного и ангиопротекторного средства/Материалы IX Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» ФИТОФАРМ, 2005. СПб, 2005. С. 577-583).

Известно средство, обладающее антикоагулянтным и иммунотропным действием по патенту РФ на изобретение №2247574 от 26.12.2002 г. Оно представляет собой фукоидан, полученный путем экстракции водой бурой водоросли Fucus evanescens при температуре 20-60°C с последующим осаждением этанолом. Средство имеет молекулярную массу 20000-40000 дальтон и содержит нейтральные моносахариды: фукозы - 70-80%, галактозы - 2-9%, ксилозы - 5-10% и глюкозы - 2-7%, а также - сульфатов - 20-22%. Антикоагулянтное действие заявляемого фукоидана из Fucus evanescens характеризуется следующими параметрами при испытании in vitro: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) от 80 до 900 с, тромбиновое время (ТВ) от 40 до 400 с в зависимости от дозы.

Также известно средство, обладающее антикоагулянтным действием, по патенту РФ на изобретение №2143270 от 27.12.1999 г., содержащее экстракт коры корней пиона, который получают путем обработки коры корней пиона Paeonia lutea. Корни высушивают при 36,5 - 37, 5°С в течение 23 - 25 ч, затем высушенную кору отделяют, измельчают до порошкообразного состояния и экстрагируют 40%-ным этиловым спиртом из расчета на 1 г порошка 10 мл спирта, далее настаивают в темноте в течение 5 - 7 суток, осадок отделяют, а надосадочную жидкость доводят до первоначального объема дистиллированной водой.

В качестве ближайшего аналога может быть предложено средство, содержащее одуванчик обыкновенный, обладающее антикоагулянтными свойствами (RU 2085205C1 от 27.07.1997)

Техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала средств, обладающих антиагрегационной и антикоагулянтной активностью.

Технический результат достигается благодаря тому, что средство, обладающее антиагрегационной и антикоагулянтной активностью, представляет сухой экстракт, полученный экстракцией аналитической пробы травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, массой около 1,0 г (точная навеска), измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм в ультразвуковой ячейке 50 мл спирта этилового 40% с озвучиванием в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт; последующим фильтрованием в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр и переносом сырья из ячейки вместе с фильтром в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником с последующей экстракцией 100 мл спирта 40% путем нагревания на плитке с закрытой спиралью в течении 20 мин; охлаждением полученного экстракта, фильтрованием в мерную колбу вместимостью 250 мл, доведением до метки 40% спиртом этиловым с последующим высушиванием с помощью лиофильной сушки.

Именно такое соотношение сырья и экстрагента, концентрация спирта этилового, последовательность стадий, применяемая частота колебаний и мощность ультразвука, время экстракции, позволяют получить экстракт, который дает наиболее полный выход флавоноидов; большее время экстракции не рационально, так как содержание действующих веществ в экстракте практически не меняется, следовательно, уровень активности будет оставаться прежним. Применение ультразвука позволяет увеличить выход флавоноидов и сократить общее время получения экстракта.

Возможность использования сухого экстракта из воздушно-сухой травы трёхреберника продырявленного, собранной до цветения, в качестве средства, обладающее антиагрегационной и антикоагулянтной активностью, из известного уровня техники не выявлена. Экстракт из воздушно-сухой травы трёхреберника продырявленного, собранной до цветения, характеризуются высоким содержанием флавоноидов (более 7%), обладающих антиагрегационной и антикоагулянтной активностью.

Предлагаемая нами совокупность признаков позволяет получить средство, устойчивое при хранении, обладающее антиагрегационной и антикоагулянтной активностью.

Заявленное изобретение может быть подтверждено следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу воздушно-сухой травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, измельчали до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в ультразвуковую ячейку, заливали 50 мл спирта этилового 40%, озвучивали в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт. Извлечение фильтровали в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр. Сырье из ячейки вместе с фильтром переносили в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, заливали 100 мл спирта 40%, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на плитке с закрытой спиралью в течении 20 мин. Затем содержимое колбы охлаждали, после чего извлечение фильтровали через бумажный фильтр в ту же мерную колбу и доводили до 250 мл до метки 40% спиртом этиловым (раствор А испытуемого раствора). Полученный экстракт лиофильно высушивали.

Затем определяли содержание флавоноидов.

Пример 2.

Сумму флавоноидов определяли по методике:

2,0 мл раствора А испытуемого раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл алюминия хлорида раствора 5% в спирте 70% и 0,2 мл уксусной кислоты 30%, доводили объем раствора спиртом 70% до метки и перемешивали (раствор Б испытуемый раствор).

Оптическую плотность раствора Б испытуемого раствора измеряли через 20 мин на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2,0 мл раствора А испытуемого раствора, 0,2 мл уксусной кислоты 30%, доведенный спиртом 70 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

где А - оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора;

А_о - оптическая плотность раствора Б СО рутина;

а - навеска сырья, г;

а_о - навеска СО рутина, г;

Р - содержание основного вещества в СО рутина, %;

W - влажность сырья, %.

Содержание флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в экстракте составило 7,65±0,03%.

Пример 3.

Для исследования антиагрегационной и антикоагулянтной активности готовый сухой экстракт растворяли в воде дистиллированной в соотношении 1:10 и определяли показатели биологической активности экстракта травы трёхреберника продырявленного.

Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 11 человек. Забор крови для исследования соединений в отношении системы гемостаза проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК "ДАСТАН", Киргизия).

Исследование влияния на агрегацию тромбоцитов проводили по методу Born (Born G.G.V.Nature (London).-1962 .-V.194.) на агрегометре “АТ-02” (НПФ "Медтех", Россия). В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства “Технология-Стандарт” (Россия). Проводили оценку максимальной амплитуды агрегации, скорости агрегации, время достижения максимальной амплитуды и дезагрегацию в присутствии изучаемых соединений при агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали латентный период, во время которого происходит активация фосфолипазы С (что приводит к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2). В качестве препаратов сравнения использовали 3,7-диметил-1-(5-оксогексил)ксантин («Пентоксифиллин», ОАО «Дальхимфарм», Россия); 2-ацетилоксибензойная кислота («Ацетилсалициловая кислота», Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай). Для оценки фармакологической активности исследуемые образцы вносили в плазму из расчета 5% от объема реакционной смеси. Антиагрегационная активность пентоксифиллина и ацетилсалициловой кислоты представлена для концентрации 2×10^-3 М/л.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Установлено, что экстракт травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, проявляет антиагрегационную активность. Так, согласно полученным данным, экстракт травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, как и препараты сравнения, уменьшает максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов (экстракт на 6,5%, препараты сравнения: ацетилсалициловая кислота на 13,7%, пентоксифиллин на 48,4%), что говорит об их влиянии на агрегацию тромбоцитов. Экстракт травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, увеличивает латентный период агрегации тромбоцитов на 4,2%, как и препарат сравнения - пентоксифиллин (на 32,4%), в то время как препарат сравнения - ацетилсалициловая кислота уменьшает этот показатель (на 2,1%). Экстракт травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, оказывал влияние на скорость агрегации тромбоцитов достоверно снижая ее на 9,6%, при этом результаты были сопоставимы с препаратом сравнения - ацетилсалициловой кислотой (10,5%) и отличались от препарата сравнения - пентоксифиллина (34,9%). По показателю - время достижения максимальной амплитуды показатели экстракта были сопоставимы с ацетилсалициловой кислотой (9,6% и 10,5%), но отличались от значений пентоксифиллина (32,1%). В присутствии экстракта травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, как и препарата сравнения - ацетилсалициловой кислоты, не наблюдалась дезагрегация тромбоцитов, в отличие от препарата сравнения - пентоксифиллина.

Определение антикоагуляционной активности проводили общепризнанными клоттинговыми тестами на оптическом двухканальном автоматизированном анализаторе свертывания крови АСКа 2-01-"Астра" (НПЦ «Астра», Россия). Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 11 человек. Забор крови для исследования соединений в отношении системы гемостаза проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК "ДАСТАН", Киргизия).

Изучались показатели активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени (ПВ) и концентрации фибриногена по A.Clauss. В работе использовались реактивы производства “Технология-Стандарт” (г. Барнаул, Россия). Для оценки фармакологической активности исследуемые образцы вносили в плазму из расчета 5% от объема реакционной смеси. Антикоагуляционная активность гепарина натрия - для концентрации 5×10^-4 г/мл.

Результаты исследования представлены в таблице 2.

Согласно полученным данным установлено, что экстракт травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, оказывает влияние на плазменный компонент системы гемостаза, проявляющееся изменением показателя внутреннего пути свертывания крови - удлинением АПТВ. Таким образом, можно судить о проявлении антикоагуляционной активности.

Таблица 1. - Влияние Трёхреберника продырявленного и препаратов сравнения на показатели агрегации тромбоцитов, Ме (0,25-0,75). № Исследуемое вещество Латентный период, % к контролю Максимальная амплитуда, % к контролю Скорость агрегации, % к контролю Время достижения МА, % к контролю Дезагрегация, % к контролю 1 Трехреберник продырявл. +4,2 (3,7-5,8)††,# -6,5 (5,1-8,2)*,††, # -9,6 (8,7-12,9)*,†† +9,6 (7,4-12,9)*,†, # 0,0 (0,0-0,0)†† 2 Ацетилса-лициловая кислота -2,1 (1,1-2,6)†† -13,7 (10,8-16,4)*,†† -10,5 (7,6-12,3)*,†† +10,5 (8,7-13,4)*,†† 0,0 (0,0-0,0)†† 3 Пентоксифиллин +32,4 (28,7-35,6)* -48,4 (42,7-56,5)** - 34,9 (28,7-39,6)** + 32,1 (27,6-32,4)** 13,6 (11,2-16,8)** Примечание: Латентный период представлен для агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном, остальные параметры для АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. *р≤0.05, **р≤0.001 - в сравнении с контролем; †р≤0.05, ††р≤0.001 - в сравнении с пентоксифиллином; #р≤0.05, ##р≤0.001 - в сравнении с ацетилсалициловой кислотой. n=6

Таблица 2. - Влияние гепарина натрия и трехреберника на показатели плазменного звена гемостаза, Ме (0,25-0,75). № Исследуемое вещество Изменение АПТВ,
% к контролю Изменение ПВ,
% к контролю Фибриноген,
% к контролю 1. Трехреберник продырявленный + 7,1 (6,3-8,2) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 2. Гепарин натрия + 20,3 (19,7-21,4) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Примечание: данные достоверны в сравнении с контролем и гепарином при p<0,05. n=6.

Заявленное изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему антиагрегационной и антикоагулянтной активностью. Средство, обладающее антиагрегационным и антикоагулянтным действием, представляющее сухой экстракт, полученный экстракцией аналитической пробы травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, массой около 1,0 г -точная навеска, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, в ультразвуковой ячейке 50 мл спирта этилового 40% с озвучиванием в течение 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт; последующим фильтрованием в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр и переносом сырья из ячейки вместе с фильтром в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником с последующей экстракцией 100 мл спирта этилового 40% путем нагревания на плитке с закрытой спиралью в течении 20 мин; охлаждением полученного экстракта, фильтрованием в ту же мерную колбу вместимостью 250 мл, доведением до метки 40% спиртом этиловым с последующим высушиванием с помощью лиофильной сушки. Вышеописанное средство обладает выраженным антиагрегационным и антикоагулянтным действием, характеризуется повышенным выходом флавоноидов- 7,65±0,03% в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье. 2 табл., 3 пр.

Средство, обладающее антиагрегационным и антикоагулянтным действием, представляющее сухой экстракт, полученный экстракцией аналитической пробы травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, массой около 1,0 г -точная навеска, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, в ультразвуковой ячейке 50 мл спирта этилового 40% с озвучиванием в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт; последующим фильтрованием в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр и переносом сырья из ячейки вместе с фильтром в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником с последующей экстракцией 100 мл спирта этилового 40% путем нагревания на плитке с закрытой спиралью в течение 20 мин; охлаждением полученного экстракта, фильтрованием в ту же мерную колбу вместимостью 250 мл, доведением до метки 40% спиртом этиловым с последующим высушиванием с помощью лиофильной сушки.