СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к способам получения пищевых добавок.

Известен способ получения экстракта для медицинских целей, обладающего иммуностимулирующим действием, из сырья животного происхождения путем изоляции костного мозга, нагревания в свободной от пирогенов воде и выдерживания при 80^oC в течение 5 мин, центрифугирования и использования надосадочной жидкости для последующей ультрафильтрации, электродиализа (см. а.с. N 1442064, МКИ A 61 K 37/24, 1988, БИ N 44).

Однако известный способ является сложным в исполнении и экономически невыгодным для получения иммуностимулятора в виде пищевой добавки.

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ получения иммуностимулятора путем выделения клеток из костного мозга животных с последующим инкубированием их в питательной среде, концентрированием и элюцией надосадочной жидкости (см. а. с. N 1005790, МКИ A 61 K 39/00, 1983, БИ N 11).

Однако известный способ является трудоемким, т.к. требует строгих стерильных условий, дорогостоящим из-за применения питательной среды 199, в состав которой входят следующие компоненты (г/л):NaCl-8, KCl-0.4, MgCl₂•6H₂O-0.1, MgSO₄•7H₂O-0.1, Na₂HPO₄•7H₂O-0.06, KH₂PO₄•7H₂O-0.06, CaCl₂-0.14, NaHCO₃-0.6, фенолрот-0.02, глюкоза-0.6, применение которой не позволяет использовать ее на пищевые цели. Способ предусматривает применение только рядовой кости свиней.

Таким образом, задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в получении иммуностимулятора в виде пищевой добавки. Технический результат, получаемый при осуществлении способа, - это упрощение технологического процесса и расширение сырьевой базы.

Для достижения обеспечиваемого предлагаемым изобретением технического результата в способе получения иммуностимулятора путем выделения клеток костного мозга животных с последующей инкубацией их в питательной среде, центрифугирования надосадочной жидкости, согласно изобретению клетки выделяют из костного мозга мелкого рогатого скота, а в качестве питательной среды применяют онкотический раствор с концентрацией 0,85 - 0,90%, при этом клетки берут в заданной концентрации.

В результате проведенных экспериментов, авторы выявили возможность применения онкотического раствора с концентрацией 0,85 - 0,90% в качестве питательной среды для клеток костного мозга животных. При этом авторы обнаружили, что можно использовать не только клетки костного мозга свиней, но и мелкого рогатого скота. Концентрация клеток была подобрана таким образом, чтобы получить максимальный выход биологически активных компонентов и сохранить жизнеспособность клеток.

Анализ патентной и научно-технический литературы показал, что из уровня техники авторами не выявлены технические решения, включающие совокупность признаков, сходных или эквивалентных заявляемым.

Это позволяет сделать вывод о соответствии предложения критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ получения иммуностимулятора осуществляется следующим образом.

При разделывании туш на мясокомбинате извлекаются ребра животных, это могут быть ребра свиней или мелкого рогатого скота. Вымывание клеток из реберной кости производят шприцом с онкотическим раствором с концентрацией 0,85 - 0,90%. Онкотический раствор является естественной средой для жизнедеятельности клеток костного мозга, т.к. поддерживает осмотическое давление в клетке, позволяет проводить как выделение, так и инкубацию, не нарушая целостность клетки. Затем производят трехкратное промывание клеток этим же раствором: взвесь клеток центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок разводят онкотическим раствором. В последнем устанавливают концентрацию путем подсчета клеток, приходящихся на 1 мл онкотического раствора, в камере Горяева. Чтобы достичь заданной концентрации клеток после подсчета производят или концентрацию, или разведение взвеси клеток онкотическим раствором. Какова концентрация клеток в заявляемом способе получения иммуностимулятора авторы конкретно не указывают, так как это является "ноу-хау" в предлагаемом изобретении. И авторам не хотелось бы, чтобы этот момент был раскрыт. В этой концентрации клетки помещают в культуральные флаконы по 100 - 150 мл взвеси на флакон, объем которого один литр. Инкубацию проводят при температуре 37^oC в течение 14 - 18 ч. По окончании инкубации взвесь клеток центрифугируют, в надосадочной жидкости определяют количество белка по методу Лоури, а после этого либо используют в эксперименте, либо хранят при температуре -12^oC.

Оценку иммунологической активности полученного иммуностимулятора проводили в системе in vivo на лабораторных животных (мышах).

Заявляемый способ подтверждается следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра свиней. Клетки вымывают из реберной кости свиней физиораствором, промывают и инкубируют в заданной концентрации в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах по 100 - 150 мл суспензии на флакон, объем которого 1 л. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2 мг/мл.

Оценку иммунологической активности проводят в системе in vivo при локальном введении фракции мышам на 4 сут вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана в дозе 100 мкг, содержащейся в 0.1 мл физиораствора, в подушечку задней конечности. В другой группе, служившей контролем, вводят физиораствор. На следующий день у этих мышей извлекают подколенные лимфатические узлы и определяют в них число антителообразующих клеток, сравнивая их количество в опыте и контроле.

Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях рассчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле.

Пример 2. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра мелкого рогатого скота, физиораствором вымывают клетки костного мозга из кости, промывают и инкубируют в заданной концентрации в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах по 100 - 150 мл суспензии на флакон, объем которого 1 л. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2,1 мг/мл. Параллельно проводят выделение клеток средой 199, промыв и инкубацию ведут в той же среде. Условия получения аналогичны примеру 1. Содержание белка - 2,5 мг/мл.

Оценку иммунологической активности проводят в системе in vivo при локальном введении фракции мышам на 4 сут вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана. В случае получения композиции на среде 199 в группе, служившей контролем, вводят среду 199.

Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях расчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле.

Пример 3. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра свиней. Клетки вымывают из реберной кости свиней физиораствором, промывают и инкубируют в заданной концентрации в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2,2 мг/мл.

Для доказательства того, что эту композицию можно использовать в продуктах, подвергаемых тепловой обработке, и сохранить при этом ее биологическую активность, надосадочную жидкость нагревают при 100^oC в течение 10 мин.

Оценку иммунологической активности композиции, подвергнутой нагреву, проводят в системе in vivo аналогично первым двум примерам. Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях рассчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле.

Пример 4. При разделывании туш на мясокомбинате извлекают ребра мелкого рогатого скота. Клетки вымывают, промывают и инкубируют средой 199. Инкубацию в заданной концентрации проводят в течение 16 ч при температуре 37^oC в культуральных флаконах. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при 2000 мин. В надосадочной жидкости определяют количество белка по Лоури. Содержание его 2,8 мг/мл.

При выборе способов консервирования пищевой композиции рассматривали возможность охлаждения при 0 - 4^oC, замораживания при -18^oC и хранения при -12^oC в течение 1 мес. Охлаждение оказалось не эффективным в результате быстрого обсеменения, а фракцию, подвергнутую замораживанию и хранению при низких температурах, оценивали по стимуляции антителообразующих клеток системе in vivo при локальном введении фракции мышам на 4 сут вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана.

По технической сущности заявляемое изобретение сравнивали с прототипом (см. а.с. N 1005790, кл. A 61 K 39/00, 1983, БИ N 11).

Коэффициент стимуляции антителообразования К определяют в обеих моделях рассчетным путем как отношение количества АОК в опыте к соответствующему количеству АОК в контроле.

Данные примеров приведены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать клетки костного мозга не только из костей свиней, но и костей мелкого рогатого скота, что позволяет значительно расширить сырьевую базу для получения пищевой добавки. Иммуностимулятор, полученный данным способом, сохраняет свои биологические свойства как при высоких, так и при низких температурах. По сравнению с уже известным способом получения стимулятора антителопродуцентов предлагаемый способ получения сокращается на 2 - 4 ч; упрощается за счет отказа от проведения гель-фильтрации, лиофилизации; замена питательной среды 199 на онкотический раствор значительно удешевляет способ; композиция, полученная этим способом, может храниться при низких температурах.

Использование полученного иммуностимулятора в виде пищевой добавки позволит получать продукты для специализированного питания с иммуностимулирующими свойствами.

В Проблемной лаборатории "Иммунохимии пестицидов и пищевых добавок" разрабатываются рецептуры мясных продуктов с введением заявляемого иммуностимулятора.

Способ предназначен для получения иммуностимулятора в качестве пищевой добавки. Способ заключается в следующем. Выделяют клетки костного мозга из костного мозга мелкого рогатого скота, промывают их и инкубируют в онкотическом растворе с концентрацией 0,85 - 0,90%, а затем центрифугируют надосадочную жидкость. Способ позволяет расширить сырьевую базу, ускорить и удешевить получение иммуностимулятора в качестве пищевой добавки. 1 табл.

Способ получения иммуностимулятора путем выделения клеток из костного мозга животных с последующей инкубацией их в питательной среде, центрифугировании надосадочной жидкости, отличающийся тем, что клетки выделяют из костного мозга мелкого рогатого скота, а в качестве питательной среды применяют онкотический раствор с концентрацией 0,85-0,90%, при этом клетки берут в заданной концентрации.