СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ ТИМУСНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ГЕМОПОЭЗ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/26 A61P37/04 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу получения из тимуса полипептидов, стимулирующих гемопоэз, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности для получения лекарственных средств для лечения анемии.

Известны различные способы получения биологически активных полипептидов из тимусов млекопитающих, влияющих, в основном, на Т-клеточное звено иммунитета.

Известен способ получения полипептидов (Goldstein A.L., Guha A., Zatz M.M., Hardy M.A. & Wheit A. Purification and Biological Activity of Thymosin, a Hormone of the Thymus Gland // Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol.69, No.7, pp.1800-1803, July 1972.), который заключается в экстракции тимусов телят 0,15 М раствором хлорида натрия, отделении жмыха, нагревании супернатанта до 80°С, отделении термолабильных белков и осаждении ацетоном целевого продукта.

Полученный продукт, обозначенный как "фракция-3 тимозина", растворяют 0,1 М в натрий-фосфатном буфере, рН 7,2 и подвергают дробному осаждению сульфатом аммония при 25% и 50% насыщения.

Осадок белков, полученный при 50% насыщения соли, растворяют в буфере и переосаждают сульфатом аммония при 50% насыщении. Осадок растворяют в фосфатном буфере, раствор пропускают через миллипоровый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Порошок растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,2 и подвергают гелевой фильтрации через колонку с сефадексом Г-150. Выход активной фракции, обозначенный как "фракция-5 тимозина", составил 150 мг в расчете на 1 кг тимуса телят.

Фракцию-5 очищают далее с помощью колоночной хроматографии на Эктеола-целлюлозе, уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2 в градиенте концентрации хлорида натрия от 0 до 1 М. Активную фракцию (фракцию-6 тимозина, 60 мг) диализуют против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 6,5 пропускают через колонку с гидроксилапатитом в этом же буфере. Сорбированные пептиды элюируют с помощью ступенчатого градиента концентрации фосфата натрия, рН 6,5: 0,01 М → 0,05 М → 0,1 М → 0,15 М → 0,2 М в виде трех пиков.

Выход второго пика, содержащего активную фракцию (фракция-7 тимозина), составляет 20 мг с 1 кг сырья. Фракция-7 проявлялась при электрофорезе в полиакриламидном геле при рН 8,6 и 3,1 в виде одной полосы пептидов с молекулярной массой около 13000 Да. Биологическая активность фракции-7 проявлялась в дозе 0,12 мкг в тесте спонтанных розеток.

Недостатком данного способа является большое число стадий очистки, низкий выход фракции-5 тимозина и продуктов дальнейшей очистки этой фракции. Пептиды, влияющие на гемопоэз, были, по-видимому, утеряны в процессе очистки.

Известен способ получения тимозина (А.с. СССР 975017, МКИ А61K 35/56. Опублик. 23.11.82, Бюл. №43 - 3 с.), в основе которого лежит та же последовательность приемов, что и в предыдущем способе.

Но для упрощения технологии и увеличения выхода опущены стадии переосаждения сульфатом аммония при 50% насыщении, пропускания через миллипоровый фильтр, диализа против воды. Способ выполняется следующим образом.

Тимус каспийского тюленя измельчают, гомогенизируют и экстрагируют 0,15 М раствором хлорида натрия, отделяют жмых и нагревают супернатант до 80°С для отделения термолабильных белков. Из раствора ацетоном осаждают сырец, который далее растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0 и добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 25% насыщения. Осадок отделяют и отбрасывают, раствор подкисляют 10%-ным раствором уксусной кислоты до рН 4,0 и добавляют 50% раствор сульфата аммония. Выпавший осадок растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 8,0 и пропускают через хроматографическую колонку с сефадексом Г-50. Полученную фракцию-5 тимозина с молекулярной массой 12200 Да лиофилизируют. Выход фракции-5 составляет 250 мг с 1 кг тимуса.

Препарат в дозе 15 мкг на мышь обеспечивал 100%-ную выживаемость животных, зараженных Salmonella Nephimurium. Сходную активность проявляла фракция-5 тимозина, выделенная по способу предложенному Гольдштейном, однако выживаемость животных составляла в дозе 15 мкг на мышь всего 60%.

Недостатком вышеописанного способа является низкий выход Фракции-5, хотя она и выше в 2 раза, чем в базовом методе, и низкая биологическая активность. Описанный способ не позволил обнаружить фракции, влияющие на гемопоэз.

Известен также способ получения тимозина из тимусов млекопитающих (А.с. 1255136, МКИ А61K 35/26, 35/00, опублик. 07.09.86, Бюл. 33 - 2 с.), в котором путем подбора режима гомогенизации ткани тимуса млекопитающих и упрощения процесса очистки ацетонового порошка удалось увеличить выход фракции-5 тимозина до 1,4 г с 1 кг тимуса, что в 5-6 раз превышает выход по предыдущему аналогу.

Для этого тимус млекопитающих (телят, овец или тюленей) размельчают, гомогенизируют в 0,15 М растворе хлорида натрия, отделяют частицы ткани, нагревают до 80°С, отделяют термолабильные белки, раствор обрабатывают охлажденным ацетоном. Выпавший осадок подсушивают ацетоном, полученный порошок растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0 и добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 25% насыщения (3 части раствора и 1 часть насыщенного раствора сульфата аммония). Выпавший осадок отделяют и отбрасывают, а к супернатанту добавляют 10% раствор уксусной кислоты до рН 4,0-4.5, затем - кристалический сульфат аммония из расчета 14,6 г соли на каждые 100 мл раствора,

Влажный осадок растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере рН 8,0 и подвергают гелевой фильтрации на колонке с Сефадексом Г-25, уравновешенным 0,05 М раствором бикарбоната аммония, рН 8,0. Выход фракции-5 тимозина составляет 1,2-1,4 г с 1 кг тимуса в зависимости от вида животных.

Биологическая активность проявлялась в дозе 10^-2 и 10^-4 мкг на мышь и восстанавливала количество ядросодержащих клеток тимуса у старых животных до уровня ядросодержащих клеток зрелых животных через 48 часов после инъекции. Данный метод позволил получить максимальный выход фракции-5 по сравнению с предыдущими методами.

Недостатком способа является недостаточная степень очистки фракции-5, которая, как известно, состоит примерно из 30 различных пептидов с молекулярной массой 1000-1500 Да.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения иммуноактивного вещества из вилочковых желез млекопитающих (А.с. 1392680, МКИ А61K 35/26, 37/24. от 24.03.86; опублик. 07.09.86.).

Согласно этому способу вилочковую железу млекопитающих (телят, овец, тюленей) измельчают и гомогенизируют в 0,15 м растворе хлорида натрия и перемешивают в течение 1 часа при температуре 8-10°С. Жмых отделяют центрифугированием, а супернатант нагревают до 80°С для осаждения термолабильных белков. Их отделяют центрифугированием, полученный супернатант фильтруют через асбестоцеллюлозную пластину и смешивают с 5 объемами охлажденного ацетона. Через 12-16 часов надосадочный раствор сифонируют. Осадок высушивают на воронке Бюхнера, промывая ацетоном. Выход сырца составляет 18 г с 1 кг сырья.

Сырец (фракция-3 тимозина) растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0, центрифугируют и к супернатанту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония из расчета 3 объема супернатанта на 1 объем насыщенного раствора соли, в котором предварительно установили рН 7,0 с помощью водного раствора аммиака. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, в супернатанте устанавливают рН 4,0-4,05 с помощью 10% раствора уксусной кислоты. В полученный раствор добавляют кристаллический сульфат аммония из расчета 14,6 г сульфата аммония на каждые 100 мл раствора. Полученный осадок отделяют центрифугированием.

Влажный осадок растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере с рН 8,0, нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием и отбрасывают. Раствор наносят на колонку с сефадексом G-25 и элюируют 0,05 М раствором бикарбоната аммония, рН 8,0. Фракции, соответствующие первому белковому пику, объединяют и подвергают ионообменной хроматографии на колонке с карбоксиметил-целлюлозой в 0,025 М натрий-ацетатном буфере с рН 3,4-4,2. Проходящий раствор и раствор после промывки исходным буфером объединяют и смешивают с 10 объемами ацетона. Выпавший осадок собирают и сушат ацетоном.

Полученный осадок подвергают гелевой хроматографии на колонке с сефадексом G-50 в 0,05 М растворе бикарбоната аммония, рН 8,0.

Материал второго белкового пика объединяют и лиофилизируют. Получают иммуноактивное непирогенное вещество (фракция-7 тимозина) с выходом 100 мг на 1 кг тимусов.

Биологическую активность изучали в тесте восстановления числа ядросодержащих клеток (ЯСК) тимуса при возрастном иммунодефиците. Биологическая активность проявлялась в дозе 0,5×10^-4 мкг на 1 кг массы животных (т.е. 10^-6 мкг на мышь) и приводила к восстановлению ЯСК тимуса старых мышей до уровня ЯСК зрелых животных на вторые сутки после инъекции вещества.

Способ позволил получить максимально известное количество фракции-7 тимозина с высокой биологической активностью. Продукт является апирогенным, стабильным при хранении.

На его основе создано лекарственное средство "Тимоптин для инъекций", считающийся "золотым стандартом" среди иммуномодуляторов.

Недостатком прототипа является то, что в процессе очистки также были утеряны пептиды, активные в отношении гемопоэза.

Технической задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание такого способа получения иммуностимулирующих тимусных полипептидов, с помощью которого возможно выделять полипептиды с более высокой биологической активностью, стимулирующие гемопоэз, и использовать их для получения лекарственных средств для лечения анемии.

Для решения поставленной задачи в способе получения полипептидов из тимуса, включающем гомогенизацию сырья, экстракцию его раствором хлористого натрия, осаждение частиц ткани центрифугированием, удаление из супернатанта термолабильных белков при нагревании, осаждение целевого продукта ацетоном, очистку путем солевого фракционирования сульфатом аммония, гелевой и ионообменной хроматографии, согласно изобретению для выделения пептидов, усиливающих гемопоэз, солевое фракционирование проводят путем однократного добавления в раствор кристаллического сульфата аммония до концентрации 23-28,6% при рН 4.0, ионообменную хроматографию проводят на карбоксиметил сефадексе С-25, элюируют полипептиды с помощью линейного градиента концентрации и рН натрий-ацетатного буфера от 0,01 М, рН 4.0-5.0 до 2 М, рН 7.0, лиофилизируют полученные полипептиды и обессоливают на колонке с сефадексом Г-25.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Тимусы молодняка крупного рогатого скота, овец и тюленей размельчают на мясорубке и гомогенизируют в 0,15 М растворе хлорида натрия. Гомогенат перемешивают и по окончании экстракции жмых отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость нагревают до 80°С. Полученную суспензию охлаждают, осадок термолабильных белков отделяют центрифугированием, а супернатант фильтруют через асбестоцеллюлозную пластину. Прозрачный раствор смешивают с охлажденным ацетоном в соотношении 1:5. Выпавший осадок отделяют на воронке Бюхнера, промывают ацетоном и высушивают на воздухе. Полученный порошок растворяют при перемешивании в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0 в соотношении 1:10, отделяют нерастворившуюся часть центрифугированием, а к супернатанту добавляют уксусную кислоту для снижения рН до 4,0. К полученной суспензии добавляют кристаллический сульфат аммония до концентрации 23%-28%. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и растворяют его в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 8,0. Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием, а раствор наносят на колонку с сефадексом Г-25 и элюируют 0,05 М раствором бикарбоната аммония, рН 8.0, измеряя оптическую плотность фракций элюата при 276 нм. Фракции, соответствующие на денситограмме первому белковому пику, объединяют и лиофилизируют. Полученный порошок растворяют в 0,01 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,0-5.0, нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием, а прозрачный раствор вносят в колонку с ионообменником - карбоксиметилсефадексом С-25, уравновешенным 0,01 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,0-5,0. Собирают проходящий раствор и элюируют пептиды, используя линейный градиент концентрации и рН натрий-ацетатного буфера от 0,01 М, рН 4,0-5,0 до 2 М, рН 7,0. Измеряют оптическую плотность фракций элюата при 276 нм. Затем фракции, соответствующие на денситограмме второму белковому пику, объединяют и лиофилизируют. Порошок растворяют в 0,05 М растворе бикарбоната аммония, рН 8,0 и обессоливают на колонке с сефадексом Г-25.

Далее приводятся конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1. 1 кг слегка размороженных тимусов телят размельчают в мясорубке и гомогенизируют небольшими порциями, добавляя 0,15 М раствор хлорида натрия. Каждую партию гомогенизируют по 3 минуты. Всего взято 3 л 0,15 М раствора хлорида натрия. Все порции объединяют и перемешивают в течение 1 часа на лабораторной мешалке. Смесь центрифугируют в течение 30 минут при 3000 об/мин, жмых отбрасывают, а супернатант переносят в круглодонную колбу из термостойкого стекла и нагревают на водяной кипящей бане до 80°С в течение 20 минут. Суспензию охлаждают до комнатной температуры и отделяют термолабильные белки центрифугированием (30 минут, 3000 об/мин, 6-8°С) и отбрасывают.

Супернатант фильтруют через асбестоцеллюлозную пластину и полученный прозрачный раствор при перемешивании вливают в 5 объемов ацетона, охлажденного до -10°С. Смесь оставляют в холодильнике до (t=6-8°С) на ночь, на 16-18 часов для формирования осадка. Наутро жидкость сифонируют, осадок переносят на воронку Бюхнера и промывают несколькими порциями охлажденного ацетона. Далее осадок досушивают на воздухе для удаления следов ацетона. Выход сырца составляет 12 г.

Солевое фракционирование. 12 г сырца растворяют в 120 мл 0,01 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,0 на магнитной мешалке в течение 30 минут. Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием (30 минут, 3000 об/мин, 6-8°С), и к супернатанту по каплям добавляют ледяную уксусную кислоту для снижения рН до 4,0. К полученной суспензии добавляют кристаллический сульфат аммония из расчета 35 г на каждые 100 мл раствора (получается 26% раствор соли). Перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 минут и оставляют на ночь в холодильнике. Затем осадок отделяют центрифугированием (20 мин, 3000 об/мин, 6-8°С) и подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии.

Гелевая фильтрация на сефадексе Г-25. Влажный осадок растворяют в 100 мл 0,01 М трис-HCl буфера, рН 8,0. Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием (20 мин, 3000 об/мин, 6-8°С) и отбрасывают. Прозрачный раствор вносят в колонку (4×130 см) с сефадексом Г-25, уравновешенным 0,05 М раствором бикарбоната аммония, рН 8,0. Элюируют со скоростью 100 мл/час этим же буфером и измеряют оптическую фракцию элюата при 276 нм. Фракции, соответствующие первому белковому пику, объединяют и лиофилизируют. Выход порошка составляет 1 г.

Ионообменная хроматография. 1 г порошка растворяют в 20 мл 0,01 М натрий-ацетатного буфера, рН 4,5 на магнитной мешалке в течение 30 минут. Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием (20 мин, 3000 об/мин, 6-8°С), прозрачный раствор вносят в колонку (2,4×26 см) с карбоксиметилсефадексом С-25, уравновешивают 0,01 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,5 (15 мл/час, объем фракций 5 мл). Собирают проходящий раствор и элюируют сначала 0,01 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,5, затем, после выхода несорбированных полипептидов, элюируют, используя линейный градиент концентрации и рН натрий-ацетатного буфера от 0,01 М, рН 4.5 до 2 М, рН 7.0 (общий объем 800 мл). Измеряют оптическую плотность фракции элюата при 276 нм. Фракции элюата, содержащие несорбированные полипептиды, объединяют с проходящим раствором, лиофилизируют и обозначают как "фракция А". Фракции полипептидов, соответствующие на денситограмме второму белковому пику, объединяют, лиофилизируют и обозначают как "фракция Б".

Обессоливание на колонке с сефадексом Г-25.

Фракцию В растворяют в дистиллированной воде и вносят в колонку (2×130 см) с сефадексом Г-25 с дистиллированной водой. Элюируют дистиллированной водой со скоростью 15 мл/час, объем фракций 5 мл. Измеряют поглощение в ультрафиолете при 276 нм. Материал пика с Rf 0,5 объединяют и лиофилизируют. Выход порошка гемостимулятора - 50 мг.

Определение биологической активности.

Изучение биологической активности гемостимулирующего препарата включало три серии опытов на крысах: на интактных животных, на модели острой постгеморрагической анемии и на модели гемолитической анемии.

Результаты исследований на интактных крысах при однократном внутримышечном введении представлены в таблицах 1-7. Исследовались дозы препарата от 10^-8 мкг до 10 мкг на 1 кг массы животного.

Количество гемоглобина в 1-3 сутки возрастало с 13,5 г/дл до 14,5-16,0 г/дл, при этом среднесуточный прирост составил 2,47-14,81%.

Повышенный уровень гемоглобина сохранялся в течение 14-30 и более дней.

Количество эритроцитов возрастает в течение 1-3 дней с 4,8*10¹²/л до (7,1-9,3)*10¹²/л, а среднесуточный прирост составил 15,97-93,75%%.

Количество ретикулоцитов по отношению к контролю возрастает в 1,5-3 раза, что свидетельствует о влиянии препарата на эритропоэз.

Стимулирующее влияние на количество гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов проявлялось во всех исследованных дозах. В дозах 10^-10 и 10^-12 мкг/кг массы животного наблюдалось снижение эффекта препарата (эти данные в таблицах не приведены).

В таблицах 8-14 показано влияние гемостимулятора на модели геморрагической анемии, вызванной кровопусканием 1/3 общего объема крови через капилляр, вставленный в конъюнктивальный мешок глаза крыс. Препарат гемостимулятора вводили через день в течение 14 дней (7 инъекций). При всех исследованных дозах 10^-2, 10^-4, 10^-6 и 10^-8 мкг/кг массы тела показатели по гемоглобину нормализовались к 7 суткам, тогда как в контроле (табл.8, группа 1) гемоглобин восстановился к 30 суткам. Количество эритроцитов достигает нормы на 3-е сутки, а в контроле - на 21 сутки. Проведено сравнение влияния гемостимулятора и антианемического препарата "Тардиферон", содержащего в своем составе сульфат железа (табл.13 и 14). Как видно из таблиц, при лечении гемостимулятором среднесуточный прирост гемоглобина составляет 9,29-9,86 г/л, что более чем в четыре раза выше, чем в контроле (2,17 г/л), и в два раза выше, чем для "Тардиферона" (4,79 г/л).

В таблицах 15-20 показан лечебный эффект на модели экспериментальной гемолитической анемии, вызванной соляно-кислым фенилгидразином. Гемостимулятор вводили внутримышечно через день в течение 14 дней (7 инъекций) в дозах 10^-2, 10^-4, 10^-6 и 10^-8 мкг/кг массы животного. Как видно из таблиц, уровень гемоглобина восстановился на 14 сутки, а содержание эритроцитов - на 7 сутки. В контрольной группе (таблица 15) гемоглобин и эритроциты восстановились к 40 и 30 дню соответственно. Среднесуточный прирост гемоглобина составил 3,78-3,93 г/л, а в контроле - 1,25 г/л. Среднесуточный прирост эритроцитов составил 15-19%, а в контроле - 4,29%.

Тардиферон, вводимый ежедневно внутрижелудочно (14 введений) в дозе 7,2 мг/кг, нормализовал уровень гемоглобина на 21 день, а количество эритроцитов - на 14 день. Среднесуточные приросты гемоглобина и эритроцитов были в 1,5 и 2 раза ниже, чем при лечении гемостимулятором. Следует отметить, что нами на моделях анемии исследованы также дозы в 10^-10 и 10^-12 мкг/кг массы тела. Показатели прироста гемоглобина и эритроцитов в этом случае гораздо ниже, хотя и были выше, чем в контроле.

Обессоливание фракции А.

Из фракции А, содержащей иммуностимулятор, после обессоливания на колонке с сефадексом Г-25 получают иммуностимулятор (фракция-7 тимозина) с выходом 200 мг.

Биологическую активность иммуностимулятора изучали на мышах с возрастной инволюцией тимуса и оценивали по увеличению числа ядросодержащих (ЯСК) клеток тимуса.

Иммуноактивное вещество восстанавливало число ЯСК тимуса старых мышей в дозе 10^-6 мкг на мышь (5×10^-4 мкг на 1 кг массы тела) до уровня ЯСК зрелых животных через 48 часов после инъекции. Количество ЯСК при этом увеличивалось в 2-4 раза по сравнению с контролем (как в прототипе).

Выделенные по предлагаемому способу гемостимулирующее и иммуностимулирующее вещества являются не пирогенными, т.к. повышают температуру кроликов на 0,2°С.

Пример 2. Аналогично примеру 1. Кристалический сульфат аммония добавляют из расчета 30 г на каждые 100 мл раствора (получается 23,1% раствор соли). Выход гемостимулирующего вещества 40 мг, иммуноактивного вещества - 180 мг.

Пример 3. Аналогично примеру 1. Кристалический сульфат аммония добавляют из расчета 40 г на каждые 100 мл раствора (получается 28,6% раствор соли). Выход гемостимулирующего вещества 45 мг, иммуноактивного вещества - 170 мг.

Пример 4. Аналогично примеру 1. Ионообменную хроматографию на карбоксиметил сефадексе С-25 проводят в 0,01 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,0. Выход гемостимулирующего вещества 42 мг, иммуноактивного вещества - 180 мг.

Пример 5. Аналогично примеру 1. Ионообменную хроматографию на карбоксиметил сефадексе С-25 проводят в 0,01 М натрий ацетатном буфере, рН 5,0. Выход гемостимулирующего вещества 45 мг, иммуноактивного вещества - 200 мг,.

Пример 6. Аналогично примеру 1. Гемостимулирующее вещество и иммуноактивное вещество получают из свежезамороженных вилочковых желез ягнят. Выход гемостимулирующего вещества 60 мг из 1 кг желез, иммуноактивного вещества - 250 мг.

Пример 7. Аналогично примеру 1. Гемостимулирующее вещество и иммуноактивное вещество получают из свежезамороженных вилочковых желез тюленей. Выход гемостимулирующего вещества 40 мг из 1 кг желез, иммуноактивного вещества - 170 мг.

Положительный эффект заключается в следующем.

1. Предлагаемый способ позволяет получить фракцию пептидов, обладающую высокой гемостимулирующей активностью, проявляющуюся в дозах 10^-8 мкг/кг массы животных.

2. Наряду с гемостимулятором, способ позволяет выделить иммуностимулирующие пептиды с такой же биологической активностью, как в прототипе, но с выходом в два раза более высоким.

3. Комплексная технология обеспечивает более эффективную переработку исходного сырья - тимусов млекопитающих.

Таблица 1
Динамика изменения показателей периферической крови крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятора в дозе 10 мкг/ кг интактным животным (М±m; n=10). Группа 1.ПоказателиВремя исследования с момента введения препарата, сутки Исход1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,314,3±0,414,7±0,615,3±0,615,3±0,515,0±0,614,3±4,014,8±0,515,0±0,5Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,39,3±0,57,2±0,46,3±0,59,3±0,49,1±0,48,7±0,66,5±0,86,3±0,4Гематокрит, %47±2,056±2,558±2,653±2,062±2,960±2,058±2,356±2,552±2,0MCV, мкм³986081846766678683МСН, пг281520241616162324МСНС, г/дл292625292525252629Ретикулоциты, %4,5±0,38,2±0,515,4±0,85,7±0,310,0±0,46,0±0,36,3±0,45,5±0,44,6±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±20850±20785±16950±22620±18770±161050±18690±18700±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,013,0±1,213,0±1,11,8±0,313,0±1,112,0±1,012,6±1,212,8±1,312,0±1,0Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 2
Динамика изменения показателей периферической крови крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятора в дозе 1 мкг/ кг интактным животным (M±m; n=10). Группа 2.ПоказателиВремя исследования с момента введения препарата, сутки Исход1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,314,0±0,416,0±0,714,5±0,514,5±0,514,2±0,413,9±0,414,5±0,4140±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,38,3±0,57,1±0,45,3±0,58,5±0,48,2±0,79,4±0,66,5±0,85,0±0,4Гематокрит, %47±2,056±2,558±2,654±2,062±2,954±2,058+2,356±2,550±2,0MCV, мкм³98678210273666186100МСН, пг281723271717152228МСНС, г/дл292528272326242628Ретикулоциты, %4,5±0,37,4+0,59,3±0,86,5±0,37,5±0,46,0±0,35,5±0,35,5±0,43,8±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620+20840±20800±16700±16800±18820±16950±26775±18700±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,013,0±1,213,0±1,11,8±0,313,0±1,112,0±1,012,6±1,212,8±1,312,0±1,0Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 3
Динамика изменения показателей периферической крови крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятора
в дозе 10^-2 мкг/ кг интактным животным (М±m; n=10). Группа 3ПоказателиВремя исследования с момента введения препарата, сутки Исход1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,314,8±0,415,7±0,714,7±0,514,7±0,413,9±0,313,8±4,014,8±0,4150±5,2Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,38,9±0,68,3±0,46,9±0,57,7±0,46,0±0,48,0±0,67,5±0,57,0±0,5Гематокрит, %47±2,056±2,558±2,654±2,056±2,954±2,056+2,356±2,552±2,0MCV, мкм³986370787390707574МСН, пг281719211923172021МСНС, г/дл292627272626252629Ретикулоциты, %4,5±0,37,4±0,45,3±0,36,4±0,38,2±0,65,2±0,47,3±0,45,5±0,45,0±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±201000±30850±16800+20600±14600±16700±18690±18600±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,013,0±1,213,0±1,11,8±0,313,0±1,112,0±1,012,6+1,212,8±1,312,0±1,0Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 4
Динамика изменения показателей периферической крови крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятора
в дозе 10^-4 мкг/кг интактным животным (М±m; n=10). Группа 4.ПоказателиВремя исследования с момента введения препарата, сутки Исход1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,315,5±0,514,5±0,514,7±0,514,2±0,414,5±0,413,5±0,315,8±0,415,0±5,2Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,38,0±0,57,5+0,46,4±0,58,3±0,56,8±0,47,7±0,56,0±0,86,3±0,4Гематокрит, %47±2,054±2,556±2,654±2,060±2,956±2,055±2,353±2,552±2,0MCV, мкм³986875847282718883МСН, пг281919231721182624МСНС, г/дл292926272426253029Ретикулоциты, %4,5±0,37,4±0,510,6±0,87,1±0,46,7±0,48,3±0,36,0±0,45,5±0,44,4±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±201000±30900±26750±16628±14675±141000±18900±28700±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,013,0±1,213,0±1,11,8±0,313,0±1,112,0±1,012,6±1,212,8±1,312,0±1,0Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 5
Динамика изменения показателей периферической крови крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятора
в дозе 10^-6 мкг/ кг интактным животным (М±m; n=10). Группа 5.ПоказателиВремя исследования с начала введения препарата, сутки Исход1371421304060Гемоглобин, г/дл135±0,313,5±0,414,5±0,414,3±0,315,2±0,514,5±0,615,0±0,414,6±0,514,0±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,35,4±0,37,1±0,46,6±0,510,5±0,86,5±0,47,6±0,656,0±0,45,3±0,4Гематокрит, %47±2,050±2,554±2,654±2,064±2,954±2,056±2,354±2,552±2,0MCV, мкм³989376826183749098МСН, пг282520221422202426МСНС, г/дл292727262427272727Ретикулоциты, %4,5±0,335,2±1,517,8±0,88,8±0,610,0±0,48,7±0,66,0±0,45,5±0,34,6±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±20900±28800±16700±16700±16700±16850±18800±18700±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,013,2±1,213,6±1,12,8±1,313,0±1,112,0±1,012,6±1,211,8±1,012,0±1,0Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 6
Динамика изменения показателей периферической крови крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятора
в дозе 10^-8 мкг/ кг интактным животным (М±m; n=10). Группа 6. Время исследования с момента введения препарата, сутки Исход1371421304060Гемоглобин, г/дл135±0,314,5±0,414,5±0,616,0±0,615,3±0,514,0±0,613,5±4,014,5±0,414,0±5,2Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,38,7±0,67,0±0,410,5±0,57,3±0,58,8±0,68,7±0,66,5±0,56,0±0,4Гематокрит, %47±2,056±2,558±2,664±2,061±2,958±2,058±2,356±2,552±2,0MCV, мкм³986483618466678687МСН, пг281721152116162223МСНС, г/дл292625252524232627Ретикулоциты, %4,5±0,324,5±1,518,3±1,417,0±1,09,2±0,67,7±0,56,7±0,45,5±0,44,9±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±20900±261470±36650±14900±18750±16 1900±28800±18700±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,013,0±1,213,0±1,111,8±0,313,0±1,112,0±1,012,6±1,212,8±1,312,0±1,0Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 7
Среднесуточный прирост количества гемоглобина и числа эритроцитов у интактных крыс при однократном внутримышечном введении гемостимулятораДозы препарата, мкг/кгГемоглобинЭритроцитыСутки *Гемоглобин, г/лСреднесуточный ** прирост гемоглобинаСутки *Эритроциты, 10¹²/лСреднесуточный прирост эритроцитов **г/л%10¹²/л%Гемостимулятор, 107-21153-1502,571,901-219,3-9,14,593,75Гемостимулятор, 13-21160-1428,336,171-308,3-9,43,572,92Гемостимулятор, 10^-23-14157-1477,335,431-308,9-8,04,185,42Гемостимулятор, 10^-41-21155-14520,0014,811-308,0-7,73,266,67Гемостимулятор, 10^-63-30145-1503,332,473-307,1-7,60,7715,97Гемостимулятор 10^-81-14145-15310,007,401-308,7-8,73,981,25Исход-135---4,8--* Приведены сроки, в течение которых наблюдался повышенный уровень гемоглобина и эритроцитов.** Среднесуточный прирост рассчитан на первые сутки достоверного увеличения показателя.

Таблица 8
Динамика изменений показателей периферической крови у крыс с острой постгеморрагической анемией, контроль. (М±m; n=10). Группа 1.ПоказателиИнтактИсход анемииВремя исследования, сутки   1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,36,8±0,27,0±0,18,1±0,39,4±0,410,1±0,612,6±0,613,3±0,613,5±0,513,8±0,6Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,8±0,22,9±0,23,2±0,23,7±0,34,2±0,34,8±0,45,1±0,45,0±0,45,0±0,4Гематокрит, %47±2,022±1,125±2,028±2,432±3,039±3,044±3,046±3,047±3,048±3,0MCV, мкм³98798688869392909496МСН, пг28242425252426262728МСНС, г/дл29312829292629292929Ретикулоциты, %4,5±0,38,4±0,36,2±0,27,3±0,45,5±0,35,0±0,44,6±0,54,1±0,34,4±0,34,6±0,3Тромбоциты, 10⁹/л620±18800±18830±18-785±20740±17715±18700±17715±18612±19650±18Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,014,8±1,314,6±1,310,8±1,012,5±1,112,6±1,211,0±1,411,9±1,012,0±1,012,2±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,6±0,23,3±0,33,0±0,32,9±0,32,5±0,32,2±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,228,0±2,027,4±1,526,5±1,828,0±1,527,8±1,229±1,628±1,528,4±1,427,8+2,1эозинофилы, %2,0±0,25,0±0,35,0±0,34,7±0,43,7±0,43,5±0,33,1±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,23,5±0,23,0±0,22,8±0,22,4±0,22,2±0,22,0±0,22,0±0,32,0±0,1лимфоциты, %64,2±3,561,4±4,060,8±4,262,8±3,462,6±3,163,8±3,163,5±3,165,0±3,264,6±3,065,2±3,5Р<0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 9
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с острой постгеморрагической анемии, леченных гемостимулятором в дозе 10^-2 мкг/кг, внутримышечное введение. (M±m; n=10). Группа 2.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,36,8±0,27,7±0,49,4±0,413,3±0,415,1±0,514,1±0,413,8±0,514,0±0,514,0±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,8±0,23,7±0,34,7±0,36,7±0,35,5±0,45,6±0,45,2±0,65,0±0,55,5±0,4Гематокрит, %47±2,022±1,137±5,047±3,060±3,056±5,055±550±548±548±4MCV, мкм³98791001009010298969687МСН, пг28242120202725272825МСНС, г/дл29312120222726282929Ретикулоциты, %4,5±0,38,4±0,36,1±0,27,4±0,46,9±0,46,5±0,58,3±0,54,9±0,34,6±0,35,0±0,3Тромбоциты, 10⁹/л620±18800±18895±26763±18725±191010128838±22715±18685±17700±18Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,014,8±1,313,0±1,212,8±1,110,8±1,210,2±1,110,4±1,111,2±1,012,6±1,112,8±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,6±0,22,9±0,32,7±0,32,4±0,22,2±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,228,0±2,026,5±1,525,0±1,326,2±1,327,0±1,328,7±1,528,5±1,627,4±1,627±1,5эозинофилы, %2,0±0,25,0±0,34,0±0,33,5±0,32,8±0,32,3±0,23,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,22,7±0,32,8±0,32,3±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2лимфоциты, %64,2±3,561,4±4,063,9±3,266,0±3,366,3±3,266,5±3,264,3±3,164,5±3,165,6±3,266,0±3,3Р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 10
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с острой постгеморрагической анемией, леченных гемостимулятором
в дозе 10^-4 мкг/кг, внутримышечное введение (М±m; n=10). Группа 3.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,36,8±0,28,0±0,210,2±0,313,7±0,414,1±0,514,3±0,414,0±0,513,8±0,514,0±0,5Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,8±0,23,9±0,24,7±0,36,1±0,46,6±0,45,9±0,45,8±0,44,8±0,55,5±0,4Гематокрит, %47±2,022±1,134±0,437±1,048±1,051±2,055±4,050±5,047±4,050±2,0MCV, мкм³98798779797786869896МСН, пг28242122222124242926МСНС, г/дл29312428292828282928Ретикулоциты, %4,5±0,38,4±0,35,9±0,48,0±0,57,0±0,46,6±0,45,2±0,54,9±0,44,6±0,45,3±0,4Тромбоциты,10⁹/л620±18800±18800±25838+20725±19780±17720±20675±19750±19715±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,014,8±1,314,6±1,411,2±1,110,6±1,010,0±1,411,2±1,410,6+1,211,6±1,011,0±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,6±0,22,8±0,42,6±0,22,5±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,228,0±2,029,0±1,327,0±1,328,0±1,328±2,028,0+2,027,5±1,527,4±1,627,6±1,6эозинофилы, %2,0±0,25,0±0,32,8±0,32,7±0,32,7±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,22,8+0,22,5±0,22,7±0,32,6±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2лимфоциты, %64,2±3,561,4±4,062,6+3,165,2±3,264,1±3,264,4±3,065,0±5,465,5±5,565,6±3,465,4±4,4р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 11
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с острой постгеморрагической анемией, леченных гемостимулятором
в дозе 10^-6 мкг/кг, внутримышечное введение (М±m; n=10). Группа 4ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,36,8±0,28,4±0,210,8±0,313,6±0,414,4±0,514,4±0,414,2±0,513,9±0,514,1±0,5Эритроциты, 10^12/л4,8±0,32,8±0,23,9±0,24,9±0,36,0±0,46,4±0,45,8±0,45,6±0,44,9±0,55,3±0,4Гематокрит, %47±2,022±1,132±0,438±1,047±1,052±2,056±4,050±5,047±4,050±2,0MCV, мкм³98798278788197899694МСН, пг28242222232325252827МСНС, г/дл29312628292826283028Ретикулоциты, %4,5±0,38,4±0,36,9±0,48,2±0,57,2±0,46,8±0,45,6±0,54,8±0,44,7±0,45,0±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±18800±18798±25826±20740±19760±17740±20685±19700±19725±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,014,8±1,314,9±1,411,8±1,110,9±1,010,8±1,411,8±1,410,7±1,211,4±1,011,2±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,6±0,22,4±0,42,7±0,22,3±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,228,0±2,029,0±1,327,0±1,328,0±1,328,2±2,028,0±2,027,4±1,527,5±1,627,6±1,6эозинофилы, %2,0±0,25,0±0,32,4±0,32,5±0,32,6±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,22,4±0,22,5±0,22,7±0,32,2±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2лимфоциты, %64,2±3,561,4±4,063,8±3,165,3±3,264,4±3,264,6±3,065,0±5,465,6±5,565,5±3,465,4±4,4р≤0,05 по отношению к контролю

Таблица 12
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с острой посттеморрагической анемией, леченных гемостимулятором в дозе 10^-8 мкг/кг, внутримышечное введение (М+n; n=10). Группа 5.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,36,8±0,29,8±0,212,9±0,313,4±0,414,5±0,514,0±0,413,7±0,514,0±0,514,1±0,5Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,8±0,24,1±0,24,8±0,46,7±0,46,3±0,46,0±0,45,5±0,45,0±0,54,8±0,4Гематокрит, %47±2,022±1,141±0,448±1,054±1,056±2,050±4,050±5,048±4,047±2,0MCV, мкм³9879100100818983919698МСН, пг28242427202323252829МСНС, г/дл29312427252628272930Ретикулоциты, %4,5±0,38,4±0,36,6±0,47,4±0,57,5±0,46,1±0,47,2±0,55,1±0,44,6±0,45,0±0,4Тромбоциты, 10⁹/л620±18800±18800±25838±20775±19750±17720±16767+19650±19615±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,014,8±1,314,6±1,412,3±1,111,6±1,011,4±1,411,8±1,410,6±1,211,6±1,012,0±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,6±0,22,8±0,22,6±0,22,5±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,228,0±2,029,0±1,327,0±1,328,0±1,328±2,028,0±2,027,5±1,527,4±1,627,6±1,6эозинофилы, %2,0±0,25,0±0,32,8±0,32,7±0,32,7±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,22,8±0,32,5±0,22,7±0,32,6±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2лимфоциты, %64,2±3,561,4±4,062,6±3,165,2±3,264,1±3,264,4±3,065,0±5,465,5±5,565,6±3,465,4±4,4р≤0,05 по отношению к контролю

Таблица 13
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с острой постгеморрагической анемией, леченных Тардифероном
в дозе 7,2 мг/кг, внутрижелудочно. (М±m; n=10). Группа 6.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,36,8±0,210,1±0,411,7±0,612,5±0,413,5±0,614,0±0,513,5±0,513,4±0,513,3±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,8±0,23,2±0,23,6±0,34,6±0,34,8±0,45,0±0,44,8±0,45,0±0,44,8±0,4Гематокрит, %47±2,022±1,135±1,040±2,044±2,647±3,048±3,047±3,047±3,046±3,0MCV, п9879109111969896989496МСН, пг28243233272828282728МСНС, г/дл29312929282929292929Ретикулоциты, %4,5±0,38,4±0,37,0±0,77,5±0,77,2±0,76,6±0,65,3±0,45,5±0,45,2±0,35,1±0,3Тромбоциты, 10⁹/л620±18800±18865±23840±25850±17700±16720±15650±14670±15645±16Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,014,8±1,314,8±1,313,9±1,113,6±1,513,7±1,412,4±1,012,5±1,412,6±1,012,7±1,1Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,6±0,22,8±0,32,3±0,22,5±0,22,1±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,228,0±2,027,0±2,029,0±1,028,5±1,528,7±1,327,5±5,228,3±2,227,8±2,527,6±2,0эозинофилы, %2,0±0,25,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2лимфоциты, %64,2±3,561,4±4,065,2±5,563,7±6,364,0±5,064,2±5,865,5±5,564,7±5,365,2±5,465,4±5,2р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 14
Среднесуточный прирост количества гемоглобина и числа эритроцитов у крыс с острой постгеморрагической анемией, принимавших препарат гемостимулятора и ТардиферонПрепараты, дозы, мкг/кгГемоглобинЭритроцитыСутки прихода к нормеГемоглобин, г/лСреднесуточный прирост гемоглобинаСутки прихода к нормеЭритроциты, 10¹²/лСреднесуточный прирост эритроцитовг/л%  10¹²/л%Контроль301332,173,19214,80,0953,39Гемостимулятор 10^-271339,2913,6676,70,5619,89Гемостимулятор 10^-471379,8614,5034,70,63322,62Гемостимулятор 10^-671369,7114,2934,90,70025,00Гемостимулятор 10^-871349,4313,8734,80,66723,82Тардиферон141354,797,04144,80,1435,11Исход анемии-68---2,8--Интакт 135±3,0   4,8±0,3  

Таблица 15
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с гемолитической анемией, контроль. (М+m; n=10). Группа 1.ПоказателиИнтактИсход анемииВремя исследования, сутки   1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,38,0±0,28,7±0,38,2±0,19,1±0,19,3±0,310,2±0,211,6±0,213,0±0,213,2±0,2Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,1±0,22,3±0,12,4±0,12,8±0,13,2±0,23,7±0,34,8±0,35,0±0,34,7±0,3Гематокрит, %47±2,025±2,126±2,030±2,236±2,440±3,142±3,548±3,248±3,048±3,0MCV, мкм³9811911312512912511310096102МСН, пг28383834332928242628МСНС, г/дл29323327252324242728Ретикулоциты, %4,5±0,38,9±0,58,8±0,58,8±0,54,9±0,24,8±0,24,8±0,25,0±0,34,0±0,34,2±0,3Тромбоциты, 10⁹/л620±18816±16725±20800±21700±20600±18650±18640±20700±18650±19Лейкоциты, 10⁹/л11,8+1,015,6+1,415,8±1,515,8±1,311,9±1,011,6±1,011,8±1,012,8±1,011,9±1,012,6±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,223,0±1,523,7±1,323,5±1,523,7±1,323,5±1,528,8±1,223,0±1,523,7±1,323,5±1,5эозинофилы, %2,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,2моноциты, %3,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3лимфоциты, %64,2±5,870,0±1,669,3±2,769,5±1,569,3±2,765,9±1,664,2±5,870,0±1,669,3±2,769,5±1,5p≤0,05 по отношению к исходным показателям.

Таблица 16
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с гемолитической анемией, леченных гемостимулятором в дозе 10^-4 мкг/кг, внутримышечное введение. (М±m; n=10). Группа 2.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки   1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,38,0±0,210,5±0,210,5±0,212,0±0,413,5±0,414,0±0,515,5±0,515,0±0,514,8±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,1±0,23,0±0,13,8±0,14,4±0,25,5±0,46,1±0,36,5±0,36,4±0,35,4±0,3Гематокрит, %47±2,025±2,134±2,038±2,243±3,054±4,054±3,056+3,060±4,052±4,0MCV, мкм³98119113100989889869496МСН, пг28383528272423242327МСНС, г/дл29323128282526282528Ретикулоциты, %4,5±0,38,9±0,85,6±0,46,0±0,45,5±0,15,7±0,37,3±0,47,±0,36,2±0,44,5±0,2Тромбоциты, 10/л620±18816±20740±18715±16700±20725±25800±18750±20800±20900±20Лейкоциты, 10%11,8±1,015,6±1,415,0±1,315,2±1,112,0±1111,8±1,012,0±1,012,2±1,111,6±1,011,8±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0+0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,223,0±1,523,7±1,323,5±1,528,8±1,223,0±1,523,7±1,323,5±1,523,5±1,523,7±1,3эозинофилы, %2,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,2моноциты, %3,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3лимфоциты, %64,2±5,870,0±1,669,3±2,769,5±1,564,2±5,870,0±1,669,3±2,769,5±1,669,5±1,569,3±2,7р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 17
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с гемолитической анемией, леченных гемостимулятором в дозе 10^-6 мкг/кг, внутримышечное введение. (М±m; n=10). Группа 3.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,38,0±0,29,5±0,210,2±0,211,2±0,413,3±0,413,6±0,515,4±0,515,2±0,513,8±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,1±0,22,9±0,13,8±0,14,6±0,25,3±0,45,6±0,36,3±0,36,4±0,45,5±0,3Гематокрит, %47±2,025±2,129±2,037±2,244±3,051±4,054±3,061±3,060±5,053±3,8MCV, мкм³9811910097969696979496МСН, пг28383327242524242425МСНС, г/дл29323328252625252526Ретикулоциты, %4,5±0,38,9±0,85,7±0,46,4±0,45,8±0,16,7±0,37,4±0,47,2±0,36,4±0,44,6±0,2Тромбоциты, 10%620±18816±20746±18745±16709±20724±25850±18756±20806±20780±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,015,6±1,415,1±1,315,2±1,112,6±1,111,6±1,012,2±1,012,0±1,111,8±1,011,8±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,223,0±1,523,6±1,323,5±1,524,5±1,226,0±1,523,7±1,323,5±1,526,5±1,526,7±1,3эозинофилы, %2,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,2моноциты, %3,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3лимфоциты, %64,2±5,870,0±1,669,4±2,769,5±1,568,5±5,867,0±1,669,3±2,769,5±1,666,5±1,566,3±2,7р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 18
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с гемолитической анемией, леченных гемостимулятором в дозе 10^-8 мкг/кг, внутримышечное введение. (М±m; n=10). Группа 4.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,38,0±0,29,6±0,210,7±0,212,2±0,413,4±0,414,6±0,515,4±0,514,1±0,513,8±0,4Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,1±0,23,0±0,14,1±0,14,9±0,25,8±0,46,0±0,46,2±0,36,0±0,35,5±0,3Гематокрит, %47±2,025±2,135+2,042±2,246±3,057±4,058±3,061±3,060±3,057±4,0MCV, мкм³9811911710294989798100104МСН, пг28383226252324252425МСНС, г/дл29322725272425252424Ретикулоциты, %4,5±0,38,9±0,87,7±0,47,4±0,46,8+0,16,9±0,37,5±0,47,0±0,36,2±0,44,6±0,2Тромбоциты, 10⁹/л620±18816±20846±18785±16769±20744±25850+18756±20800±20782±20Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,015,6±1,415,4±1,315,6±1,112,8±1,111,8±1,012,4±1,012,1±1,111,5±1,011,6±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,223,0±1,523,5±1,323,6±1,524,2±1,226,0±1,523,8±1,323,5±1,526,4±1,526,6±1,3эозинофилы, %2,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,2моноциты, %3,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,3лимфоциты, %64,2±5,870,0±1,669,5+2,769,4±1,568,8±5,867,0±1,669,2±2,769,5±1,666,6±1,566,4±2,7р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 19
Динамика изменений показателей периферической крови крыс с гемолитической анемией, леченных Тардифероном в дозе 7,2 мг/кг, внутрижелудочно. (М±m; n=10). Группа 5.ПоказателиИнтактИсход анемии, группа 1Время исследования, сутки1371421304060Гемоглобин, г/дл13,5±0,38,0±0,29,2±0,310,0±0,411,2±0,412,5±0,413,6±0,513,6±0,513,5±0,513,4±0,5Эритроциты, 10¹²/л4,8±0,32,1±0,22,8±0,23,0±0,34,3±0,34,5±0,44,8±0,45,1±0,44,8±0,44,8±0,4Гематокрит, %47±2,025±2,130±2,236±2,446±3,048±3,050±4,051±4,050±5,048±3,8MCV, мкм³98119107120107107104100104100МСН, пг28383333262828272828МСНС, г/дл29323128242627272728Ретикулоциты, %4,5±0,38,9±0,59,5±0,47,8±0,76,2±0,78,6±0,46,5±0,44,3±0,44,5±0,34,6±0,3Тромбоциты, 10⁹/л620±18816±16800±16775±18725±18695±14675±15760±20676±15700±16Лейкоциты, 10⁹/л11,8±1,015,6±1,416,2±0,715,6±0,813,4±0,813,2±0,713,0±0,912,6±0,511,8±1,012,0±1,0Нейтрофилы:          палочкоядерные, %2,0±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,21,8±0,22,4±0,22,1±0,22,0±0,22,0±0,22,0±0,2сегментоядерные, %28,8±1,223,5±1,523,7±1,323,5±1,525,0±1,029,0±1,029,2±1,130,0±1,728,0±1,628,2±1,7эозинофилы, %2,0±0,22,0±0,32,0±0,22,0±0,22,0±0,22,5±0,23,0±0,22,8±0,33,0±0,33,0±0,3моноциты, %3,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,33,0±0,32,2±0,22,0±0,22,1±0,22,0±0,22,0±0,2лимфоциты, %64,2±5,870,0±1,669,3±2,769,5±1,568,2±5,863,9±3,163,7±3,263,1±3,165,0±3,064,8±3,0р≤0,05 по отношению к контролю.

Таблица 20
Среднесуточный прирост количества гемоглобина и числа эритроцитов у крыс с гемолитической анемией, принимавших препарат гемостимулятора и ТардиферонПрепараты, дозы, мкг/кгГемоглобинЭритроцитыСутки прихода к нормеГемоглобин, г/лСреднесуточный прирост гемоглобинаСутки прихода к нормеЭритроциты, 10¹²/лСреднесуточный прирост эритроцитовг/л%10¹²/л%Контроль401301,251,56304,80,094,29Гемостимулятор 10^-4141353,934,9174,40,32815,64Гемостимулятор 10^-6141333,784,7374,60,35717,01Гемостимулятор 10^-8141343,864,8274,90,419,05Тардиферон211362,673,34144,50,1718,143Исход анемии-80---2,1--Интакт 135±3   4,8±0,3  

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к получению иммуностимулирующих препаратов из сырья животного происхождения, предназначенных для усиления гемопоэза. Способ заключается в том, что сырье гомогенизируют, осаждают частицы ткани центрифугированием, полученный супернатант нагревают при 80°С в течение 20 минут, осадок отделяют центрифугированием, супернатант фильтруют, добавляют к фильтрату охлажденный ацетон в соотношении 1:5, выпавший осадок промывют ацетоном и высушивают, полученный порошок растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе рН 7,0 в соотношении 1:10, центрифугируют, доводят супернатант до рН 4,0, перемешивают, добавляя кристаллический сульфат аммония до концентрации 23-28,6%, проводят ионообменную хроматографию на карбоксиметил сефадексе С-25, элюируют полипептиды с помощью линейного градиента концентрации и рН натрий-ацетатного буфера от 0,01 М, рН 4.0-5.0 до 2 М, рН 7.0, лиофилизируют полученные полипептиды и обессоливают на колонке с сефадексом Г-25. Способ позволяет выделить полипептиды с высокой биологической активностью, стимулирующие гемопоэз, и использовать их для получения лекарственных средств для лечения анемии. 20 табл.

Способ получения иммуностимулирующих тимусных полипептидов, влияющих на гемопоэз, заключающийся в том, что сырье гомогенизируют в 0,15 М растворе хлорида натрия, осаждают частицы ткани центрифугированием, полученный супернатант нагревают при 80°С в течение 20 мин, осадок термолабильных белков отделяют центрифугированием, а супернатант фильтруют, добавляют к фильтрату охлажденный ацетон в соотношении 1:5, выпавший осадок промывают ацетоном и высушивают, полученный порошок растворяют в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе рН 7,0 в соотношении 1:10, отделяют нерастворившуюся часть центрифугированием, доводят супернатант до рН 4,0 и перемешивают добавляя кристаллический сульфат аммония до концентрации 23-28,6%, ионообменную хроматографию проводят на карбоксиметил сефадексе С-25, элюируют полипептиды с помощью линейного градиента концентрации и рН натрий-ацетатного буфера от 0,01 М, рН 4,0-5,0 до 2 М, рН 7,0, лиофилизируют полученные полипептиды и обессоливают на колонке с сефадексом Г-25.