РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК p30NE2, КОДИРУЮЩАЯ 181-АМИНОКИСЛОТНЫЙ N-КОНЦЕВОЙ ФРАГМЕНТ ГЛИКОПРОТЕИНА E2 ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ И ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЕГО ЭКСПРЕССИЮ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ E.coli Российский патент 2005 года по МПК C12N15/73 C12N15/40 C07K14/185 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней (ВКЧС) под контролем индуцибельного промотора, обусловливающего биосинтез белка. Рекомбинантная плазмидная ДНК p31NE2 кодирует полипептид NE2, в котором аминокислотная последовательность MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisllePro своим С-концом соединена с последовательностью 181-аминокислотного N-концевого фрагмента гликопротеина Е2 ВКЧС. Плазмидная ДНК состоит из химически регулируемого (IPTG) промотора/оператора фага Т5, синтетического рибосомсвязывающего сайта, терминатора транскрипции фага лямбда, гена β-лактамазы и участка, кодирующего 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 ВКЧС. Конструкция обеспечивает эффективный биосинтез искомого продукта. Полученный рекомбинантный белок обладает антигенными свойствами ВКЧС. Полученная плазмидная конструкция обеспечивает IPTG-индуцируемый биосинтез рекомбинантного белка ВКЧС в клетках бактерий E.coli. Предлагаемое изобретение может быть использовано в диагностических исследованиях, а также при создании вакцинных препаратов.

ВКЧС - этиологический агент высококонтагиозного инфекционного заболевания, которое характеризуется многообразием клинических форм и проявлений и наносит значительный экономический ущерб. Возбудителем заболевания является оболочечный РНК-содержащий вирус, принадлежащей к роду Pestivirus семейства Flaviviridae. Геном ВКЧС представляет собой одноцепочечную РНК молекулу положительной полярности размером около 12500 нуклеотидов. РНК ВКЧС содержит единственную открытую рамку считывания, с которой транслируется полипротеин-предшественник всех вирусных белков, который впоследствии подвергается процессингу (1).

Образование вирусспецифических антител индуцируют в основном два гликопротеина - Е2 и Е0, а также неструктурный белок р125/р80. Вируснейтрализующей активностью обладают премущественно антитела к Е2. Таким образом гликопротеин Е2 является основным иммуногенным белком ВКЧС (2). Поскольку белок Е2 играет решающую роль в образовании протективного иммунитета, были проведены интенсивные исследования по изучению его структуры и построена модель основного иммунодоминантного участка. Согласно этой модели в структуре данного участка имеется 13 эпитопов, формирующих 4 антигенных домена А, В, С и D. Все эти домены локализованы в N-концевом фрагменте гликопротеина Е2 (3).

Антигенные и иммуногенные свойства данного фрагмента гликопротеина убедительно обосновывают выбор именно этого компонента вируса в качестве наиболее предпочтительного антигена для индукции и детекции антивирусных антител.

Характерной особенностью ВКЧС является широкое генетическое разнообразие штаммов и изолятов вируса, относящихся к разным генетическим группам и подфуппам с выраженной географической корреляцией. Нами проводилось изучение генетической гетерогенности отечественной популяции ВКЧС на основе анализа первичной структуры участка генома, кодирующего N-концевой фрагмент гликопротеина Е2. Проведенные исследования свидетельствуют, что штаммы и изоляты вируса, циркулирующие на территории России, образуют обособленный генетический кластер и структурно отличаются от штаммов и изолятов ВКЧС, циркулирующих, например, в Западной Европе (4).

Полученные данные указывают на необходимость использования в качестве антигена при разработке диагностических тестов и конструировании вакцинных препаратов именно тех штаммов и изолятов ВКЧС, которые циркулируют на данной территории и являются характерными представителями данной генетической подгруппы, так как измененные антигенные характеристики не могут не влиять на способность антигена детектировать и индуцировать антитела. Таким образом, при разработке диагностических тестов и вакцинных прапаратов представляется целесообразным использование в качестве антигена вирусного белка с антигенными характеристиками, аналогичными характеристикам антигена в исследуемой популяции вируса. Поэтому в качестве исходного генетического материала для конструирования рекомбинантного белка нами использовался генетически охарактеризованный фрагмент генома изолята ВКЧС, принадлежащего к популяции, циркулирующей в настоящее время на территории Российской Федерации.

Преимущества использования рекомбинантного белка в качестве антигена связаны с аспектами экономичности, технологичности и биологической безопасности. Замена нативного инфекционного вируса рекомбинантным белком позволяет значительно упростить технологию, уменьшить стоимость получения антигена и производить биологически безопасные диагностические наборы и вакцинные препараты.

В научной литературе имеются данные об экспрессии рекомбинантного гликопротеина Е2 в бакуловирусной системе (5).

Очевидно, что использование технологически сложной и сравнительно дорогостоящей бакуловирусной системы экспрессии рекомбинантного белка не оправдано, так как убедительно показано отсутствие влияния посттрансляционной модификации рекомбинантного продукта на его антигенные свойства (6). Кроме того, авторы включали в состав рекомбинантного продукта практически полную последовательность гликопротеина Е2, а наличие в С-концевой части гликопротеина консервативного линейного эпитопа может приводить к нежелательным серологическим кросс-реакциям с другими пестивирусами (7).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 размером 220 аминокислот и система его экспрессии в клетках E.coli (6).

Основным недостатком данного решения является использование для конструирования экспрессирующей плазмиды структуры гликопротеина Е2 лабораторного штамма ВКЧС (Alfort 187), который существенно отличается от структуры гликопротеина Е2 отечественных изолятов, что может приводить к значительным искажениям при интерпретации результатов серологических исследований образцов сывороток из хозяйств Российской Федерации.

В задачу создания настоящего изобретения входило конструирование in vitro новой рекомбинантной плазмиды, кодирующей рекомбинантный белок NE2 на основе структуры российского изолята ВКЧС под контролем индуцибельного промотора, обусловливающего биосинтез продукта в клетках бактерий Escherichia coli, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вирусспецифических антител и специфически взаимодействующих с поли- и моноклональными антителами к ВКЧС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала синтетических полипептидов для изготовления высокочувствительных и специфичных средств диагностики КЧС для использования на территории Российской Федерации, где циркулирует популяция вируса, вызвавшая это заболевание, а также в качестве компонента вакцинных препаратов.

Указанный технический результат достигнут тем, что сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК p30NE2, кодирующая рекомбинантный NE2 белок, который индуцирует образование вирусспецифических антител и специфически взаимодействует с поли- и моноклональными антителами против ВКЧС и обеспечивает высокий уровень его биосинтеза в клетках бактерий E.coli. Кодируемый плазмидой p30NE2 полипептид содержит 181-аминокислотную последовательность N-концевого фрагмента гликопротеина Е2, соединенную своим N-концом с полигистидиновым трактом, который используется для аффинной очистки рекомбинантного продукта.

Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая полипептид NE2, характеризуется следующими признаками:

кодирует аминокислотную последовательность гибридного белка:

MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisllePro-NE2 белок и содержит

HindIII/BamHI-фрагмент ДНК плазмиды pQE30, включающего промотор/оператор фага Т5, синтетический рибосомсвязывающий сайт, терминатор транскрипции фага лямбда и в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой p30NE2 клеток бактерий E.coli к ампициплину, и содержит также

BamHI/HindIII-фрагмент, кодирующий 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 ВКЧС.

Существенным отличием предлагаемого изобретения от прототипа является то, что предложенный авторами для экспрессии N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 составляет всего 181 аминокислотный остаток и включает структуру вариабельных антигенных доменов, антигенно близкородственную гомологичным структурам изопятов российской популяции ВКЧС.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где

на фиг.1 показана предполагаемая антигенная структура гликопротеина Е2 (3);

на фиг.2 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды p30NE2;

на фиг.3 - нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность 181-аминокислотного N-концевого фрагмента гликопротеина Е2 ВКЧС.

Синтетический ген, кодирующий 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 ВКЧС, получают амплификацией фрагмента генома вируса в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонукпеотидных праймеров, в структуре которых содержатся сайты кливажа для эндонукпеаз BamHI и HindIII. Таким образом, в процессе амплификации фрагмента генома, кодирующего 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2, осуществляется олигонуклеотид - направленный мутагенез с образованием синтетического фрагмента, фланкированного сайтами BamHI и HindIII. Далее проводят клонирование амплифицированного фрагмента в плазмиде pGEM, так как исходный материал содержит гетерогенную генетическую популяцию. Для клонирования осуществляют рестрикцию плазмиды и фрагмента эндонукпеазами BamHI и HindIII с последующим лигированием. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM 109. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и скрининг колоний проводят BamHI/HindIII рестрикцией. Структура фрагмента подтверждается определением нукпеотидной последовательности плазмидной ДНК между сайтами BamHI и HindIII. Для конструирования экспрессирующей плазмиды p30NE2 плазмидную ДНК pGEM-NE2 линеаризуют эндонуклеазами BamHI и HindIII и из рестрикционной смеси фрагмент гена выделяют электрофорезом в 4% полиакриламидном геле с последующей элюцией. С другой стороны, ДНК плазмиды pQE30 линеаризуют рестриктазами BamHI и HindIII и очищают гель-фильтрацией. После этого проводят лигирование плазмиды pQE30 с NE2 фрагментом гена гликопротеина Е2, трансформацию лигазной смесью компетентных клеток JM 109, а трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг проводят рестрикцией с последующим определением нукпеотидной последовательности BamHI/HindIII-фрагмента рекомбинантной плазмиды.

Рекомбинантная плазмидная ДНК p30NE2 кодирует рекомбинантный белок, в котором аминокислотная последовательность MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisllePro своим С-концом соединена с последовательностью 181-аминокислотного N-концевого фрагмента гликопротеина Е2 ВКЧС. После трансформации рекомбинантной плазмидой p30NE2 компетентных клеток E.coli, например JM109, экспрессии в них рекомбинантного белка и очистки его методом аффинной хроматографии данный рекомбинантный NE2 белок может быть использован в качестве антигена ВКЧС в различных модификациях диагностических тестов и вакцинных препаратов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение РНК вируса из патматериала.

Образец патматериапа (1 г) растирают в ступке со стеклянным порошком и добавляют 9 мл STE-буфера. Суспензию осветляют центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин. 100 мкп осветленной суспензии смешивают с 200 мкл 6 М гуанидинизотиоцианата и инкубируют 3-5 мин при комнатной температуре. Добавляют 300 мкл 96% этанола, перемешивают и пропускают смесь через центрифужную миниколонку со стекповолокнистым фильтром типа GF/F (Whatman). Миниколонку с фильтром промывают 2 мл 80% этанола и центрифугируют 1 мин при 13000 g для полного удаления этанола. Затем миниколонку переносят в новую пробирку на 1,5 мл и РНК элюируют с фильтра 50 мкл воды. Через 1-2 мин после добавления воды пробирку с миниколонкой центрифугируют при 13000 g в течение 30 сек, миниколонку удаляют, а раствор РНК используют для реакции обратной транскрипции и апмлификации.

Пример 2. Синтез кДНК на матрице вирусной РНК.

Вьделенную вирусную РНК добавляют к реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 8 мМ МgCl₂; 50 мМ KCl; 15 пмоль праймера “Н”; 1 мМ dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 10 ед. обратной транскриптазы. Реакцию проводят в течение 30 минут при 42°С. После этого содержимое пробирки прогревают в течение 3 мин при 95°С.

Пример 3. Полимеразная цепная реакция.

5 мкл раствора, содержащего кДНК, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 15 мМ Трис-HCl, рН 9,0; 50 мМ KCl; 2,5 мМ MgCl₂, 0,1% BSA; 0,2 мМ каждого из четырех dNTP, 2 единицы Taq-попимеразы и по 25 пмоль праймеров “Н” и “В”. ПЦР состоит из 25 циклов: 95°С в течение 30 сек, 56°С в течение 30 сек, 73°С в течение 1 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73°С в течение 3 мин.

Пример 4. Конструирование рекомбинантной плазмиды pGEM-NE2.

После завершения ПЦР реакционную смесь переосаждают спиртом и растворяют в 25 мкл воды. Затем 20 мкл раствора, содержащего амплифицированные фрагменты кДНК, гидролизуют при температуре 37°С в течение 1-2 часов в присутствии эндонуклеаз BamHI и HindIII в реакционной смеси "R" следующего состава: 6 mМ Трис-HCl; 100 mM NaCl, 6 mМ MgCl₂, 1 mМ DTT. Очистку фрагмента от продуктов гидролиза проводят на миниколонках со стекловолокнистым фильтром. Аналогичную процедуру гидролиза осуществляют с плазмидой pGEM с последующей очисткой методом гель-фильтрации. Лигирование фрагмента и плазмиды проводят в течение часа при 37°С в 20 мкл реакционной смеси “L” состава: 20 mМ Трис-HCl рН 7,5; 10 mM MgCl₂; 0,5 mМ rATP; 5 mM DTT; 10 ед. Т4 ДНК лигазы. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM109.

Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки E.coli JM109 высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LВ и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 mM MgCl₂, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора СаCl₂ и выдерживают при 0°С в течение 30 минут. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М СаCl₂ и через 3 часа используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М СаCl₂, затем добавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0°С, затем 2 мин при 42°С и снова 10 мин при 0°С, после чего добавляют 1 мл LB-бульона, инкубируют 1 час при 37°С и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду pGEM-NE2, идентифицируют рестрикцией плазмидной ДНК. Для этого клетки бактерий E.coli JM109, снятые с LB-агара с ампициллином, выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с процедурой щелочной денатурации с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту добавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37°С, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1), ДНК высаживают этанолом и растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера. 5 мкл раствора плазмидной ДНК инкубируют в буфере R, содержащем 6 mМ трис-HCl, рН 7,5; 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 6 mM MgCb и по 10 ед. эндонуклеаз BamHI и HindIII в течение часа при 37°С. Затем реакционную смесь из каждой пробирки смешивают с 5 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин, бромфеноловый синий, и наносят в “карман” 2% агарозного геля, который после электрофореза окрашивают этидиум бромидом и анализируют под ультрафиолетом. Далее структуру BamHI/HindIII-фрагмента плазмиды pGEM-NE2 подтверждают определением нуклеотидной последовательности методом дидезокситерминации.

Пример 5. Конструирование экспрессирующей плазмиды p30NE2.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pGEM-NE2 в 80 мкл буфера R прибавляют 20 ед. каждой из рестрикционных нуклеаз BamHI и HindIII и инкубируют 90 мин при 37°С. Одновременно 2 мкг ДНК плазмиды pQE30 обрабатывают в 20 мкл буфера R эндонуклеазами BamHI и HindIII. Анализ полноты гидролиза проводят электрофорезом в 1% агарозном геле. Линеаризованную плазмиду pQESO очищают гель-фильтрацией, а фрагмент электрофорезом в 4% ПААГ с последующей электроэлюцией на бумагу ДЕ-81, с которой фрагмент снимают 1,5 М NaCl, осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера. Далее этот фрагмент (0,2 мкг) лигируют в 20 мкл буфера L с мкг ДНК плазмиды pQE30 в присутствии 10 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 60 мин при 37°С. 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli. Приготовление компетентных клеток, трансформацию и анализ клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду p30NE2 проводят, как описано в примере 4. Одновременно полученные клоны после индукции IPTG анализируют с помощью SDS-электрофореза. Клоны отбирают по наличию теоретически предсказанных фрагментов и индуцируемого рекомбинантного белка, выделяемого в чистом виде аффинной хроматографией. Окончательно структуру рекомбинантной плазмидной ДНК p30NE2 подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе встроенного фрагмента, содержащего ген нуклеокапсидного белка. Экспрессию целевого гена проверяют по наличию рекомбинантного белка размером 19 килодальтон, вьщеляемого с помощью аффинной хроматографии, после индукции IPTG трансформированных целевой плазмидой p30NE2 клеток E.coli.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить экспрессирующую плазмидную ДНК p30NE2, кодирующую 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 ВКЧС.

Пример 6. Получение штамма Е.coli - продуцента полипептида NE2.

Полученной плазмидной ДНК p30NE2 трансформируют компетентные клетки бактерий E.coli JM109 по методу, описанному в примере 4, и получают клетки E.coli NE2 109, продуцирующие рекомбинантный полипептид, специфически взаимодействующий с поли- и моноклональными антителами против ВКЧС и индуцирующий образование вирусспецифических антител в организме животных.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК p30NE2, кодирующая 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 ВКЧС и обеспечивающая его экспрессию в клетках бактерий E.coli, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использовании в биотехнологии, в частности в генетической инженерии.

2. Для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов.

3. При использовании предлагаемой рекомбинантной плазмидной ДНК достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на "Рекомбинантную плазмидную ДНК p30NE2, кодирующую 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней и обеспечивающую его экспрессию в клетках бактерий E.coli"

1. Rumenapf Т., Meyers G., Stark R., Thiel H.J. Molecular characterization of HCV // Archive of Virology. - 1991. - V.3. - p.7-18.

2. Weiland E., Stark R., Hass В. Pestivirus glycoprotein which induces neutralising antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer // J. Virology. - 1990. - V.64. - N.8. - p.3563-3569.

3. Van Rijn P.A., Miedema G.K.W., Wensvoort G. et al. Antigenic structure of envelope gpE1 of HCV//J. Virology. - 1994. - V.68. - N.6. - p.3934-3942.

4. Bezborodova S.V., Andreyev V.G., Drygin V.V., Gusev A.A. Genetic features of CSFV in Russia // Xth International Congress of Virology. - 1999, Sydney, Australia. - p.329.

5. Moser C., Ruggli N., Tratschin J.D., Hofmann M.A. Detection of antibodies against classical swine fever virus in swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope glycoprotein E2 // Veterinary Microbiology. - 1996. - V.51. - p.41-53.

6. Clavijo A., Lin M., Riva J., Mallory M., Fin F., Zhou E.M. Development of a competitive ELISA using a truncated E2 recombinant protein as antigen for detection of antibodies to classical swine fever virus // Research in Veterinary Science. - 2001. - V.70. - p.1-7 (прототип).

7. Yu M., Wang L.F., Shiell B.J., Morrissy C.J., Westbury H.A. Fine mapping of a C-terminal linear epitope highly conserved among the major envelope glycoprotein E2 of different pestivirus // Virology. - 1996. - V.222. - p.289-292.

Изобретение относится к области генетической инженерии. Рекомбинантная плазмидная ДНК р30NE2 содержит BamHI/HindIII фрагмент ДНК плазмиды pQE30, включающий промотор/оператор фага Т5, синтетический рибосомсвязывающий сайт, терминатор транскрипции фага лямбда и в качестве генетического маркера ген β -лактомазы, а также BamHI/HindIII фрагмент, кодирующий 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Плазмида обеспечивает экспрессию гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней в клетках бактерий E.coli. Изобретение может быть использовано в диагностических исследованиях, а также при создании вакцинных препаратов. 3 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК р30NE2, представленная на фигуре 2, кодирующая 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней и обеспечивающая его экспрессию в клетках бактерий Е. сoli, характеризующаяся тем, что имеет длину 4012 п.о. и содержит BamHI/HindIII фрагмент ДНК плазмиды рQЕ30, включающий промотор/оператор фага Т5, синтетический рибосомсвязывающий сайт, терминатор транскрипции фага лямбда и в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой р30NЕ2 клеток бактерий Е. соli к ампициллину, содержит также указанный на фигуре 3 BamHI/HindIII фрагмент, кодирующий 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гена гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней.