СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА Российский патент 2005 года по МПК A61K35/26 A23L1/305 A61P37/02 

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к способам получения пищевых добавок, и может быть использовано для профилактики иммунодефицитных состояний.

В настоящее время проблема регуляции и восстановления защитных функций организма при заболеваниях и воздействии дестабилизирующих факторов окружающей среды является одной из актуальных в физиологии и медицине. В последние годы наметилась тенденция к созданию и использованию лекарственных средств из сырья природного происхождения, в том числе и животного. Одним из перспективных и дешевых источников биологически активных веществ являются органы иммунной системы сельскохозяйственных животных (тимус, селезенка, костный мозг, лимфатические узлы), которые, следует отметить, относят к отходам основного производства.

Рядом исследований (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1982-1985; Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н. и другие, 1979-1996) установлено существование в организме человека и животных нового класса регуляторных пептидов - цитомединов. Последние представляют собой совокупность полипептидов с молекулярной массой до 10 кД, обладающих тканеспецифичностью и органотропностью, ответственных на передачу информации в популяции специализированных клеток. Экспериментальное и клиническое изучение биологической активности цитомединов показывает, что они обеспечивают восстановление утраченных функции тех органов и систем, из которых были получены (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1975-1985; Чипснс Г.И., 1984, Денисов А.Б., 1991 и др.). Первые подтверждения были получены с комплексами полипептидов, выделенных из центральных и периферических органов иммунной системы - тимуса, костного мозга, селезенки, лимфоузлов крупного рогатого скота, а также из сумки Фабрициуса птиц. Цитомедины из этих органов обладают иммуномодулирующим действием, одновременно способствуют нормализации неспецифической резистентности организма и системы гомеостаза. Быстрый ответ организма на введение пептидов, их высокая активность, отсутствие побочных эффектов все более привлекают внимание фармакологов и клиницистов к пептидам эндогенного происхождения - потенциальным лекарственным средствам нового класса.

Основным профилактическим мероприятием в развитии заболеваний является экзогенное поступление данных биорегуляторов, повышающих защитные функции организма, при алиментарном питании.

Проблема сохранения в течение достаточно длительного времени исходных свойств биологических материалов является чрезвычайно актуальной. Успешное практическое использование технологий консервирования «живых систем» методом сублимационного обезвоживания является наиболее прогрессивной. Поэтому в задачу изобретения входила разработка способов консервирования иммуномодулятора методом атмосферной сублимационной сушки, с последующим хранением без создания каких-либо особых температурных условий.

Из уровня техники известно использование в различных областях медицины иммунотропных препаратов, полученных из тимуса (Т-активин, тималин) и селезенки (спленин), производство которых требует значительных затрат времени, реактивов и использования дорогого оборудования (см. Авт. св. №997298, кл. А 61 К 37/24, 1979).

Известен способ получения иммуностимулятора для медицинских целей, обладающего иммуностимулирующим действием из лимфатических узлов животных путем их обработки ацетоном, замораживания, измельчения, экстрагирования 3%-ным раствором уксусной кислоты и хлористого цинка, центрифугирования и удаления надосадочной жидкости, удаления из осадка балластных веществ, добавление уксусной кислоты с последующей фильтрацией и лиофилизацией (см. Авт. св. SU №1187824 А, кл. А 61 К 35/30, 1985).

Известен способ получения средства, обладающего иммуностимулирующим действием, из красного костного мозга. Все приемы и операции аналогичны выше изложенному примеру (см. Патент РФ RU №1077089 С, кл. А 61 К 35/28, 1994).

Известен способ получения иммуностимулирующих факторов из тимуса серого кита, при котором солевой гомогенат тимуса серого кита центрифугируют на холоде, супсрнатант обрабатывают охлажденным ацетоном, ацетоновый порошок растворяют в фосфатном буфере с щелочным значением рН и подвергают гель-хроматографии на сефадексе G-25 (см. Авт. св. SU 1506668 А1, кл. А 61 К 35/26, 38/00, 1996).

Известен способ получения иммуномодулирующих пептидов из костного мозга млекопитающих, включающий гомогенизацию, экстракцию 3%-ной трихлоруксусной кислотой, 24-часовую инкубацию при -4°С, последующий диализ, высаливание сульфатом аммония, обработку надосадочной жидкости охлажденным ацетоном, осаждение протеинового комплекса в течение 24 часов с последующим его извлечением многократной экстракцией бидистиллятом и лиофилизацией (см. Авт. св. SU 1836954 А1, кл. А 61 К 35/28, 1990).

Однако известные способы являются сложными в исполнении и нецелесообразными для получения иммуностимулятора в виде пищевой добавки.

Известен способ получения иммуностимулятора в качестве пищевой добавки, в котором выделяют клетки костного мозга из костного мозга мелкого рогатого скота, промывают их и инкубируют в онкотическом растворе с концентрацией 0,85-0,90%, а затем центрифугируют надосадочную жидкость, которая является целевым продуктом. При выборе способов консервирования пищевой композиции рассматривали способы охлаждения и замораживания (см. патент RU 2120799 C1, A 61 K 35/28, 1998).

Данный способ является близким по назначению и использованию физиологических растворов, но неприемлемым для сохранения в течение длительного времени биологической ценности иммуномодулятора.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ получения иммуностимулирующих полипептидов из сырья животного происхождения, при котором тимус северного оленя гомогенизируют в растворе хлористого натрия, подвергают аутолизу, центрифугируют, нагревают надосадочную жидкость до 80°С, охлаждают, удаляют осадок, обрабатывают ацетоном, формируют преципитат, троекратно отмывают ацетоном, высушивают с последующим растворением в 0,01 М трис-HCl буфере, центрифугируют, проводят ультрафильтрацию, хроматографию на сефадексе с последующим сбором фракций, содержащих целевой продукт, лиофилизируют, подвергают гельфильтрации, повторно лиофилизируют (см. Авт. св. SU 1737798 А1, кл. А 61 К 38/00 // А 61 К 35/30, 1989).

Однако известный способ является трудоемким, т.к. требует значительных затрат времени и использования дорогого оборудования, а также использование ацетона, применение которого не позволяет использовать его на пищевые цели.

Таким образом, задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в получении иммуномодулятора как компонента пищевых продуктов. Технический результат, получаемый при осуществлении данного способа, - это упрощение технологического процесса, модификация способов консервирования, расширение ассортимента готовых продуктов функционального назначения.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения иммуностимулятора, включающем выделение полипептидов из сырья животного происхождения, гомогенизацию в растворе хлористого натрия, аутолиз, центрифугирование, нагрев надосадочной жидкости, охлаждение, удаление осадка, высушивание супернатанта, согласно изобретению в качестве сырья используют лимфатические узлы животных, при этом высушивание супернатанта осуществляют путем замораживания его и помещения в атмосферную сублимационную установку с последующим досушиванием с помощью ИК-сушки.

Отличительными признаками заявляемого способа являются использование в качестве сырья лимфатических узлов животных и новые приемы консервирования продукта, а именно путем замораживания и методом атмосферной сублимационной сушки.

Из уровня техники известно использование лимфатических узлов для получения иммуностимулятора (см. Авт. св. SU №1187824 А, кл. А 61 К 35/30, 1985), но он предназначен для медицинских целей, а сам способ является сложным, дорогостоящим, а предлагаемый способ получения иммуностимулятора из лимфатических узлов прост в исполнении, позволяет хранить готовый продукт без создания каких-либо особых температурных условий, с сохранением его биологической и пищевой ценности.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, идентичными всем существенным признакам заявляемого изобретения. Сравнение заявляемого способа с прототипом, наиболее близким по совокупности признаков аналога, позволило выявить совокупность существенных отличительных признаков, изложенных в формуле изобретения, к усматриваемому заявителем техническому результату.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям «новизна» и «изобретательский уровень».

Заявляемый способ получения иммуномодулятора осуществляется следующим образом:

1 кг лимфатических узлов очищают от соединительной ткани, гомогенизируют в 0,15 М NaCl в соотношении 1:3. Полученный гомогенат подвергают аутолизу при 4-6°С в течение 12-16 ч, центрифугированию при 4000 об/мин 10 мин. Затем супернатант нагревают при перемешивании на водяной бане до 80°С и выдерживают при этой температуре 10 мин. После охлаждения обильное количество денатурированных белков удаляют центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 8,9 мг/мл. Полученное средство (активная фракция лимфатических узлов - АФЛ) подвергают консервированию методом атмосферной сублимационной сушки, которая включает процессы заморозки, сублимирования и досушки. Предварительно средство разливают по 20 мл и замораживают в специальной камере (-10-12°С). Замороженный продукт помещают в атмосферную сублимационную установку на 30-32 часа при температуре -8-12°С. Чтобы определить степень сушки, определяют содержание влаги (содержание влаги не менее 10-12%). Сублимационный продукт требует досушивания до 4-5% содержания влаги, что является обязательным условием длительного хранения сухого продукта. Досушивание осуществляют с помощью ИК-сушки при температуре 30-45°С в течение 20 минут. Готовое средство - полипептиды лимфатических узлов - порошок желтовато-белого цвета.

Восстановление сублимированного средства: к высушенному средству добавляют 20 мл дистиллированной воды. Определяют количество белка по Лоури. Содержание его 8,7 мг/мл.

Заявляемый способ подтверждается следующими примерами конкретного выполнения:

Пример 1.

1 кг лимфатических узлов очищают от соединительной ткани, гомогенизируют в 0,15 М NaCl в соотношении 1:3. Полученный гомогенат подвергают аутолизу при 4-6°С в течение 14 ч, центрифугированию при 4000 об/мин 10 мин. Затем супернатант нагревают при перемешивании на водяной бане до 80°С и выдерживают при этой температуре 10 мин. После охлаждения обильное количество денатурированных белков удаляют центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 7,9 мг/мл. Средство разливают по 20 мл и замораживают в специальной камере (-12°С). Замороженный продукт помещают в атмосферную сублимационную установку на 32 часа при температуре -8°С. Досушивание осуществляют с помощью ИК-сушки при температуре 30°С в течение 20 минут. Готовое средство - полипептиды лимфатических узлов - порошок желтовато-белого цвета.

Восстановление сублимированного средства: к высушенному средству добавляют 20 мл дистиллированной воды. Определяют количество белка по Лоури. Содержание его 7,7 мг/мл.

Изучение биологической активности полипептидов, полученных предложенным способом, проводили на мышах обоего пола линии F1 (СВАхС57В1/6) со средней массой тела 20-22 грамма в реакциях фагоцитоза Staph. aureus перитонеальными макрофагами in vitro и in vivo по методике И.С.Фрейдлин [И.С.Фрейдлин. Использование культуры мышинных перитонеальных макрофагов в качестве моделей для изучения клеток мононуклеарной фагоцитарной системы организма и их применение под влиянием биологически активных веществ // Метод. рекоменд. - Л., 1976]. В реакциях фагоцитоза подсчитывали два показателя: активность (процент фагоцитирующих клеток от общего числа сосчитанных макрофагов) и интенсивность (среднее количество микроорганизмов, поглощенное одной клеткой). Подавление функций макрофагов моделировали введением классического иммунодепрессанта азатиоприна (в концентрации 500 мкг/мл в культуральную среду в опыте in vitro и перорально в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг веса - в опыте in vivo). Действие азатиоприна вызывало снижение как активности, так и интенсивности фагоцитоза в обоих опытах на 45% и 40%, соответственно. Полипептиды вводили в среду в опыте in vitro в концентрации 0,1 мг/мл и перорально в течение 7 дней в дозе 100 мкг/кг веса - в опыте in vivo.

Анализ полученных данных показал, что введение в данных опытах полипептидов, на фоне предварительного воздействия азатиоприном, достоверно превышало оба показателя и восстанавливало их до уровня интактной группы животных.

Согласно этим данным можно сделать вывод о стимулирующем действии полипептидов на фагоцитарную активность макрофагов как in vitro, так и in vivo.

Пример 2.

Лимфатические узлы очищают от соединительной ткани, гомогенизируют в 0,15 М NaCl в соотношении 1:3. Полученный гомогенат подвергают аутолизу при 4-6°С в течение 16 ч, центрифугированию при 4000 об/мин. 10 мин. Затем супернатант нагревают при перемешивании на водяной бане до 80°С и выдерживают при этой температуре 10 мин. После охлаждения обильное количество денатурированных белков удаляют центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 8,2 мг/мл. Средство разливают по 20 мл и замораживают в специальной камере (-12°С). Замороженный продукт помещают в атмосферную сублимационную установку на 30 часов при температуре -10°С. Досушивание осуществляют с помощью ИК-сушки при температуре 40°С в течение 15 минут. Готовое средство - полипептиды лимфатических узлов - порошок желтовато-белого цвета.

Восстановление сублимированного средства: к высушенному средству добавляют 20 мл дистиллированной воды. Определяют количество белка по Лоури. Содержание его 8,0 мг/мл.

Биологическую активность полипептидов, полученных предложенным способом, изучали на морских свинках-самцах массой 150-250 граммов в реакции "активного розеткообразования" тимоцитов с эритроцитами кролика, которую проводили по стандартной методике [Временная фармакопейная статья ВС 42-1571-85], изучали влияние полученного препарата на экспрессию рецепторов данных иммунокомпетентных клеток. Полипептиды вводили в концентрации, аналогичной первому примеру. Из анализа результатов следует, что количество розеткообразующих клеток (РОК) среди интактных тимоцитов составило 42%, а после обработки трипсином - 10%. Введение полипептидов в систему, содержащую обработанные трипсином тимоциты, восстанавливало количество РОК до 51%, что указывает на усиление полипептидами экспрессии рецепторов на поверхности тимоцитов морской свинки и ростостимулирующую активность полипептидов в отношении данных клеток.

В нашем эксперименте проводилось изучение морфофункционального состояния паховых лимфатических узлов мышей при воздействии азатиоприна и АФЛ. Необходимость изучения структурной организации соматических лимфатических узлов связана с выявлением реактивности периферических паховых лимфатических узлов, отдаленных от места введения иммунодепресанта азатиоприна и биорегулятора из лимфатических узлов.

Данные представлены в нижеследующих таблицах.

Таблица1
Плотность распределения клеток в структурных компонентах паховых лимфатических узлов мышей линии СВА в эксперименте на единице площади гистологического среза (880 мкм. кв.)ГРУППА ЖИВОТНЫХСТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫПаракортикальная зонаМантия лимфоидных узелковЦентры размножения узелковМякотные тяжиМозговые синусыКонтрольная41,6±2,0860,6±3,0343,8±2,1933,0±1,6518,8±0,94Азатиоприн47,6±2,38--31,8±1,5920,4±1,02Аз.+АФЛ-248,6±2,4362,2±3,1141,2±2,0651,8±2,5933,8±1,69Таблица 2
Клеточный состав структурных компонентов паховых лимфатических узлов мышей различных экспериментальных групп (%)КЛЕТКИГруппы животных СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫПаракортикальная зонаМантия лимфоидных узелковЦентры размноженияМякотные тяжиМозговые синусыРетикулярные19,2±0,468,9±0.4411,8±0,454,8±0,246,4±0,32212,6±0,630015,1±0,7515,7±0,78314,8±0,748,4±0,4213,6±0,6818,5±0,9320,2±1,01Бласты14,8±0,241,0±0,054,1±0,201,20±0,062,2±0,1120,40,02000032,1±0,11,9±0,093,4±0,171,2±0,061,2±0,06Лимфоциты (общее кол.)160,1±3,0076,5±3,8250,2±2,5135,2±1,7635,2±1,76252,5±2,620052,9±2,64229,4±1,47350,6±2,5376,3±3,8158,2±2,9139,8±1,9934,0±1,7Большие лимфоциты111,5±0,558,9±0,3715,5±1,345,5±0,982,2±0,1625,9±0,99005,1±0,632,1±0,12312,4±0,6113,2±0,6614,1±0,718,5±0,4213,0±0,65Плазмоциты10,9±0,0500,5±0,0319,4±0,97021,7±0,08001,9±0,08031,3±0,061,6±0,081,5±0,074,3±0,28,3±0,42Плазмобласты12,8±0,2103,6±0,2111,0±1,076,4±0,4823,4±0,28005,9±0,435,9±0,3432,5±0,120,9±0,061,9±0,0810,1±0,517,7±0,32Макрофаги12,8±0,142,7±0,148,7±0,446,7±0,3419,2±0,9626,7±0,33001,3±0,073,9±0,19310,3±0,523,5±0,175,4±0,2275,1±0,2510,6±0,53Деструкция118,7±0,9411,2±0,5621,0±1,0518,8±0,9428,7±1,44222,7±1,140022,0±1,1042,2±2,11318,5±0,937,4±0,3716,0±0,817,7±0,8818,4±0,92Примечание: 1 - интактная группа; 2 - азатиоприн; 3 - АФЛ

Как видно из таблиц 1 и 2, введение азатиоприна мышам привело к снижению плотности распределения клеток в различных структурных компонентах узла по сравнению с интактной группой животных: - в мантии лимфоидных узелков и в центрах размножения на 100%. Применение АФЛ в дозе 0,1 мг/кг а течение 8 дней после введения азатиоприна восстановило показатели до уровня интактных животных. Наряду с морфологическими изменениями органа, введение азатиоприна приводит к выраженным сдвигам в клеточном составе - отмечается нарушение процессов бласттрансформации и созревания лимфоидных клеток, в результате чего исчезают бластные формы клеток. В паракортикальной зоне сохраняются единичные бласты, но их число, относительно контроля, уменьшается в 10 раз. Действие азатиоприна приводит также к уменьшению числа антителопродуцирующих клеток. В эксперименте плазмоциты не выявлены в корковом веществе паховых лимфатических узлов, а также в лимфоидных узелках без центров размножения и в синусах лимфатических узлов. Усиливаются деструктивные процессы. Так, в просветах синусов число деструктивно измененных и разрушенных клеток увеличивается от 28% в контроле, до 42,25% после введения азатиоприна. При этом резко снижена макрофагальная реакция, число макрофагов в них в 5 раз меньше, чем в контроле. При введении АФЛ восстанавливается равновесие в популяции лимфоидных клеток до уровня контрольных значений или приближается к ним. В органе восстанавливаются центры размножения в лимфоидных узелках, повышается число молодых форм клеток, плазматических клеток. Снижается деструкция клеток.

Как известно, биологически активные пептиды тимуса, костного мозга, селезенки обладают иммуномодулирующими свойствами. Нами установлено, что АФЛ также восстанавливает показатели иммунного ответа.

Изучение влияния АФЛ на показатели клеточного (реакция «трансплантат против хозяина» - РТПХ, реакция гиперчувствительности замедленного типа - ГЗТ) и гуморального (определение количества антителобразующих клеток - АОК в селезенке) иммунного ответа проводились на мышах обоего пола линии СВА и F₁ (CBA×C57B1/6) массой 18-20 г. Состояние иммунодепрессии моделировали пероральным введением классического иммунодепрессанта - азатиоприна в дозе 50 мг/кг веса животного в течение 5 дней.

Таблица 3
Степень развития реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при воздействии АФЛ у мышей на фоне воздействия азатиоприна (М±m), n=10№ п/пГруппыДоза, мг/кгИндекс реакции (%), Р1.Интактные животные (контроль)046,7±3,42.Азатиоприн (Аз.)5032,2±1,4 p₁<0,013.АФЛ0,148,5±2,84.Аз. + АФЛ0,0144,7±2,7 р2<0,0015.Аз. + АФЛ0,146,4±2,9 р2<0,0016.Аз. + АФЛ137,3±1,5

Как видно из таблицы 2, угнетение реакции гиперчуствительности замедленного типа азатиоприном составило 31,05%. Применение АФЛ в дозе 0,1 мг/кг веса привело к полному восстановлению показателей до уровня контроля.

Таблица 4
Влияние АФЛ на количество антителобразующих клеток (АОК) селезенки мышей СВА при азатиоприновой иммунодепрессии (М±m), n=10№ п/пГруппыДоза мг/кгАбсолютное количество АОК в паренхиме селезенкиОтносительное количество АОК (на 10⁶ спленоцитов)1.Интактные животные 263161±191351688±1012.Азатиоприн50104011±7625*¹1046±74*¹3.АФЛ0,1332485±169352704±1054.Аз. + АФЛ0,1245999±21445*²1668±107*²5.Аз. + АФЛ0,01201136±16734*²1447±125**²6.Аз. + АФЛ1173012±13496*²1031±59*¹⁽²⁾ - достоверность р<0,001 относительно группы №1(2)
**² - достоверность р<0,02 относительно группы №2Таблица 5
Степень развития реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) при азатиоприновой иммунодепрессии и воздействии АФЛ(М±m), n=10№ п/пГруппыДоза, мг/кгИндекс увеличения лимфоузлов, Р1.Интактные животные02,7±0.22.Азатиоприн501.67±0,04 р₁<0,0013.АФЛ0,12,64±0,164.Аз. + АФЛ0,12,22±0,125.Аз. + АФЛ0,012,04±10.07 р₂<0,056.Аз. + АФЛ11,84±0,05 р₂<0,05p₁ - достоверно относительно контроля;
р₂ - достоверно относительно уровня супрессии (Аз.)

Результаты, представленные в таблицах 3, 4 и 5, свидетельствуют о том, что АФЛ восстанавливает показатели как клеточного звена иммунного ответа, так и гуморального при иммунодепрессии, вызванной азатиоприном.

По результатам исследований активности вещества, полученного предложенным способом, видно, что оно является стимулятором иммунной системы организма. Это в свою очередь позволяет рекомендовать полученный иммуномодулятор, как составной компонент пищевых продуктов при состояниях, сопровождающихся угнетением иммунной системы.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявляемого изобретения «способа получения иммуномодулятора», обладающего следующей совокупностью преимуществ по сравнению с прототипом: заявляемый способ позволяет получить полипептидный препарат, упростив технологический процесс, и расширить сырьевую базу для получения пищевого иммуномодулятора, используя дешевое местное сырье.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».

Изобретение относится к области пищевой промышленности, конкретно к получению пищевых добавок, и может быть использовано для профилактики иммунодефицитных состояний. Иммуномодулятор получают путем гомогенизации лимфатических узлов в растворе хлористого натрия, аутолиза, центрифугирования, нагревания надосадочной жидкости до 80°С, охлаждения, удаления осадка и высушивания супернатанта посредством замораживания и помещения в атмосферную сублимационную установку с последующим досушиванием с помощью ИК-сушки. Изобретение позволяет упростить технологический процесс получения иммуномодулятора и обеспечить сохранение биологической и пищевой ценности готового продукта без создания специального температурного режима. 5 табл.

Способ получения иммуномодулятора, включающий выделение полипептидов из сырья животного происхождения, гомогенизацию в растворе хлористого натрия, аутолиз, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости, охлаждение, удаление осадка, высушивание супернатанта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют лимфатические узлы животных, при этом высушивание супернатанта осуществляют путем замораживания его и помещения в атмосферную сублимационную установку с последующим досушиванием с помощью ИК-сушки.