Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм Escherichia coli, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ДНК-копию фрагмента области env генома HTLV-1, определяющую синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поврехностного гликопротеида оболочки HTLV-1, и способ создания такой плазмиды.
Вирус T- клеточного лейкоза человека 1 типа (human T-cell leukemia virus type 1, HTLV-1) относится к семейству Retroviridae, подсемейство Oncovirinae, группа (HTLV-BLV). Он оказался первым обнаруженным ретровирусом человека C-типа и является этиологическим агентом некоторых злокачественных T-клеточных лейкозов/лимфом взрослых. Кроме того, HTLV-1-инфекция, как правило, ассоциирована с целым семейством родственных неврологических расстройств, включающих тропический спастический парапарез, HTLV-1-ассоциированную миелопатию и хроническую лимфоцитическую лейкемию. Этот вирус является типичным C-лимфотропным ретровирусом 1 типа со специфической аффинностью к CD4+ лимфоцитам, вызывающим их неопластическую трансформацию. У лиц с антителами к HTLV-1 наблюдаются значительные изменения основных субпопуляций лимфоцитов.
Область env HTLV-1 локализуется в районе 5202-6668 пар нуклеотидов (п.н. ) генома и кодирует основной гликопротеид оболочки вируса HTLV-1. Продукт гена env предшественник белков оболочки вируса с мол. мас. 61 кДа обнаруживается только в инфицированных клетках. Этот предшественник процессируется клеточными ферментами на два функциональных домена: наружная гликопротеиновая часть (gp46) и трансмембранная часть (p21).
Рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный нами фрагмент области env, кодирует неполный предшественник гена env и обеспечивает синтез в бактериях Escherichia coli (E. coli) гибридного белка, N-концевая часть которого представлена бета-галактозидазой, а C-концеваая вирусоспецифической последовательностью. Данная конструкция в литературе не описана.
Целью изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеида оболочки HTLV-1, способной наследоваться в штаммах бактерий E.coli, и создание таким образом штамма - продуцента этого белка.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pESG состоит в том, что с помощью фермента рестрикции SalG1 из промежуточной плазмиды pBE1 вырезан фрагмент величиной 426 п.н. Этот фрагмент лигируют с линеанизированной гидролизом SalG1 формой ДНК плазмидного вектора pUR291. После соответствующей инкубации трансформируют полученным препаратом компетентные (обработанные CaCl/2) клетки E. coli с последующим отбором трансформантов по их способности расти на среде, содержащей ампициллин.
Анализ полученной рекомбинантной ДНК проведен с помощью эндонуклеаз рестрикции.
Описание плазмиды.
Название pESG,
Размер 5,6 т.п.н.
Состоит из SalG1 BamH1 фрагмента (426 п.н.) последовательность области env HTLV-I; SalG1 фрагмента плазмиды pUR291 размером 5,2 т.п.н. с геном бета-галактозидазы, областью ori и геном устойчивости к ампициллину (фиг.1);
уникальные сайты рестрикции BamHI, RstI, HindIII, StuI, ClaI, Tth111-II;
Плазмида определяет устойчивость клеток E.coli HB101 к ампициллину и синтез в них гибридного белка величиной 485 а.к. остатков, содержащего антигенные детерминанты области env HTL
Пплазмида неконьюгативна.
Описание штамма E.coli HB101/pESG.
Морфологические признаки.
Клетки прямые, палочковидной формы 1,2 х 1,6 x 2,0 мкm, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, споронеобразующие.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, L-агаре -колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, мутные, край ровный. При росте на жидких средах: мясо-пептонном бульоне, L-бульоне- образуют ровную интенсивную муть.
Физико-биохимические признаки.
Клетки растут в пределах от 4 до 45 град. С при оптимуме pH от 6,8 до 7.5. В качестве источника углерода используют глюкозу и фруктозу. Ацетат не усваивают, нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают, индол не образуют. Уреазная активность не обнаружена.
Устойчивость к антибиотикам.
Клетки устойчивы к ампициллину за счет наличия плазмиды pESG.
Пример 1. Конструирование плазмиды pESG.
В качестве источника вирус-специфических последовательностей использована ранее полученная нами плазмида pMC1, (Вопросы вирусологии, 1991 г. стр. 325-326), состоящая из PvuII-EcoRI фрагмента (5273-8760 п.н.), выделенного из полной кДНК копии HTLV-1 в составе плазмидного вектора pUC19.
Для удобства субклонирования была сконструирована промежуточная плазмида pBE1, содержащая вставку фрагмента генома HTLV-1 с координатами 5273-6120 п. н. по сайтам PvuII BamH1 ч в векторе pUR291.
Заключительная плазмида pESG была получена путем рестрикции плазмида pBE1 ферментом SaiG1. Полученный фрагмент гена env HTLV-1 был сублокирован в составе вектора pUR291 с помощью той же рестриктазы.
Для этого 10 мкг плазмидной ДНК pMC1 инкубировали с 30 ед. BamHi в присутствии буфера "В" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ), содержащего 10 мМ Tris-HCl с pH 8.0, 5.0 мМ MgCi/2,100 мМ NaCi и 1,0 мМ меркаптоэтанол, в течение 1 ч при 37oC. Реакционную смесь наносили на 1% агарозный гель, содержащий бромистый этидий в концентрации (0,5 мкг/мл) и проводили электрофорез в трис-ацетатном (TAE) буфере в течение 0,5 ч при 100 В. Далее выделяли нужный фрагмент ДНК с помощью набора "Gene Ciean" фирмы "BiO-101" (США) путем вырезания нужного фрагмента под мягким ультрафиолетом (366 нм) и растворения его в 2-3-хкратном объеме Naj (раствор из набора) при нагревании до 45-50oC. В расплав геля добавляли 5 мкл суспензии стеклянных шариков, способных иммобилизовть ДНК. Через 5 мин шарики осаждали на центрифуге "Eppendorf" (ФРГ) в течение 2 мин при 10000 об./мин, после чего супернатант удаляли. Осажденные стеклянные шарики ресуспендировали раствором "New" (прилагается в наборе) на 96% этиловом спирте с помощью вортекса. Процедура повторяется трижды, после чего плазмидная ДНК смывается со стеклянных шариков дистиллированной водой в нужном объеме путем ресуспендирования на вортексе и осаждения шариков на центрифуге "Eppendorf" (ФРГ). Супернатант содержит искомую ДНК.
Три мкг вектора pUR291 инкубировали с 30 ед. BamH1 в тех же условиях.
Гидролизированная ДНК плазмиды pUR291 (0,5 мкг) и Pvuii-BamHi фрагмент генома HTLV-I из плазмиды pMC1, обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4 (3 000 ед. /мг) фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ) из расчета 1 мкл фермента на 0,5 мкг ДНК. Состав десятикратного лигазного буфера: Tris-HCi 660 mM, MgCi/2,50 мМ, DTE 10 мМ, ATP 10 мМ, pH 7.5. Инкубацию проводили в течение 10 ч при 12oC
Полученный препарат использовали для трансформации клеток E.coIi HB101 хлоркальциевым методом. Трансформированные клетки подращивали 1,5 ч и высевали на агаризованную среду, содержащую L-бульон с ампициллином. Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 18ч при 37oC, анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозе с добавлением 0,5 мкг/мл бромида этидия. Были отобраны клоны, молекулярная масса которых больше, чем у исходного вектора pUR291. Полученная плазмида, в которой ориентация гена env HTLV-I совпадала с рамкой считывания гена бета-галактозидазы, (что определяли гидролизом ДНК ферментом BamHI), была обозначена pBE1.
Клетки бактерий E.coIi HB101, содержащие плазмидную ДНК pBE1, выращивали в 200 мл бульона до титра 1000 млн. клеток/мл. Клетки осаждали центрифугированием (5000g, 5 мин, 4oC) и ресуспендировали в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона X100, 50 mM ЭДТА pH 8,0 и 10 mM Tris-HCI H 8,0. Далее добавляли 2,5 мл свежеприготовленного раствора лизоцима с концентрацией 10 мг/мл, быстро перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин. Полученный лизат центрифугировали (20 000g, 30 мин, 4oC) и ДНК из супернатанта осаждали равным объемом изопропанола. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием (12 000g, 20 мин,2 oC) и ресуспендировали в 5 мл 10 mM Tris-HCI буфера, pH 8,0.
Синтез заключительной плазмиды pESG в прямой ориентации проводили следующим образом: 10 мкл плазмиды pBE1 гидролизировали форментом SaIG1 в присутствии буфера "Н" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ), состоящего из 50 мМ Tris-HCI с pH 7.5, 10mM MgCI, 100 mM NaCI и 1,0 mM DTE в течение 1ч при 37 oC. Для лигирования использовали выделенный SaiG1 фрагмент гидролизированной плазмиды pBE1 и лианезированную тем же ферментом ДНК плазмидного вектора pUR291 с сохранением рамки считывания клонированного гене и бета-галактозидазы.
Сам процесс лигирования проводили по методике, приведенной выше. Лигированный материал трансформировали в компетентную культуру E.coIi HB101. Выросшие на агарозной среде колонии в присутствии ампициллина засеивали L-бульон с той же концентрацией антибиотика. Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 18 ч при 37oC, анализировали с помощью электрофореза. Были отобраны клоны, молекулярная масса которых больше, чем у исходного вектора pUR291.
Для выбора искомой плазмиды был проведен анализ способности отобранных плазмид синтезировать гибридные белки молекулярной массой 133,5 кДа, содержащие вирус-специфические последовательности области env.
Пример 2. Анализ уровня синтеза гибридного белка, обладающего антигенными свойствами E.coIi HB101/pESG.
Анализ белков в лизатах клеток E.coIi HB101, содержащих гибридную плазмиду pESG, проводили следующим образом. Два мл суспензии клеток E.coIi HB101, содержащих плазмиду pESG, выросших в течение 18 ч из отдельной колонии до концентрации 2000 млн. клеток/мл в L-бульоне, содержащем ампициллин, осаждали центрифугированием (12000g, 1 мин) и ресуспендировали в 200 мкл буфера, содержащего 50 mM трис HCI pH 7,8, 2,5% додецилсульфата натрия, 10% глицерина, 0,7% -меркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кипятили 5 мин на водяной бане с последующим анализом методом электрофореза. В лизатах бактерий, содержащих плазмиду pESG, обнаружен дополнительный белок с мол. мас. 133,5 кДа. (фиг.2А). Антигенную активность белка с мол. мас.133,5 кДа анализировали с помощью метода иммуноблота (фиг. 2Б). Полученный гибридный белок обладал антигенной активностью HTLV-I. Уровень синтеза гибридного белка составлял не менее 20% от тотального клеточного белка.
Изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 200 350 мг белка, обладающего антигеными свойствами HTLV-I.
Аминокислотный профиль полученного гибридного белка (485 аминокислот (а. к. )) представлен в следующем ассортименте: 339 а.к. бета-галактозидазы (полная последовательность бета-галактозидазы без одного аминокислотного остатка), 2 а.к. кодируемые начальным фрагментом полилинкерной последовательности векторной плазмиды pUR291, 142 а.к. представляют собой фрагмент, кодируемый геном env HTLV-I, а именно иммуногенный фрагмент белка gp 46 и 2 а. к. кодируемые заключительным фрагментом полилинкера pUR291 (терминатор), (фиг.3).
Пример 3. Демонстрация возможности использования целевого продукта для создания диагностикума на HTLV-I.
Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 2, разделяли методом электрофореза в ПААГе и анализировали методом иммуноблота с помощью сыворотки пациента, инфицированного HTLV-I. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду pESG, обнаружена дополнительная полоса, специфически реагирующая с антителами к HTLV-I. В препарате, использовавшемся в качестве контроля, приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор pUR291, такая полоса не идентифицирована.
Таким образом плазмида pESG детерминирует в клетках E.coIi синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков HTLV-I. Следовательно, созданную плазмиду и штамм-продуцент гибридного белка возможно использовать для создания лабораторных тест-систем на выявление антител к HTLV-I.
Использование: биотехнология, разработка диагностикумов для выявления вируса T - клеточного лейкоза человека первого типа /HTLV-1/. Сущность: получение рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного env - белка HTLV-1, обладающего антигенными свойствами, и получение штамма-продуцента указанного белка. Плазмиду pESG получают при соединении фрагмента плазмиды pVR 291, кодирующего β - галактозидазу E.coli, два полилинкера, область начала репликации и ген устойчивости к ампициллину, с фрагментом плазмиды pBEI, содержащим последовательность env - белка HTLV-1. Полученный плазмидой трансформируют клетки E.coli и отбирают штамм ГКВ/pESG, продуцирующий гибридный белок, содержащий вирусоспецифические последовательности гена env HTLV-1. При культивировании штамма ГКВ/pESG из 1 л клеточной суспензии получают 200-350 мг белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-1. 3 с.п. ф-лы, 3 ил.
