СПОСОБ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КОЛХИКОНОВОГО СОЕДИНЕНИЯ В СООТВЕТСТВУЮЩЕЕ 3-0-ГЛИКОЗИЛЬНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ Российский патент 2003 года по МПК C12P19/56 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/11 

Изобретение относится к биотрансформации, осуществляемой с помощью выбранных микробных штаммов, колхициноидных соединений, в соответствующие 3-O-гликозильные производные. Способ настоящего изобретения исходя из названных колхиконовых соединений обеспечивает соединения, гликозилированные исключительно в С-3 ароматического кольца с высоким выходом и чистотой.

Соединения, полученные посредством биотехнологического способа по настоящему изобретению, особенно тиоколхикозон (3-O-гликозилтиоколхикон, т.е., если обратиться к формуле (I), R₁=o-гликозил, и R₂=-SСН₃), являются активными началами, имеющими огромное значение для фармакологии, в основном для получения новых противоопухолевых лекарственных средств.

Описание изобретения
Много усилий было затрачено для получения сильноспецифических процессов гликозидирования соединений общей формулы (I) и родственных колхициноидных соединений или посредством химических реакций, или посредством биотрансформации.

Химический путь состоит из ряда сложных неспецифических реакций, которые, неселективно затрагивая различные молекулярные участки, приводят к смеси гликозидированных производных, некоторые из которых являются неактивными. Поэтому при конверсии выход эффективного продукта, специфически гликозидированного в С-3 ароматического кольца, очень низкий.

Биологический подход относится, по существу, к биотрансформации колхициноидных соединений (которые косвенно связаны с колхиконовыми соединениями), такими как колхицин и тиоколхицин, с помощью культуры Centella Asiatica в производные, моногликозидированные в С-2 и С-3 ароматического кольца; поэтому такая трансформация не является высокоизбирательной и обеспечивает недостаточные выходы и продуктивность (Solet, J.M., et al., Phytochemistry, 33, 4, 817-820, 1993).

Другие попытки биотрансформации колхициноидных соединений привели к простому деметилированию метоксигрупп, связанных с ароматическим кольцом (по С-2 и С-3), и всегда характеризовались ограниченными выходами и продуктивностью и плохой региоселективностью.

Так, Hufford C. D. et al., (J.Pharm.Sc., 68, 10, 1239-1242, 1979), используя Streptomyces griseus и/или Streptomyces spectabilis, и Bellet P. et al., (GB-923421, 1959), используя различные штаммы Streptomyces и других видов бактерий и грибов, попытались трансформировать колхицин и его производные в соответствующие 3-деметилированные производные. Результаты этих известных способов подтверждают указанное выше в связи с неселективностью микробных ферментов, действующих, например, в С-2, С-3 или С-10 молекулы алкалоида. Более того, уровни продуктивности указанных каталитических систем довольно низкие из-за низких выходов конверсии, пониженных концентраций субстрата, которые можно использовать, и частого разрушения трополонового кольца.

Позднее Poulev et al., (J. Ferment.Bioeng., 79, 1, 33-38, 1995) получили специфическое деметилирование, используя бактериальные микроорганизмы, но все еще с довольно низкими выходами и продуктивностью.

Активность ферментов из микроорганизмов, подобных указанным выше (Streptomyces, Bacillus и т.п.), применили для биотрансформации других соединений, таких как майтанзиноиды (патент США 4361650; Izawa, M. et al., Antibiotics, 34, 12, 1587-1590, 1981). В этом случае так же катализированная реакция состоит исключительно в деметилировании, характеризующемся низкими выходами конверсии и продуктивностью.

Описаны гликозилтрансферазные активности α-амилазы из штаммов Bacillus megaterium (Brumm, P.J. et al., Starch, 43, 8, 319-323, 1991), причем акцепторная специфичность (исключительно глюкозы или глюкозидов) является особенно высокой. Циклодекстрин-глюкозилтрансферазы, продуцированные тем же самым микробным источником, катализируют α-1,4-трансглюкозилирование рубузозида (β-D-глюкозиловый эфир 13-O-β-D-глюкозилстевиола) исходя из крахмала. При такой биоконверсии акцептором реакции трансферазы также является фракция глюцидного субстрата (Darise M. et al., Agric.Biol.Chem., 48, 10, 2483-2488, 1984). Циклодекстрин-гликозилтрансферазы ранее применялись для получения циклодекстринов G6 и G8 из крахмала (Kitahata, S., Okada, S., Agric.Biol. Chem., 38, 12, 2413-2417, 1974).

Эти примеры доказывают высокую специфичность субстрата гликозилтрансферазных активностей, экспрессированных Bacillus megaterium, которая включает только глюкозильные акцепторы, поэтому невозможно ожидать каких-либо реакций на вторичных метаболитах с различной сложной молекулярной структурой, таких как колхиконы. Действительно, неизвестны примеры использования указанных микроорганизмов для ферментативной конверсии колхиконовых соединений в 3-гликозильные производные.

В настоящее время было обнаружено, что штаммы Bacillus megaterium, способные расти в присутствии высоких концентраций колхикона (R₁=-ОСН₃, R_z=-ОСН₃), 3-деметилколхикона и соответствующих тиопроизводных, обладают очень высокой, очень специфической активностью биотрансформации указанных субстратов в производные, гликозидированные исключительно по С-3 ароматического кольца. Такая трансформация происходит за очень короткое время и характеризуется неожиданно высокими выходами.

Следовательно, изобретение относится к способу получения 3-O-гликозилколхиконовых соединений формулы (I).

где R₁ представляет собой гликозидный остаток, особенно O-гликозидный остаток, R₂ представляет собой (C₁-C₆)-алкокси или (C₁-C₆)-тиоалкил, включающий биотрансформацию соединений, в которых R₁ представляет собой ОН или метокси, с помощью Bacillus megatenum.

Bacillus megaterlum является грамположительной спорообразующей бактерией, диаметр клетки которой выше, чем 1,0 мкм, растущей в аэробных условиях на многих культуральных средах, каталазоположительной, гидролизующей желатин. Штаммы Bacillus megaterium, которые можно использовать в соответствии с изобретением, демонстрируют способность к удовлетворительному росту и сохранению жизнеспособности также при высоких концентрациях колхикона, тиоколхикона (R₁= -OCH₃, R_z= -SСН₃) и соответствующих 3-деметильных производных (свыше 2 г/л), что доказано проверкой роста и анализами под микроскопом. Принадлежащие к тому же виду другие бактерии, такие как Bacillus cereus, уже при концентрациях субстрата 1 г/л показывают затруднения в росте (оптические плотности 10-15% от контроля).

Высокая селективность и эффективность биотрансформации удивительна и необычна, так как уровни выхода составляют от 70% до 95%.

Более того, микроорганизмы, используемые при биоконверсии, способны постоянно сохранять каталитическую активность, даже на повторных стадиях ферментации, обеспечивая, следовательно, специфическую биоконверсию в периодическом и непрерывном процессах. Следовательно, этот способ обеспечивает высокую продуктивность и воспроизводимость.

Высокая региоселективность реакции гарантирует, кроме прекрасного выхода, высокое качество и чистоту полученного продукта, таким образом обеспечивая его 100% чистоту с простой последующей переработкой.

Далее, важными преимуществами являются сниженный объем стадии очистки и извлечения продукта, экономичность способа и возможность и безопасность применения.

Последовательность операций, применяемых в способах изобретения, включает:
A) Отбор культур Bacillus megaterium, способных расти в присутствии высоких концентраций колхиконового субстрата, исходя из естественных источников или из коллекционных штаммов.

B) Отбор изолятов со стадии А) для испытания каталитической активности при трансформации в соответствующие 3-O-гликозильные производные с помощью анализов биоконверсии на специфических субстратах, вводимых в постепенно возрастающих концентрациях.

C) Микробиологическая характеризация штаммов, отобранных на стадии В).

D) Постепенное повышение выхода при биотрансформации за счет направленно-специфического отбора бактериальной популяции со стадии В).

Е) Исследование и оптимизация критических параметров ферментации для оптимизации биотрансформации.

F) Исследование и оптимизация способов сохранения высокопродуктивных культур для гарантированного обеспечения устойчивых гомогенных инокулятов для продуктивных применений в промышленном масштабе.

G) Увеличение процесса в ферментере, периодическом, с периодической нагрузкой, и непрерывном процессах.

Н) Разработка и оптимизация последующих способов обработки и выделения продукта.

Конкретно, микроорганизмы, используемые в настоящем изобретении, можно отобрать исходя из коллекционных культур, полученных из центров хранения штаммов, или из образцов почвы различного происхождения, или из предварительно отобранных промышленных штаммов, посредством селективного извлечения на различных агаровых средах, содержащих органический источник азота (пептоны, дрожжевые экстракты, мясные экстракты, аспарагин и т.п.), источник углерода (глицерин, крахмал, мальтоза, глюкоза и т.п.), с рН 5-8, предпочтительно 6-7. Температура инкубации составляет от 20^o до 45^oС, предпочтительно 28^o-40^oС.

Способность культуры расти в присутствии токсичных концентраций трансформируемого колхиконового субстрата оценивают методами скалярного разведения и параллельного культивирования на различных субстратах с добавленным агаром, в часть из них предварительно добавляют колхиконовое соединение (например, 3-O-деметилтиоколхикон) в концентрациях от 0,1 до 3 г/л (с тем, чтобы ингибировать рост основной части микроорганизмов).

Колонии, способные расти в описанных условиях, извлекают в стерильных условиях и помещают на различные среды с добавленным агаром, чтобы проверить их чистоту и равномерность роста.

Культуральные среды, используемые для сохранения культуры, являются типичными микробиологическими субстратами, содержащими органические источники азота (пептоны, дрожжевые экстракты, триптон, мясные экстракты и т.п.) и источник углерода (глюкоза, мальтоза, глицерин и т.п.), при рН 5-8, предпочтительно 6-7. Температура инкубации составляет от 20^o до 45^oС, предпочтительно 28^o-40^oС.

Затем отобранные микроорганизмы анализируют на способность расти в погруженной культуре в присутствии колхиконовых соединений и трансформировать последние в соответствующие 3-гликозильные производные.

Указанные анализы осуществляют в 100 мл колбах, содержащих 20 мл жидкой среды с различными составами, содержащей один или более органических источников азота (дрожжевые экстракты, пептоны, триптон, гидролизаты казеина, мясные экстракты, кукурузный экстракт и т.п.), один или более источников углерода (глюкоза, глицерин, крахмал, сахароза и т.п.), неорганические источники фосфора и азота и неорганические соли различных ионов (К⁺, Na⁺, Мg⁺⁺, Са⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺ и т.п.).

Образцы культур можно подвергнуть, необязательно, обработке мутагенами посредством обычных методов мутагенеза (облучение УФ-излучением и т.п.) для индуцирования мутантов, обладающих специфической биоконверсионной активностью, которую можно оценить теми же методами, какие описаны выше.

Образцы культур из каждого анализа на биоконверсию для оценки продуцирования 3-гликозильных производных анализируют посредством анализов методами ТСХ и ВЭЖХ.

Способность отобранных микроорганизмов трансформировать колхиконовые субстраты в соответствующие 3-гликозильные производные подтверждают посредством анализов на биоконверсию в колбах объемом 300 мл в тех же культуральных бульонах, какие используют на стадии отбора.

Микроорганизмы, дающие положительную реакцию, используют в испытаниях для оптимизации биоконверсии в различных культуральных бульонах в объеме 300 мл. Основными исследуемыми параметрами культивирования и ферментации являются органические источники азота, источники углерода, минеральные соли, температура, аэрация при перемешивании, рН, время инкубации, коэффициент инокулята, стадии субкультивирования, время и форма добавления трансформируемого субстрата. Отобранные бактериальные микроорганизмы, способные осуществлять биотрансформацию по настоящему изобретению, могут расти как на твердых, так и на жидких культуральных субстратах, содержащих один или более органических источников азота, предпочтительно дрожжевой экстракт, мясной экстракт, пептон, триптон, гидролизаты казеина, кукурузный экстракт и т.п. Источниками углерода, полезными для роста и биотрансформации, являются глюкоза, фруктоза, сахароза, глицерин, солодовый экстракт и т.п., предпочтительно глюкоза, фруктоза и глицерин. Культуральная среда содержит также неорганические источники фосфора и соли К⁺, Na⁺, Мg⁺⁺, NH₄ ⁺ и т.п.

Отобранные микроорганизмы могут расти при температурах от 20^o до 45^oС, предпочтительно от 28^o до 40^oС, при рН от 5 до 8, предпочтительно при рН 6-7. В тех же условиях рассматриваемые микроорганизмы способны трансформировать колхиконовые соединения в соответствующие 3-гликозильные производные. Указанная трансформация происходит в погруженной культуре в колбах, инкубированных на роторном вибраторе с перемешиванием при 150-250 об/мин.

Вследствие особой кинетики рассматриваемой биотрансформации, относящейся к росту микробов, оптимальные условия для целей биотрансформации являются такими же, какие оптимальны для роста. Следовательно, культуральные среды, полезные для промотирования хорошего роста микробов, такие как среды на основе органических и неорганических компонентов, указанных выше, также полезны для хорошей активности биотрансформации представляющего интерес субстрата. Последний добавляют к культуре на начальной стадии ферментации или фракционными аликвотами, начиная с начала ферментации.

Биотрансформация по изобретению основывается на ферментативной конверсии, которая начинается во время экспоненциальной фазы роста и продолжается параллельно развитию этой фазы роста; максимальные уровни конверсии до 3-гликозильного производного (очень высокие, вплоть до 95%) достигаются за первые 48-72 часа, в зависимости от времени добавления субстрата. Региоселективность биотрансформации абсолютная: в образцах культур никогда не обнаруживают присутствия 2-гликозилпроизводных. Полученные продукты являются исключительно внеклеточными.

Трансформируемый субстрат можно добавлять в растворе ацетона или спирта, в водноспиртовых смесях, в диоксане и т.п. Можно увеличить биотрансформацию по изобретению до уровня ферментера, сохраняя условия культивирования неизменными, в частности касающиеся культуральной среды, температуры и времени переработки. Для того чтобы получить хороший рост, важны адекватные уровни аэрации при перемешивании, в частности требуются уровни аэрации 1-2 л воздуха на литр культуры в минуту (vvm), предпочтительно 1,5-2 vvm.

Продукты, полученные при биоконверсии, экстрагируют из культуральных бульонов после отделения биомассы от жидкой фракции посредством центрифугирования и извлечения супернатанта или микрофильтрации и извлечения растворенного вещества (пермеата). Культуру можно обработать спиртами с учетом оптимального извлечения продукта.

Очистку и извлечение продуктов биотрансформации можно осуществлять с использованием хроматографических методов разделения на абсорбционных смолах и элюирования спиртами, предпочтительно метанолом. Затем воднометанольные растворы, содержащие продукт, можно дополнительно очистить посредством экстракции липофильными органическими растворителями, предпочтительно метиленхлоридом. После дополнительных обработок смесями спиртов и органических растворителей продукт можно получить в чистом виде посредством кристаллизации из полученных спиртовых растворов. Глюкозу можно заменить другими сахарами, такими как фруктоза или галактоза, без потери гликозилтрансферазной активности.

Приведенные далее примеры раскрывают изобретение более детально.

ПРИМЕР 1.

Дликвоты культур Bacillus megaterium, выделенные из пахотной почвы, повторно суспендируют в 20 мл стерильного физиологического раствора и подвергают скалярному разведению до коэффициента разведения 1:10000000. Суспензии при различном разведении высевают на культуральную среду LB-агар и к LB-агару добавляют, соответственно, тиоколхикон или 3-деметилтиоколхикон до конечной концентрации 2 г/л (см. таблицу). Культуры инкубируют при +28^oС в течение 3-4 суток в темноте. Колонии, выросшие на селективной среде с добавлением колхиконового соединения, выделяют и очищают посредством высевания на неселективной среде; указанные образцы инкубируют, как указано выше, но в течение меньшего времени (24 часа).

Затем культуры переносят на ту же агаровую среду в пробирке и инкубируют, как описано выше, в течение 24 часов.

Аликвоты культур, отобранные как описано, используют для инокуляции в 100 мл Эрленмейера, содержащих 20 мл культуральной среды ST (таблица) с добавлением тиоколхикона или 3-деметилтиоколхикона до конечной концентрации 0,4 мг/мл. Указанные культуры инкубируют в течение ночи при 28^oС на роторном вибраторе при 200 об/мин.

Трансформацию колхиконового субстрата контролируют посредством анализа аликвот культуральных бульонов, отбираемых каждые 3-4 часа, с помощью ТСХ на силикагеле с элюентом смесью ацетона, этилацетата и воды 5:4:1.

После 4-суточной инкубации аликвоты культур, демонстрирующих явную каталитическую активность в направлении 3-гликозильного производного, переносят на чашки посредством скалярного разведения, как описано выше, для получения нового инокулята в пробирке. Повторяют анализ на биотрансформацию в колбе в тех же условиях, какие указаны выше, но с использованием заметно более высоких конечных концентраций тиоколхикона или 3-деметилтиоколхикона (1 мг/мл). Наиболее активные отдельные культуры (конверсия субстрата равна или превышает 70%) используют для получения инокулята в замороженных криопробирках.

Состав культуральных сред приведен в конце текста.

ПРИМЕР 2.

Повторяют процедуру, описанную в примере 1, исходя из культур Bacillus megaterium, полученных из следующих коллекционных штаммов (Deutsche Saimmlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Германия):
DSM 90
DSM 322
DSM 333
DSM 1667
DSM 1670
DSM 1671
Культуры, отобранные так же, как в примере 1, и с добавлением тиоколхикона (1 мг/мл), инкубируют в течение 4 суток в жидкой культуре: анализ методом ТСХ обнаруживает происходящую трансформацию субстрата в тиоколхикозон при выходе конверсии с интервале от 30 до 70%.

ПРИМЕР 3.

Аликвоты образцов культур в пробирке, отобранных как описано в примере выше, используют для инокуляции в 100 мл колбах Эрленмейера, содержащих 20 мл бульона ST.

Бульонные культуры инкубируют при +30^oС на роторном вибраторе при 200 об/мин в течение ночи. После инкубации к культурам добавляют стерильный раствор глицерина до конечной концентрации 20%. Затем культуры распределяют в 2 мл криопробирки и сразу же погружают в жидкий азот.

Через несколько дней 10% культур быстро оттаивают при 37^oС. Аликвоты из каждой криопробирки используют для инокуляции в 100 мл колбах Эрленмейера, содержащих 20 мл среды ST, которые затем инкубируют при +28^oС в течение ночи (предварительная культура) при 200 об/мин. После инкубации 2 мл каждой предварительной культуры переносят стерильно в 20 мл свежей среды ST в добавлением 3-деметилтиоколхикона до конечной концентрации 1 г/л. Биотрансформацию осуществляют и контролируют в условиях, описанных в примере 1. Анализ подтверждает, что трансформация субстрата в 3-гликозильное производное произошла количественно, как указано выше (70% и выше), таким образом доказывая каталитическую стабильность замороженных культур.

Параллельный контроль бульонных культур, высеянных на LB-агар сразу же после оттаивания, подтверждает жизнеспособность, гомогенность и чистоту замороженных культур.

ПРИМЕР 4.

Аликвоты культур в криопробирках после оттаивания используют для инокуляции в 300 мл колбах Эрленмейера, содержащих 50 мл среды ST (предварительная культура). После инкубации в течение ночи при 30^oС, 250 об/мин 5 мл предварительной культуры переносят в 50 мл той же среды с добавлением 3-деметилтиоколхикона до конечной концентрации 1 г/л. Культуры инкубируют в течение 4 суток в тех же условиях, какие описаны выше.

Каждые 4 часа отбирают образцы для оценки уровня роста (измерение поглощения при 600 нм), продуцирования тиоколхикозона (ТСХ и ВЭЖХ), стерильности (на LB-агаре) и для морфологических микроскопических исследований.

Анализ методом ТСХ осуществляют, как описано в примере 1. Для анализа методом ВЭЖХ к 1 мл фракций культуральных бульонов добавляют 9 мл метанола и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 2 минут. Содержание 3-гликозильного производного в супернатанте анализируют методом ВЭЖХ с обращенной фазой с изократным элюированиесм смесью воды и ацетонитрила 80:20.

ВЭХЖ-анализ доказывает, что через 72-96 часов биоконверсия субстрата в тиоколхизон, по существу, завершается.

Конечный выход 3-глюкозильного производного, полученного путем биоконверсии, колеблется от 70 до 85%.

ПРИМЕР 5.

Проверяют процедуру, описанную в примере 4, но 3-деметилтиоколхикон добавляют к культурам двумя порциями: 0,25 г/л в начале и 0,74 г/л через 24 часа.

Характеристики роста и получения культур аналогичны полученным в примере 4 при выходе тиоколхизона примерно 90%.

ПРИМЕР 6.

В колбе Эрленмейера инокулируют 1 л бульона ST (инокулят) культурой из криопробирки. Колбы инкубируют в течение ночи при +30^oС, 250 об/мин. Инокулят стерильно переносят в 14-литровый ферментер, содержащий 9 л стерильного бульона STL. Добавляют 3-деметилтиоколхикон до конечной концетрации 1 г/л (25% в начале, остальное через 20 часов). Ферментацию осуществляют, поддерживая подходящий уровень перемешивания и аэрации (перемешивание вплоть до 900 об/мин; аэрация - 1-1,5 vvm, в зависимости от роста культуры).

Каждые 2 часа из культуральных бульонов отбирают образцы и подвергают следующим анализам:
- определение оптической плотности (OD) при 600 нм;
- анализ на стерильность и чистоту штамма (на LB-агаре);
- микроскопические исследования морфологии (краситель по Граму);
- анализ на содержание тиоколхикозона методом ТСХ и ВЭЖХ, как описано в примерах 1 и 4, соответственно.

После примерно 48-часовой ферментации трансформация субстрата в тиоколхизон почти завершается. Конечный выход составляет примерно 85%.

ПРИМЕР 7.

Повторяют процедуру, описанную в примере 6, но после 48-часовой ферментации для экстракции продукта извлекают лишь 90% культуральных бульонов (фракция 1). К оставшимся 10% в ферментер добавляют стерильно 9 л свежей стерильной среды ST, содержащей 10 г 3-деметилтиоколхикона. Осуществляют ферментацию так, как описано в примере 6. Через 48 часов собирают 9 л культуральных бульонов и экстрагируют (фракция 2). К оставшемуся объему кульутральных бульонов стерильно добавляют еще 9 л стерильной свежей среды ST, содержащей свежий 3-деметилтиоколхикон (10 г). Ферментацию осуществляют так, как описано выше. Через 48 часов собирают весь культуральный бульон и экстрагируют (фракция 3). Биотрансформационная активность штамма остается стабильной во всех трех опытах при выходе конверсии примерно 80%.

ПРИМЕР 8.

Конечный культуральный бульон от ферментации (общий объем примерно 27 л) концентрируют в вакууме до мягкого остатка и растворяют в этаноле.

После отделения посредством фильтрации водноэтанольную фракцию концентрируют в вакууме до воды и очищают посредством повторных экстракций метиленхлоридом. Водные фракции концентрируют и, после доведения рН до 10 с помощью гидроксида натрия, экстрагируют смесями хлорметилена и этанола.

Объединенные органические фазы концентрируют в вакууме. К оставшейся суспензии добавляют этанол, концентрируют и оставляют кристаллизоваться. Осуществляют вторую кристаллизацию с этанолом после дополнительной стадии повторного растворения твердого вещества в смесях хлорметилена и этанола.

Способ предусматривает использование штаммов Bacillus megaterium, которые способны расти в присутствии высоких концентраций колхиконового трансформируемого субстрата. Биотрансформация заключается в замещении гидроксильной или метоксигруппы в положении с-3 ароматического кольца субстрата на O-гликозильный остаток. Способ обеспечивает высокую селективность и эффективность биотрасформации. 13 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения 3-0-гликозилколхиконового соединения формулы (I)

где R¹ представляет собой 0-гликозидный остаток; R² представляет собой (С₁-С₆)-алкокси или (С₁-С₆)-тиоалкил, включающий биотрансформацию соединения, в котором R¹ представляет собой ОН или метокси, с помощью Bacillus megaterium, где штаммы Bacillus megaterium отбирают по их способности расти в присутствии высоких концентраций колхиконового трансформируемого субстрата.