СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ Российский патент 2000 года по МПК A61K35/26 

Описание патента на изобретение RU2149006C1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при получении гормональных веществ с выраженной биологической активностью в отношении иммунологических реакций.

Известен способ получения иммуностимулятора, когда в качестве сырья используются тимус теленка (см., например, Goldstein A., Guna A., Zatz M., Hardi M., White A., "Purification and biological activity of the timus gland", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1800, 1972).

Полученный известным способом иммуностимулятор не обладает достаточной биологической активностью и, кроме того, использование данного способа не обеспечивает получение максимального количества конечного продукта.

Известен способ получения иммуномодулятора, когда тимус теленка измельчают до кашицы, к ней добавляют апирогенную бидистиллированную воду и в проточном нагревателе осаждают высокомолекулярные составные части 10 мин при 80oC. Затем кашицу охлаждают и центрифугируют. К надосадку добавляют для непрерывной ультрафильтрации апирогенную воду. Ультрафильтрат подвергают электродиализу 2 ч при 30oC, напряжении 12 В, максимальной силе тока 40 А. Выход экстракта составляет 1,6-1,54% (SU 1442064, от 30.11.88). Однако полученный известным способом иммуномодулятор не позволяет получить вещество, в котором подфракции с иммуностимулирующим и ингибирующим действием были бы выделены раздельно.

Как показали проведенные авторами исследования, иммуностимулятор, полученный по известному способу, состоит из целого ряда полипептидных компонентов, обладающих иммуномодуляционными свойствами, например, в отношении популяции Т-лимфоцитов, то есть в его составе содержатся компоненты, проявляющие как иммуностимулирующие, так и ингибирующие свойства.

Заявленное изобретение направлено на повышение эффективности переработки за счет получения иммуномодуляторов с более высокой биологической активностью и обладающих свойствами как иммуностимуляторов, так и ингибиторов иммунных реакций.

Указанный результат достигается за счет того, что иммуномодулятор получают используя в качестве сырья вилочковую железу тюленя 10-15-дневного возраста, из которой подготавливают клеточную массу путем гомогенизации ее в физрастворе и обработки в ультратораксе с последующей полной дезинтеграцией оставшихся клеток ультразвуком, из полученного материала выделяют полипептиды путем последовательных операций центрифугирования, удаления осадка, нагрева надосадочной жидкости до 80oC, охлаждения с последующим центрифугированием, выдержки полученного супернатанта при минусовой температуре, смешивании его в соотношении 1:5 с охлажденным до минусовой температуры ацетоном с последующим центрифугированием и отделением осадка, растворения осадка при соотношении 1:9 - 1:10 в 10 мМ растворе фосфорнокислого натрия при pH 7,0 - 7,2, смешивания в соотношении 4:1 с насыщенным раствором сернокислого аммония с последующим центрифугированием, подкисления полученного супернатанта 10%-ным раствором уксусной кислоты до pH 4,0-4,2, смешивания в соотношении 1: 1 с 50% раствором сернокислого аммония с последующим центрифугированием, полного растворения полученного осадка в 10 мМ трис-HCl-буфере, при pH 8,0-8,2, лиофилизации, повторного растворения полученного материала в 10 мМ трис-HCl-буфере, пропускания раствора через хроматографическую колонку и лиофилизации, при этом при центрифугировании поддерживают температуру обрабатываемых материалов от 0 до -4oC, а полученный после последней лиофилизации материал вновь полностью растворяют в трис-HCl-буфере и пропускают через жидкостный хроматограф высокого давления, выделяя из получаемых подфракций компоненты с иммуностимулирующими и ингибирующими свойствами, после чего суммарные фракции раздельно лиофилизуют.

Сущность изобретения характеризуется совокупностью существенных признаков, представленных в формуле изобретения и иллюстрируется чертежами, где на фиг. 1 представлена динамика биологической активности отдельных подфракций в реакции спонтанного розеткообразования, на фиг. 2 - действие иммуномодулирующих фракций в реакции спонтанного розеткообразования.

Как следует из результатов тестовых испытаний, получаемая по предлагаемому способу иммуностимулирующая фракция обладает более высокой активностью, это объясняется тем, что в ее составе, в отличие от иммуностимулятора, полученного по известному способу, отсутствуют полипептидные компоненты, обладающие ингибирующими свойствами. При этом предлагаемый способ обеспечивает получение группы полипептидных компонентов, обладающих ингибирующими свойствами, использование которых необходимо при решении целого ряда задач, требующих снижения иммунных функций для экспериментальных целей и клинической практики.

При использовании иммуномодулятора, полученного по предлагаемому способу, при концентрации 0,001 мкг на мл инкубационной среды с лимфоцитами человека, наблюдалось увеличение Е-РОК до 83%, тогда как у иммуностимулятора, полученного по известному способу, значение Е-РОК не превышало 55%.

Пример. Очищенные от соединительной и эпителиальной тканей вилочковые железы тюленей 10-15-дневного возраста в количестве 1 кг пропускали через мясорубку и помещали на 15-20 мин в гомогенизатор. Гомогенизацию проводили в жидкой среде с добавлением физиологического раствора (0,15 М раствор NaCl) в соотношении 1: 4. Далее обработку гомогенной жидкости проводили в течение 10-15 мин на ультратораксе в режиме 20 тыс. об/мин. После этого добивались полной дезинтеграции клеток, подвергая субклеточные субстанции дальнейшему дроблению на ультразвуковой установке. Весь полученный материал центрифугировался на ультрацентрифуге (12000 g) в течение 1 ч при 0oC и после удаления осадка получали 1-ю фракцию.

Надосадочная жидкость, представляющая собой белковый экстракт, сливалась в колбу из термостабильного стекла и помещалась в водяную баню, температура в которой постепенно доводилась до 80oC, после чего содержимое колбы охлаждали до 0oC. Охлажденную смесь центрифугировали на ультрацентрифуге (45000 g) в течение 1 ч. Получаемый в результате супернатант, являющийся 2-й фракцией, подвергался выдержке в течение 1,5 ч при минус 4oC и смешивался с охлажденным до минус 40oC ацетоном в соотношении 1:5. Смесь центрифугировалась на ультрацентрифуге (19000 g) в течение 1 часа при 0oC. Полученный осадок является 3-ей фракцией.

Далее осадок растворяли 10 мМ раствором Na3PO4 (pH 7,0) в соотношении 1: 10, после тщательного перемешивания в раствор, в соотношении 4:1, добавлялся насыщенный раствор (NH4)2SO4. Далее раствор подвергался обычному центрифугированию (3500 об/мин) в течение 15 мин. После удаления осадка полученный супернатант подкислялся 10%-ным раствором CH3COOH до показаний pH 4,0, смешивался в соотношении 1:1 с 50%-ным раствором (NH4)2SO4 и вновь центрифугировался в течение 20 мин (3500 об/мин). Получаемый осадок растворялся примерно в 500 мл (до полного растворения) 10 мМ трис-HCl-буфера при pH 8,0 и лиофилизировался. Получаемое аморфное вещество светло-серого цвета является 4-й фракцией.

Далее высушенный материал растворялся в 50 мл трис-HCl-буфера и пропускался через хроматографическую колонку (Sephadex G-50), при помощи которой осуществлялся процесс обессоливания и получения необходимой фракции с содержанием белка не менее 2,0 мг/мл. Полученный материал подвергался лиофилизации, в результате чего получали 5-ю фракцию, представляющую собой аморфное вещество белого цвета.

Для раздельного получения иммуностимулирующих и ингибирующих подфракций, см. фиг. 1, полученное вещество вновь растворялось в 10 мМ трис-HCl-буфере и пропускалось через хроматографическую колонку (Lichrosorb RP-8) в градиенте метанола 5-55%. На основе предварительных испытаний в розеткообразующем тесте получаемые компоненты в соответствии с проявляемыми свойствами объединялись в суммарные фракции и отдельно лиофилизировались. Как видно из фиг. 1, иммуностимулирующая активность присуща лишь 13 компонентам, а ингибирующие компоненты составили более 1/3 общего количества.

Как показали исследования, наибольший выход вещества 5-й фракции, до 280 мг на 1 кг сырья, достигается в случае, когда при обработке материала на ультрацентрифугах его температура поддерживалась на уровне от 0 до -4oC.

На фиг. 2 показано действие высокоочищенного иммуномодулятора, полученного по предлагаемому способу, в сравнении с действием иммуностимулятора, полученного известным способом.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным за счет более высокой биологической активности иммуностимулирующей фракции при меньших концентрациях и получения фракции, обладающей ингибирующими свойствами, с учетом уменьшения потерь при получении 5-й фракции, обеспечивает более эффективную переработку исходного сырья.

Похожие патенты RU2149006C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА 2005
  • Исаев Вячеслав Арташесович
  • Хлюстов Владимир Николаевич
RU2295963C1
Способ получения тимозина 1981
  • Ермолин Геннадий Андреевич
  • Внуков Владислав Анатольевич
  • Седов Александр Михайлович
  • Саканделидзе Омар Григорьевич
  • Дрожжина Наталья Сергеевна
SU975017A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА 1998
  • Внуков В.А.
  • Гончарук А.В.
RU2125464C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОАКТИВНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ/ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ 2006
  • Арион Виталий Яковлевич
  • Ковалев Владимир Абрамович
  • Бреусов Юрий Николаевич
  • Оксененко Борис Геннадьевич
  • Москвина Светлана Николаевна
  • Зимина Ирина Васильевна
RU2327475C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА 1995
  • Марков И.И.
  • Макурина О.Н.
  • Марков А.И.
RU2116794C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ ТИМУСНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ГЕМОПОЭЗ 2005
  • Гафурова Наима Джамаловна
  • Хамидов Шухрат Асламович
  • Сарварддинов Ильдар Анварович
  • Масс Ольга Александровна
RU2320354C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КОЖИ СВИНЬИ 2001
  • Белова О.В.
  • Арион В.Я.
  • Зимина И.В.
  • Сысоева О.Б.
  • Луканидина Т.А.
RU2203070C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ИЗ КОЖИ СВИНЬИ, ВЛИЯЮЩЕГО НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА 1992
  • Арион В.Я.
  • Белова О.В.
  • Орлова В.Ф.
  • Капитанов А.Б.
  • Лопухин Ю.М.
RU2038087C1
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЙ ПРЕПАРАТ С ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ "НЕОФЕРОН" 1996
  • Зинченко Е.В.
  • Зинченко В.Б.
  • Шмелев В.А.
  • Черепанов П.А.
  • Панин А.Н.
  • Груздев К.Н.
RU2129878C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭПИДЕРМОИДНЫХ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ ЧЕЛОВЕКА А431 2011
  • Белова Ольга Владимировна
  • Сергиенко Валерий Иванович
  • Арион Виталий Яковлевич
  • Луканидина Татьяна Абрамовна
  • Зимина Ирина Васильевна
  • Москвина Светлана Николаевна
  • Борисенко Григорий Геннадиевич
RU2481113C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 149 006 C1

Реферат патента 2000 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при получении гормональных веществ с выраженной биологической активностью в отношении иммунологических реакций. Способ получения иммуномодулятора заключается в том, что вилочковую железу тюленя 10-15-дневного возраста гомогенизируют и обрабатывают в ультратораксе, затем ультразвуком центрифугируют, нагревают надосадочную жидкость до 80°С, охлаждают, центрифугируют, смешивают его в соотношении 1: 5 с охлажденным ацетоном, обрабатывают насыщенным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, растворяют осадок в трис-HCl-буфере, лиофилизируют, а полученный после лиофилизации материал растворяют в трис-HCl-буфере и пропускают через жидкостный хроматограф высокого давления, выделяя из получаемых подфракций компоненты с иммуностимулирующими и ингибирующими свойствами, после чего суммарные фракции раздельно лиофилизуют. Технический результат - повышение эффективности способа. 2 ил.

Формула изобретения RU 2 149 006 C1

Способ получения иммуномодулятора, заключающийся в том, что вилочковую железу тюленя 10 - 15-дневного возраста гомогенизуют в физиологическом растворе, обрабатывают в ультратораксе, затем ультразвуком, центрифугируют, осадок удаляют, надосадочную жидкость нагревают до 80oC, охлаждают, центрифугируют, выдерживают супернатант при минусовой температуре, смешивают его в соотношении 1 : 5 с охлажденным до минусовой температуры ацетоном, центрифугируют, осадок растворяют при соотношении 1 : 9 - 1 : 10 в 10 мМ растворе фосфорнокислого натрия при pH 7,0 - 7,2, смешивают в соотношении 4 : 1 с насыщенным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, супернатант подкисляют 10%-ным раствором уксусной кислоты до pH 4,0 - 4,2, смешивают в соотношении 1 : 1 с 50%-ным раствором сернокислого аммония, центрифугируют, осадок полностью растворяют в 10 мМ трис-HCl буфере, pH 8,0 - 8,2, лиофилизируют, повторно растворяют полученный материал в 10 мМ трис-HCl буфере, пропускают раствор через хроматографическую колонку, лиофилизируют, при центрифугировании поддерживают температуру от 0 до -4oC, лиофилизат полностью растворяют в трис-HCl-буфере и пропускают через жидкостный хроматограф высокого давления, выделяют фракции с иммуностимулирующими и ингибирующими свойствами, выделенные подфракции раздельно лиофилизируют.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2000 года RU2149006C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Способ получения экстракта, обладающего иммуномодулирующим действием, из животного сырья 1984
  • Роберт Оэртли
SU1442064A3
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЕ СРЕДСТВО, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННОЕ СРЕДСТВО, И СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРЕПАРАТА 1992
  • Николаенко А.Н.
  • Шорох Д.Б.
  • Шевченко А.А.
RU2041715C1
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ТИМУСА ДЛЯ УСИЛЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ 1995
  • Короткова М.Н.
  • Таранов В.А.
  • Арион В.Я.
  • Падюков Л.Н.
RU2112523C1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Способ получения полипептидов 1980
  • Морозов В.Г.
  • Хавинсон В.Х.
SU934589A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
Способ получения тимозина из тимусов млекопитающих 1984
  • Коротаев Геннадий Константинович
  • Тепелина Ольга Михайловна
  • Лившиц Вадим Аронович
  • Жеребова Татьяна Ивановна
  • Шпрунка Иева Карловна
  • Калнина Элеонора Александровна
  • Колкина Наталья Ивановна
  • Степка Арвид Янович
  • Саканделидзе Омар Григорьевич
  • Гиршович Евгений Семенович
  • Дрожжина Наталия Сергеевна
  • Ружицкий Александр Олегович
SU1255136A1
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков 1922
  • Асафов Н.И.
SU6A1
УСТРОЙСТВО ЗАЩИТНОГО КОЖУХА ДЛЯ КОРПУСА СНАРЯДА 2003
  • Беннетт Стефен Е.
  • Гесвендер Крис Е.
  • Гринвуд Кевин Р.
RU2315943C2
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов 1921
  • Ланговой С.П.
  • Рейзнек А.Р.
SU7A1
АВТОТРАНСПОРТНОЕ СРЕДСТВО 2012
  • Ван Ден Аккер Симон
RU2583982C2
Топка с несколькими решетками для твердого топлива 1918
  • Арбатский И.В.
SU8A1
СУДНО ДЛЯ СБОРА НЕФТИ С ПОВЕРХНОСТИ ВОДЫ 1997
  • Селезнев Николай Васильевич
RU2110436C1
Разборный с внутренней печью кипятильник 1922
  • Петухов Г.Г.
SU9A1
CH 632164 A, 30.09.82
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами 1921
  • Богач В.И.
SU10A1
Разчатая плотина 1948
  • Толмачев А.В.
SU80518A1

RU 2 149 006 C1

Авторы

Внуков В.А.

Гончарук А.В.

Даты

2000-05-20Публикация

1998-06-19Подача