СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ RUSCUS ACULEATUS Российский патент 2005 года по МПК C12P33/00 C12P19/44 C12P33/00 C12R1/685 

Настоящее изобретение относится к способу получения производных стероидных гликозидов Ruscus Aculeatus (рускосапонинов).

Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению десглюкодесрамнорусцина путем ферментативного гидролиза рускозида и/или десглюкорускозида.

Десглюкорамнорусцин и соответствующие свободные агликоны, рускогенин и неорускогенин, которые могут быть легко получены из десглюкодесрамнорусцина кислотным гидролизом, представляют собой ценные фармацевтически активные вещества, обладающие противовоспалительной и коннектив-защитной активностями.

Однако химическое получение указанных активных веществ из рускозида или десглюкорускозида достаточно проблематично, поскольку оно требует применения жестких условий, например проведения гидролиза сильными кислотами, и использования сложных технологических стадий, в результате чего получают сильно гетерогенную смесь промежуточных соединений и продуктов реакции.

В связи с этим очень желательно разработать способ получения десглюкодесрамнорусцина, лишенный упомянутых выше недостатков, присущих известным химическим способам. Настоящее изобретение удовлетворяет указанной потребности, обеспечивая способ получения десглюкодесрамнорусцина, заключающийся в гидролизе стероидных гликозидов Ruscus aculeatus (рускосапонинов) путем ферментации субстрата, содержащего указанные гликозиды, с помощью грибков вида Aspergillus niger. Обычно в качестве питательного комплексного субстрата используют культуральный бульон. Как правило, ферментацию проводят при температуре 25-30° С, предпочтительно при 27° С, при перемешивании и барботаже воздуха, используемых для того, чтобы поддерживать величину рO₂ равным 50% или выше.

Обычно концентрация исходных стероидных гликозидов составляет величину в интервале 5-15% мас./об, предпочтительно, 8-10% мас./об, а рН культурального бульона составляет 4-6, предпочтительно 4,5-5,5.

Биотехнологический способ согласно настоящему изобретению позволяет осуществлять всю последовательность реакций на одной стадии ферментации, на которой микроорганизм, выбранный с использованием подходящих микробиологических методик, способен экспрессировать необходимые энзимные активности для осуществления всех последовательных трансформационных реакций, начиная с исходного сложного гетерогликозида, с получением моногликозида или конечного агликона. Фактически, указанные гидролазные трансформации включают последовательность β -гликозидазных, α -рамнозидазных реакций с участием промежуточных соединений, которые последовательно выделяются в ходе процесса. Дополнительная α -арабинозидазная реакция позволяет получать свободный агликон (рускогенин).

Предлагаемый подход является новым, поскольку в литературе отсутствуют примеры использования указанной методики для получения указанных продуктов.

Микроорганизмы, пригодные для осуществления необходимых трансформаций, получают селекцией на синтетических или полусинтетических средах, дополненных субстратами, подлежащими трансформации, помимо или вместо традиционных источников углерода (глюкоза, сахароза и т.п.). В данном случае рассматриваемые субстраты (рускозид, десглюкорускозид) могут добавляться в систему в достаточно высоких концентрациях, например 90-100 г/л. Агаровые среды для выделения включают такие известные для микробиологии рецептуры, как солодовый агар и агар Чапека, или аналогичные рецептуры, в которых источником азота могут служить пептоны, мочевина, нитрат аммония и т.п., тогда как традиционный источник углерода (глюкоза, сахароза) может быть заменен или дополнен рускозидом или десглюкорускозидом. Указанные среды могут быть также дополнены такими минеральными солями калия, магния, марганца, цинка и т.п., как их фосфаты, сульфаты и/или хлориды. Выделительные среды могут иметь значение рН в интервале 4-6, предпочтительно, 4,5-5,5.

Микроорганизмы, подходящие для требуемых биотрансформаций, выделяют скалярным разведением и культивированием водных суспензий образцов почвы, гумуса, растительных экстрактов и других аналогичных органических источников.

Подвергнутые описанной выше селекции микробные культуры выделяют в микробиологических пробирках, содержащих те же культуральные среды, и используют для биотрансформации рускозида и десглюкорускозида, добавляя в жидкую культуральную среду, содержащую такие же источники азота, что использовались в выделительной среде, например мочевину или пептон, с добавлением фосфатов и описанных выше минеральных солей при рН в интервале 4-6, предпочтительно 4,5-5,5.

Следуя описанным методикам, было обнаружено, что подвергнутые селекции культуры Aspergillus niger способны к трансформации рускозида и десглюкорускозида в десглюкодесрамнорусцин, непосредственный предшественник рускогенинов, в результате осуществления последовательности ферментативных реакций с участием β -глюкозидазы и α -рамнозидазы.

Последующая реакция с участием α -арабинозидазы приводит к получению сапонина в агликоновой форме (рускогенин - неорускогенин).

Отобранная культура способна к осуществлению указанных трансформаций, произрастая в регулируемых (термостатируемых) условиях, в оптимальном температурном интервале 25-30° С, при перемешивании на роторном шейкере (скорость вращения 200-300 об/мин). Указанную ферментацию также можно осуществлять в подходящем биореакторе при различных уровнях масштабирования с целью промышленного производства желаемых производных сапонина.

Микроорганизмы, используемые в указанных биотрансформациях, способны постоянно поддерживать каталитическую активность даже в повторяющихся циклах ферментации, осуществляемой периодическим или непрерывным способом.

Важными преимуществами способа настоящего изобретения является применение менее сложных стадий разделения и регенерации продукта, которые могут быть осуществлены более легким и менее дорогостоящим способом.

В целях длительного хранения отобранные микроорганизмы могут быть заморожены в виде суспензий, обогащенных такими криоконсервантами, как глицерин, пептон и т.п., при температуре в интервале от -80° С до -196° С (в жидком азоте), или подвергнуты сушке вымораживанием.

За ходом биоконверсии можно следить с использованием ТСХ и ВЭЖХ анализа культурального бульона, используя для этой цели следующие аналитические методы.

Анализ методом ТСХ

- Силикагелевые пластины 60 F250 Merck

- Элюенты:

A) Этилацетат - метанол 9:1

B) Этилацетат - метанол - вода 100:15:10

- Детекция: реакция с 10% серной кислотой и нагревание в течение 5 минут при 120° С с последующей детекцией в видимой или УФ-области

Анализ методом ВЭЖХ

- Колонка: Supelcosil LC18, 250× 4,6 мм, 5 мкм

- Элюент: ацетонитрил - вода 60:40

- Длина волны: 200 нм

- Впрыскиваемый объем: 10 мкл

- Расход газа: 1 мл/мин

Такие конечные продукты биотрансформации, как десглюкодесрамнорусцин, могут быть выделены экстракцией культурального бульона н-бутанолом, с последующими стадиями очистки, проводимыми с использованием хлорированных растворителей (например, трихлорэтана) и хроматографии на силикагеле. Наконец, продукт можно перекристаллизовывать из различных растворителей, например из изопропанола, этилацетата, хлороформа, ацетона, метанола. Помимо основного продукта могут быть получены десглюкодесрамнорусцины, этерифицированные в положении С-2', например, с помощью 2-гидрокси-3-метилпентановой кислоты.

Сапонины в агликоновой форме (рускогенины) получают кислотным гидролизом описанных выше продуктов ферментации.

Следующие ниже примеры более подробно описывают настоящее изобретение.

Пример 1

Две колбы с культурной средой (солодовый бульон, 250 мл в каждой колбе) инокулировали спорами культуры Aspergillus niger на солодовом агаре, полученной селекцией в модифицированной агаровой солодовой среде (дополненной 2% рускозида). Колбы инкубировали в течение 48 часов при +27° С на орбитальной мешалке со скоростью вращения 250 об/мин. После инкубации предкультуру переносили в биореактор, содержащий 7 л стерильного продуцирующего бульона R090, имеющего следующий состав (приведенные величины относятся к одному литру деионизированной воды): сухой экстракт рускозида (90 г), мочевина (1 г), пептон (1 г), MgSO₄·_{7H2O (5 г), КСl (1,5 г), КН2РO4 (1 г), MnSO4·H2O (0,2 г), ZnSO4. 7H2O (0,1 г), пеногаситель Р200 (1,5 мл), рН около 5.}

Ферментацию осуществляли, основываясь на процентном количестве растворенного кислорода (рO₂), постепенно повышая скорость перемешивания и расход барботажного воздуха с достижением величины рO₂ более 50%. За ходом биопревращения следили с помощью анализа методами ВЭЖХ и ТСХ. Через 5 дней инкубации при +27° С ферментацию прекращали. Анализ бульона методами ВЭЖХ и ТСХ показал, что в реакционной среде отсутствует рускозид, а главным продуктом реакции является десглюкодесрамнорусцин и следы рускогенинов.

Культуральный бульон истощали экстракцией н-бутанолом. Бутанольный экстракт досуха концентрировали в вакууме при +60° С, повторно растворяли в 70% метаноле и подвергали обратной экстракции трихлорэтаном. Хлорированный раствор концентрировали в вакууме до образования сухого материала. После повторного растворения в смеси хлороформ-метанол полученный продукт очищали методом колоночной хроматографии (Kieselgel, Merck), используя в качестве элюента смесь этилацетат-хлороформ в соотношении 9:1. Состав фракций контролировали методами ВЭЖХ и ТСХ. Фракцию очищенного продукта концентрировали в вакууме, после чего повторно растворяли в ацетоне и перекристаллизовывали. В результате дополнительной перекристаллизации из метанола получали 7 г продукта, идентифицированного спектроскопическим анализом как десглюкодесрамнорусцин. Кроме основного продукта, в небольшом количестве (около 800 мг) получали десглюкодесрамнорусцин, этерифицированный в положении С-2' 2-гидрокси-3-метилпентановой кислотой.

В результате кислотного гидролиза описанных выше продуктов ферментации получали сапонины в агликоновой форме (рускогенины).

Пример 2

Используя ферментер, описанный в примере 1, осуществляли первый цикл биотрансформации, после чего 90% культурного бульона отбирали для экстракции с целью получения конечного продукта; оставшиеся 10% ферментационного бульона добавляли в ферментер со свежей средой R090, доводя конечный объем до 7 л. Второй цикл ферментации проводили с использованием описанных выше параметров и средств аналитического контроля. Через 5 дней инкубации при +27° С ферментация завершалась.

Культуральные бульоны из двух циклов ферментации обрабатывали по методике примера 1 с целью экстракции и регенерации конечного продукта. По окончании финальной стадии получали 14 г десглюкодесрамнорусцина.

Изобретение относится к способу получения производных стероидных гликозидов Ruscus aculeatus (рускосапонинов). Способ получения десглюкодесрамнорусцина включает гидролиз стероидных гликозидов Ruscus aculeatus (рускосапонинов) в результате ферментации субстрата, содержащего указанные гликозиды, с помощью гриба вида Aspergillus niger. Способ позволяет получить десглюкодесрамнорусцин с высокой степенью эффективности. 6 з.п. ф-лы.

1. Способ получения десглюкодесрамнорусцина, включающий гидролиз стероидных гликозидов Ruscus aculeatus (рускосапонинов) в результате ферментации субстрата, содержащего указанные гликозиды, с помощью грибка вида Aspergillus niger.2. Способ по п.1, в котором указанный субстрат представляет собой бульон культуры.3. Способ по п.2, в котором указанную ферментацию проводят при температуре 25-30°С, в условиях перемешивания и барботажа воздуха для достижения величины рO₂, равной 50% или более.4. Способ по п.3, в котором температура составляет 27°С.5. Способ по п.3, в котором исходная концентрация указанных стероидных гликозидов имеет значение в интервале 5-15% мас./об.6. Способ по п.5, в котором указанный интервал концентраций составляет 8-10% масс/об.7. Способ по любому из пп.2-6, в котором рН культурального бульона имеет значение в интервале 4-6.8. Способ по п.7, в котором рН культурального бульона имеет значение в интервале 4,5-5,5.