РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PGDN, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК PGDN И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИЙ РЕКОМБИНАНТНУЮ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК PGDN, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ 579 А.К., ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ ВИРУСА Т-КЛЕТОЧНОГО ЛЕЙКОЗА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА Российский патент 1997 года по МПК C12N15/00 C12N15/48 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазменную ДНК с фрагментами области gag генома HTLV-1, определяющую синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-1, и способ создания такой плазмиды.

Вирус Т-клеточного лейкоза I типа (human T-cell leukemia virus type 1, HTLV-1) является этиологическим агентом Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых тяжелого заболевания, характеризующегося злокачественной пролиферацией ОКТ-4+ лимфоцитов. Этот вирус также ассоциируется с рядом неврологических расстройств, а именно с различными формами миелопатий и тропическими спастическими парапарезами. Длительность латентного периода при инфекции HTLV-1 в ряде случаев может достигать 20-40 лет. Область gag HTLV-1 локализуется в районе 824-2113 пар нуклеотидов (п.н.) генома и кодирует белки сердцевины вируса, матрикс и нуклеокапсид р19, р24 и п15 соответственно.

Рекомбинантные ДНК, содержащие фрагмент области gag, кодирующий неполный предшественник гена gag, и обеспечивающие синтез в бактериях Escherichia coli (E.coli) гибридного белка, N-концевая часть которого представлена бета-галактозидазой, а С-концевая вирусоспецифической последовательностью, в литературе не описаны.

Предложенное изобретение позволяет путем создания рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-1, и способной наследоваться в штаммах бактерий E.coli, создать таким образом штамм-продуцент этого белка.

Описание плазмиды:
название pGdN;
размер 5,9 т.п.н.

уникальные сайты рестрикции BamHI, PstI, StuI, Tth111-II; состоит из NcoI-BamHI фрагмента плазмиды pUR290 размером 5,2 т.п.н. с геном lacZ, кодирующим полноразмерную бета-галактозидазу размером 341 ак; двух фрагментов полилинкера, кодирующих 4 ак; областью ori и геном устойчивости к ампициллину Ap/r (фиг.1);
состоит из NcoI SmaI фрагмента (699 п.н.) плазмиды pMT2 (несущей полноразмерный геном HTLV-1), содержащего последовательность области gag HTLV-1 и кодирующей 234 ак остатка GAG предшественника HTLV-1 (со 144 по 377), а именно 200 С-концевых ак р24 основного белка сердцевины вириона и 34 N концевых аминокислот белка р15;
плазмида определяет устойчивость клеток E.coli K12 HB101 к ампициллину и синтез в них гибридного белка размером 579 аминокислотных остатков, содержащего антигенные детерминанты области gag HTLV-1;
плазмида неконъюгативна.

Описание штамма E.coli K12 HB101/pGdN.

Штамм бактерий Escherichia coli K12 HB101/pGdH, используемый для получения гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1 депонирован в музее штаммов и плазмид Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Штамму присвоен инвентарный номер ГКВ/pGdH. Генотип штамма: F, ehd A1, hsdR17 (r, m), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, ф(argF-1ac z,y,a), U169, 0 80d, 1acZ фm15.

Уровень синтеза гибридного белка составляет не менее 30 от тотального клеточного белка и позволяет получить с 1 л клеточной суспензии 400-500 мг белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-1.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы 1,2х1,6х2,0 мкм, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, споронеобразующие.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах. Для выращивания бактерий E.coli использовали питательную среду (L-бульон) следующего состава (г/л): бактотриптон или бактопептон (Difco)-10, дрожжевой экстракт (Difco) 5, NaCl-10. Твердой питательной средой служил LB с добавлением 1, 5% агара (Difco). Отбор клонов E.coli, устойчивых к ампициллину (Аp), проводили на твердой питательной среде с добавлением 30-100 мкг на мл ампициллина. Перед употреблением питательную среду автоклавировали в течение 30 мин при 120^oC и 1,2 атм. При росте на твердых средах колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, мутные, край ровный. При росте на жидких средах образуют ровную интенсивную муть.

Число жизнеспособных клеток определяли путем подсчета колоний, выросших на твердой питательной среде через 16-18 ч инкубации при 37^oС. Суспензию бактериальных клеток высевали из различных разведений в объме 0,1-0,2 мл путем растирания шпателем по поверхности чашки с агаром. Концентрацию клеток в бактериальной суспензии определяли также нефелометрическим методом. Оптическую плотность замеряли на спектрофометре при длине волны света 590 нм с длиной светового пути 1 см. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в этом случае по калибровочной кривой.

Физико-биохимические признаки: клетки растут в пределах от 4 до 45^oС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода используют глюкозу и фруктозу. Ацетат не усваивают, а нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают, индол не образуют. Уреазнная активность не обнаруживается.

Устойчивость к антибиотикам: клетки устойчивы к ампициллину за счет наличия плазмиды pGdN.

Пример 1. Конструирование плазмиды pGdN.

Для получения первой промежуточной плазмиды pSI взят SmaI фрагмент (870-1952 п. н. ), выделенный из ранее полученной нами плазмиды pEHgagI (Вопросы вирусологии, 1991, стр. 325-326), содержащей Eco47.3 HindIII фрагмент ДНК-копии вирусного генома в векторе pUC18, который был использован для переклонирования гена gag (1080 п.н.) в вектор pUC8 по этой же рестриктазе.

Для этого 20 мкг ДНК плазмиды pEHgag1 инкубировали с 30 ед. SmaI в буфере, содержащем 33 мМ Tris- ацетат pH 7.9, 10 mM Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат, 0,5 мМ DTT, (буфер "А" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ) в течение 1 ч при 37^oС. Реакционную смесь наносили на 1% агарозный гель, содержащий бромистый этидий в концентрации (0,5 мкг/мл), и проводили электрофорез в трис-ацетатном (ТАЕ) буфере в течение 0,5 ч при 100 В. Далее выделяли нужный фрагмент ДНК с помощью набора "Gene Clean" фирмы "В10-101" (США) путем вырезания нужного фрагмента под мягким ультрафиолетом (366 нм) и растворения его в 2-3-кратном объеме NaJ (раствор из набора) при нагревании до 45-50^oC. В расплав геля добавляли 5 мкг суспензии стеклянных шариков, способных иммобилизовать ДНК. Через 5 мин шарики осаждали на центрифуге "Eppendorf" (ФРГ) в течение 2 мин при 10000 об/мин, после чего супернатант удаляли. Осажденные стеклянные шарики ресуспендировали раствором "New" (прилагается в наборе) на 96% этиловом спирте с помощью вортекса. Процедура повторяется трижды, после чего плазмидная ДНК смывается со стеклянных шариков дистиллированной водой в нужном объеме путем ресуспендирования на вортексе и осаждения шариков на центрифуге "Eppendorf" (ФРГ). Супернатант содержит искомую ДНК.

Два мкг вектора pUC8 инкубировали с 30 ед. SmaI в тех же условиях.

Фрагменты ДНК плазмиды pUC8 (0,5 мкг) и SmaI фрагмента HTLV-1 из плазмиды pEHgag1, обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4 (3000 ед./мг) фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ) из расчета 1 мкл фермента на 0,5 мкг ДНК. Состав десятикратного лигазного буфера: Tris-HCl 660 mM, MgCI 2,50 mM, DTE 10 mM, ATP 10 mM, pH 7,5. Инкубацию проводили в течение 10 ч при 12^oC.

Полученный препарат использовали для трансформации компетентных клеток E. coli HB101, полученных хлоркальциевым методом. Трансформированные клетки подращивали 1,5 ч и высевали на агаризованную среду, содержащую L-бульон с ампициллином. Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 18 ч при 37^oC, анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозе с добавлением 0,5 мкг/мл бромида этидия. Были отобраны клоны, у которых молекулярная масса гибридных белков больше, чем масса векторной части у исходного клона (вектор pUC8). Полученная плазмида, в которой ориентация гена gag HTLV-1 совпадала с рамкой считывания гена бета-галактозидазы, что определяли гидролизом ДНК ферментами NcoI и BamHI, была обозначена как pSI.

Для гидролиза брали 10 мкл плазмидной ДНК, которую инкубировали с 20 ед. каждого из ферментов в присутствии буфера "В" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ), содержащего 10 мМ Tris-HCl c pH 8,0, 5,0 mM MgCl-2, 100 mM NaCl и 1,0 мМ меркаптоэтанол, в течение 1 ч при 37^oC.

Клетки бактерий E.coli HB101, содержащие плазмидную ДНК pSI, выращивали в 200 мл бульона до титра 1000 млн. клеток/мл. Клетки осаждали центрифугированием (5000 g, 5мин, 4^oC) и ресуспендировали в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона Х100, 50 мМ ЭДТА pH 8,0 и 10 мМ Tris-HCl pH 8,0. Далее добавляли 2,5 мл свежеприготовленного раствора с концентрацией 10 мг/мл, быстро перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин. Полученный лизат центрифугировали (20000 g, 30 мин, 4^oC) и ДНК из супернатанта осаждали равным объемом изопропанола. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием (12000 g, 20 мин, 2^oC) и ресуспендировали в 5 мл 10 мМ Tris-HCl буфера, pН 8,0.

Синтез промежуточной плазмиды pN1 в прямой ориентации со встроенным линкером HindIII по сайту EcoRI полилинкера вектора проводили следующим образом: 10 мкл плазмиды pSI гидролизировали ферментом EcoRI в присутствии буфера "Н" фирмы "Boehringer mannheim" (ФРГ), состоящего из 50 мМ Tris-HCl с pH 7,5, 10 mM MgCI-2, 100 mM NaCl и 1,0 mM DTE, в течение 1 ч при 37^oC. Отжиг 20 мкл синтезированного линкера HindIII, представленного десятичлеником (CCAAGCTTGG), проводили на водяной бане при температуре 68^oC в течение 5 мин с дальнейшим остыванием в отключенной бане до комнатной температуры. Для лигирования полученных фрагментов гидролизированную EcoRI ферментом плазмиду pSI в течение 0,5 ч обрабатывали 0,5 мкл фрагмента Кленова и 5 мкл dNTP's при комнатной температуре. Сам процесс лигирования проводили по методике, приведенной выше. Лигированный материал трансформировали в компетентную культуру E. coli HB101. Выросшие на агарозной среде колонии в присутствии ампициллина засеяли в L-бульон с той же концентрацией антибиотика с дальнейшим выделением ДНК, как уже было описано.

Создание третьей промежуточной плазмиды pGdP проводили путем совместного гидролиза BamHI+HindIII плазмиды pN1 и вектора pUR 290 по тем же рестриктазам с сохранением рамки считывания и прямой ориентации гена gag.

Заключительная плазмида pGdN была получена при помощи совместного гидролиза pGdP ферментами NcoI+BamHI и дальнейшего лигирования смеси в присутствии фрагмента Кленова и dNTP's с сохранением рамки считывания клонированного гена и бета-галактозидазы. Полученную смесь использовали для трансформации. Здесь необходимо отметить, что все копии плазмиды pGdN, после их трансформации в бактериях E.coli, осуществляющие синтез гибридного белка с расчетной молекулярной массой 145 кДа являются идентичными и рассматриваются как заявляемый штамм после испытания рекомбинантного полипептада на способность специфически взаимодействовать с HTLV-1 позитивными сыворотками в иммуноблоте.

Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллин-устойчивых колоний, выросших через 18 ч при 37^oC, анализировали с помощью электрофореза. Были отобраны клоны, молекулярная масса которых была больше, чем у исходного вектора pUR 290.

Для выбора нужной плазмиды был приведен анализ способности выбранных плазмид синтезировать гибридные белки молекулярной массой 145 кДа, содержащие вирус-специфические последовательности области gag.

Пример 2. Анализ уровня синтеза гибридного белка, обладающего антигенными свойствами E.coli HB101/pGdN.

Анализ белков в лизатах клеток E.coli HB101, содержащих гибридную плазмиду pGdN, проводили следующим образом. Два мл суспензии клеток E.coli HB101, содержащих плазмиду pGdN, выросших в течение ночи из отдельной колонии до концентрации 2000 млн. клеток/мл в L-бульоне, содержащем ампициллин, осаждали центрифугированием (12000g, 1 мин) и ресуспендировали в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис HCl 7,8, 2,5% додецилсульфата натрия, 10% глицерина, 0,7% меркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. Полученные препараты кипятили 5 мин на водяной бане с последующим анализом методом электрофореза. В лизатах бактерий, содержащего плазмиду pGdN, обнаружен дополнительный белок с молекулярной массой 145 кДа (фиг.2, а). Антигенную активность белка с молекулярной массой 145 кДа анализировали с помощью метода иммуноблота (фиг.2, б). Полученный гибридный белок обладал антигенной активностью HTLV-1. Уровень синтеза гибридного белка составлял не менее 30% от тотального клеточного белка.

Изобретение позволяет получать с 1 л клеточной суспензии 400-500 мг белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-1. При этом 579 ак гибридного белка представлены следующим образом: 341 ак бета-галактозидазы, 2 ак кодируются полилинкерной последовательностью векторной плазмиды pUR 290, 234 ак представляют собой фрагмент гена gag HTLV-1 и 2 ак кодируются полилинкером pUR 290 (терминатор), что изображено на фиг.3.

Пример 3. Демонстрация возможности использования целевого продукта для создания диагностикума на HTLV-1.

Препараты белков, приготовленные по методике, изложенной в примере 2, разделяли методом электрофореза в ПААГ и анализировали методом иммуноблота с помощью сыворотки пациента, инфицированного HTLV-1. В препарате белков, полученных из клеток, содержащих гибридную плазмиду pGdN, выявляли дополнительные полосы белков, специфически реагирующих с антителами к HTLV-1. В препарате, использовавшемся в качестве контроля, приготовленном из клеток, содержащих исходный вектор pUR 290, такие полосы не идентифицированы.

Таким образом, плазмида pGdN детерминирует в клетках E.coli синтез белков, обладающих антигенными свойствами белков HTLV-1, поэтому данную плазмиду и штамм-продуцент можно использовать для создания диагностикумов на выявление антител к HTLV-1.

Использование: биотехнология, разработка диагностикумов для выявления вируса T-клеточного лейкоза человека первого типа (HTLV-1). Сущность: получение рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень продукции гибридного gag-белка NTLV-1, обладающего антигенными свойствами, и получение штамма-продуцента указанного белка. Плазмиду pGdN получают при соединении фрагмента плазмиды pUR 290, кодирующего бета-галактозидазу E.coli, два полилинкера, область начала репликации и ген устойчивости к ампициллину, с фрагментом плазмиды МТ2, содержащим последовательность gag-белка HTLV-I. Полученной плазмидой трансформируют клетки E.coli и отбирают штамм ГКВ/pGdN, продуцирующий гибридный белок, содержащий вирусоспецифические последовательности гена gag HTLV-1. При культивировании штамма ГКВ/pGdN из 1 л клеточной суспензии получают 400-500 мг белка, обладающего антигенными свойствами HTLV-1. 3 с.п. ф-лы, 3 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGdN размером 5,9 т.п.н. определяющая синтез гибридного белка, состоящего из 579 аминокислотных остатков (а.к.), обладающего антигенными свойствами вируса Т-клеточного лейкоза человека первого типа (HTLV-1), содержащая уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз BamHI, PstI, StuI, Tth, 111 II; генетический маркер, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; NcoI BamHI фрагмент плазмиды pUR 290 размером 5,2 т. п.н. кодирующий в том числе полноразмерную бета-галактозидазу Escherichia coli и участки полилинкерных областей; NcoI- SmaI фрагмент плазмиды pM Т2 размером 0,7 т.п.н. кодирующий последовательность gag белка HTLV-I размером 234 а.к. 2. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК pGdN размером 5,9 т.п. н. определяющей синтез гибридного белка, состоящего из 579 а.к. обладающего антигенными свойствами вируса Т-клеточного лейкоза человека первого типа (HTLV-I), заключающийся в том, что SmaI фрагмент плазмиды pEH gag I встраивают в вектор pUC8 по сайту SmaI с получением плазмиды pSI, в указанную плазмиду по сайту EcoRI встраивают Hind III-линкер; полученную плазмиду pNI и вектор pUR 290 совместно гидролизуют рестриктазами BamHI и Hind III, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточной плазмиды pGdP, в которой сохранена рамка считывания и прямая ориентация гена gag HTLV-I, далее с помощью рестриктаз NcoI и BamHI из указанной плазмиды pGdP вырезают фрагмент ДНК размером 0,7 т.п.н. заново лигируют при использовании фрагмента Кленова и дезоксинуклеотидтрифосфатов с сохранением рамки считывания клонируемого гена gag HTLV-I и бета-галактозидазы Escherichia coli и получают целевую рекомбинантную плазмидную ДНК pGdN. 3. Штамм бактерий Escherichia coli ГКВ/pGdN, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК PGdN, используемый для получения гибридного белка, состоящего из 579 а.к. обладающего антигенными свойствами вируса Т-клеточного лейкоза человека первого типа.