РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pUL 44HCMV, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ФРАГМЕНТА ГЕНА UL44 ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА, КОДИРУЮЩЕГО ИММУНОДОМИНАНТНУЮ ЧАСТЬ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА p 52(ICP36), В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI Российский патент 2000 года по МПК C12N15/00 C12N15/38 C12N15/63 A61K39/12 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную "in vitro" рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент гена UL44 цитомегаловируса человека (HCMV), кодирующий иммунодоминантную часть (2 антигенных эпитопа) ДНК-связывающего белка p52 (ICP36) вируса с 200 по 431 а.к. Конструкция обеспечивает в клетках бактерий E. coli биосинтез полипептида в виде фрагмента p52HCMV с полигистидиновым (6^*His) трактом для аффинной очистки, обладающего антигенными свойствами цитомегаловируса человека. Этот очищенный с помощью аффинной хроматографии рекомбинантный белок может быть использован в качестве HCMV-антигена для серологического тестирования цитомегаловируса в клинической практике. Использование этого антигена для выявления специфичных к цитомегаловирусу иммуноглобулинов М (IgM-HCMV) показывает 98-99% чувствительности и специфичности в иммуноферментном анализе.

Главный поздний ДНК-связывающий белок p52(ICP36) цитомегаловируса человека, кодируемый геном UL44, представляет собой протеин с молекулярной массой 52000 дальтон и является одним из белков, связанных с HCMV-полимеразой. Это гидрофобный вирусный белок, обладающий свойствами антигена цитомегаловируса, содержащий 3 антигенных эпитопа [1], два из которых обладают высокой специфичностью по отношению к HCMV-специфичным антителам и не имеют серологического сродства с другими герпесвирусными белками [2].

Неизвестны способы получения этого белка в чистом виде [1] из очищенного вируса. Существует возможность использования в иммунологическом анализе этого белка-антигена только в составе вирусной суспензии или в виде лизата клеток, инфицированных цитомегаловирусом. Недостатками этих способов являются использование цитомегаловируса, патогенного для человека, а также использование дорогостоящей наработки вирусного материала, требующей больших расходов человеческой эмбриональной сыворотки, других дорогостоящих материалов и дорогих технологических приемов, таких как ультрацентрифугирование. При этом даже полученный высокоочищенный вирус не гарантирует от перекрестных неспецифических реакций с другими вирусами при использовании этого антигена в иммуноферментном анализе (ИФА).

Известны способы получения вирусного белка p52 (ICP36) микробиологическим синтезом [3], показывающие его иммунохимическую активность. Однако, согласно предложенным способам, экспрессируемая часть гена кодирует не только уникальные антигенные детерминанты, но и области гомологии с другими вирусными белками, а также в них отсутствует аффинная мишень для последующей хроматографической очистки синтезируемого белка.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [1]. Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит фрагмент гена UL44. Описанная плазмидная конструкция позволяет экспрессировать рекомбинантный белок в виде слитого с полноразмерной β-галактозидазой белка. Уровень экспрессии в штамме-продуценте E. coli достигает 1-3% от суммы клеточных белков.

Недостатками способа-прототипа являются экспрессия лишь части последовательности, кодирующей иммунодоминантный район; относительно низкий уровень синтеза кодируемого полипептида p52 (1- 3% от суммарного клеточного белка) и наличие полноразмерной β-галактозидазы как неспецифического антигена в последующем ИФА, а также низкий уровень хроматографической очистки, составляющий не более 50-60% от β- галактозидазы и суммарного клеточного белка.

Технической задачей изобретения является получение рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей экспрессию фрагмента гена UL44 цитомегаловируса человека, кодирующего всю иммунодоминантную часть p52HCMV с 200 по 431 а.к., в составе бактериального плазмидного вектора, кодирующего 6^*His-мишень для аффинной очистки белка. Конструкция должна обеспечивать более высокий уровень биосинтеза рекомбинантного p52HCMV в клетках E. coli и уровень аффинной очистки с использованием 6^*His-мишени не менее 95-98% рекомбинантного белка.

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pUL44HCMV, кодирующей IPTG- индуцируемый биосинтез полипептида, обладающего антигенными свойствами цитомегаловируса человека, в клетках E. coli в виде фрагмента p52HCMV(c 200 по 431 а. к.), с 6^*His на N-конце для аффинной очистки.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pUL44HCMV, кодирующая иммунодоминантную часть главного ДНК-связывающего протеина p52 цитомегаловируса человека, характеризуется следующими признаками:
- имеет молекулярную массу 2,73 мегадальтон (4,14 т.п.о.);
- кодирует аминокислотную последовательность иммунодоминантной части белка p52HCMV(c 200 по 431 а.к.);
- состоит из:
- BamHI/PstI - фрагмента ДНК плазмиды pQE30 (3,424 т. п.о.) [4];
- BamHI/PstI - фрагмента гена UL44 (716 п.о.), кодирующего всю иммунодоминантную часть белка p52HCMV (с 200 по 431 а.к.);
- содержит:
- в качестве генетического маркера ген lba β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pUL44HCMV клеток к ампициллину;
- нуклеотидную последовательность, кодирующую полигистидиновый тракт в рамке считывания гена UL44, состоящий из 6 молекул аминокислоты гистидина, для последующей очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin;
- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты:
SmaI - 498; NaeI - 475; NcoI - 530;
BamHI - 146; PstI - 862.

Существенными преимуществами предложенной плазмидной конструкции в отличие от прототипа является наличие экспрессируемого фрагмента гена UL44, кодирующего только иммунодоминантную часть белка p52HCMV без β- галактозидазы и наличие в N - концевой области полигистидинового тракта, что в совокупности обеспечивает уровень синтеза целевого белка 40 - 50% с выходом очищенного продукта после аффинной хроматографии до 98 - 99% от суммарных клеточных белков.

Перечень графических материалов
Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pUL44HCMV.

Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность гена UL44, кодирующая гидрофильную иммунодоминантную часть белка p52.

Фиг. 3. Аминокислотная последовательность иммунодоминантного фрагмента белка p52HCMV, кодируемого рекомбинантной плазмидой pUL32HCMV.

Фиг. 4. Электрофореграмма лизатов клеток E. coli (штамм TG-1), трансформированных плазмидой pUL44HCMV, синтезирующих p52HCMV (дорожка 3); штамма реципиента (дорожка 2); рекомбинантного белка p52HCMV, очищенного аффинной хроматографией на Ni-NTA-resin (дорожка 4). Стрелкой указан рекомбинантный белок p52HCMV.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pUC(UL44).

10 мкг плазмидной ДНК pUC19 [5] обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI в соответствии с методикой, описанной в работе [6], и из полученного гидролизата выделяют в 4%-ном полиакриламидном геле векторный фрагмент длиной 2,664 т.п.о.

10 мкг ДНК из реакционной смеси после проведения полимеразной цепной реакции с геномной ДНК цитомегаловируса, штамм AD169 в соответствии с методикой, описанной в работе [6], обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI и из полученного гидролизата выделяют в 4%-ном полиакриламидном геле фрагмент длиной 0,716 т.п.о.

Полученный фрагмент и векторную часть плазмиды pUC19 сшивают при помощи лигазной реакции в 30 мкл буфера для лигирования. 10 - 20 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E. coli TG-1[5]. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют рестрикционным анализом. Отбирают ДНК клонов по наличию теоретически предсказанных фрагментов.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pUL44HCMV.

10 мкг плазмидной ДНК pUC(UL44) обрабатывают последовательно эндонуклеазами рестрикции PstI и BamHI в соответствии с методикой, описанной в работе [5] , и из полученной реакционной смеси выделяют в 4%-ном полиакриламидном геле фрагмент ДНК длиной 0,716 т.п.о.

10 мкг плазмидной ДНК pQE30 обрабатывают рестриктазами BamHI и PstI в соответствии с методикой, описанной в работе [4], и из полученного гидролизата выделяют в 4%-ном полиакриламидном геле векторный фрагмент длиной 3,424 т.п.о.

Концы полученного фрагмента и вектора соединяют при помощи лигазной реакции в 30 мкл буфера для лигирования. 5 - 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток TG-1 [5]. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК pUL44HCMV и анализируют ее путем обработки набором эндонуклеаз рестрикции SmaI, NaeI, NcoI, BamHI и PstI с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 4%-ном полиакриламидном геле. Из 10 проанализированных клонов 10 показали нужный набор рестрикционных фрагментов. Целевая плазмида pUL44HCMV содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты:
SmaI - 498; NaeI - 475; NcoI - 530; BamHI - 146; PstI - 862.

Окончательную структуру рекомбинантной ДНК pUL44HCMV подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе встроенного фрагмента, содержащего фрагмент гена UL44HCMV (фиг. 2).

Экспрессию целевого гена UL44HCMV проверяют по наличию рекомбинантного белка 28 килодальтон, выделяемого с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin, после индукции IPTG трансформированной целевой плазмидой pUL44HCMV клеток E. coli TG-1 (фиг.4).

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить экспрессирующую плазмидную ДНК pUL44HCMV, кодирующую фрагмент гена UL44HCMV. Трансформированная этой плазмидой культура клеток E. coli TG-1 при индукции IPTG осуществляет биосинтез полипептида размером 28 килодальтон, состоящего из фрагмента белка p52 (с 200 по 431 а.к.) цитомегаловируса человека, содержащего 2 антигенных эпитопа, и расположенный на N-конце полигистидиновый тракт. Все это позволяет по сравнению с прототипом упростить процесс получения высокоочищенного до 98 - 99% рекомбинантного антигена p52HCMV, а также увеличить синтез целевого полипептида в 40 - 50 раз. Этот рекомбинантный белок после аффинной хроматографии может быть использован в качестве HCMV-антигена для серологического анализа цитомегаловируса в клинической практике. Уровень выявления специфичных к цитомегаловирусу иммуноглобулинов в крови пациентов при использовании этого белка показывает 98 - 99% чувствительности и специфичности к IgM-HCMV в иммуноферментном анализе.

Список литературы.

1. Landini М.Р., Guan М.Х., Jahn G., Lindenmeier W., Mach M., Ripalti A. , Necker A., Lazzarotto Т., Plachter B. Large scale screening of human sera with cytomegalovirus recombinant antigens //J. Clin. Microbiology. 1990. V. 28. P. 1375-1379.

2. Landini М.Р., Mach M. Seaching for antibodies specific for HCMV: Is it diagnostically useful? When and How // Scand. J. of Infect. Dis. 1995. V. 99. P. 18-23.

3. Европейский патент N 0252531, кл. 4 C 12 N 15/00, 1988 г.

4. The QIAexpressionist. Hilden: QIAGEN, Summer 1992. P. 70.

5.Маниатис Т., Фрич, Сэмбук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Пер. с англ., M., Мир.

6. М. А.Суслопаров, П.А.Белавин, А.В.Крендельщиков, А.И.Бедристов, М.М. Бахтина, В. В.Гуторов, И.В.Бабкин, А.А.Чепурнов (1996) Клонирование и определение первичной структуры генов белков IЕ2 и pp150 цитомегаловируса человека (HCMV) //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1996, N 1, стр. 32-35.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит фрагмент гена UL44 цитомегаловируса человека (HCMV), кодирующий иммунодоминантную часть (2 антигенных эпитопа) ДНК-связывающего белка p52 (ICP36) вируса. Конструкция обеспечивает в клетках E. coli биосинтез полипептида в виде фрагмента р52 HCMV с полигистидиновым трактом для аффинной очистки, обладающего антигенными свойствами цитомегаловируса человека. Использование полученного антигена для выявления специфичных к цитомегаловирусу иммуноглобулинов M(IgM-HCMV) в крови пациентов показывает 98-99% чувствительности и специфичности в иммуноферментном анализе. Описанная плазмидная конструкция позволяет увеличить синтез целевого полипептида в 40-50 раз по сравнению с прототипом. 4 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pUL44HCMV, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена UL 44 цитомегаловируса человека, кодирующего иммунодоминантную часть ДНК-связывающего белка p 52(ICP36), в клетках бактерий Escherichia coli, характеризуется следующими признаками:
имеет молекулярную массу 2,73 мегадальтон (4,14 т.п.о.);
кодирует аминокислотную последовательность иммунодоминантной части p52 HCMV (с 200 по 431 а.к.);
состоит из
BamHI/PstI-фрагмента ДНК плазмиды pQE30(3,424 т.п.о.);
BamHI/PstI-фрагмента гена UL 44 (716 п.о.), кодирующего всю иммунодоминантную часть белка p52 HCMV (с 200 по 431 а.к.);
содержит:
в качестве генетического маркера ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pUL 44HCMV клеток к ампициллину;
нуклеотидную последовательность, кодирующую полигистидиновый тракт в рамке считывания гена UL 44, состоящий из 6 молекул аминокислоты гистидина, для последующей очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: SmaI-498; NaeI-475; NcoI-530; BamHI-146; PstI-862.