КОСМЕТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОХУДЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ВЕЩЕСТВО, ИНДУЦИРУЮЩЕЕ ПРОДУЦИРОВАНИЕ IL-6 Российский патент 2005 года по МПК A61K7/48 A61K35/66 A61P3/04 

Данное изобретение относится к косметическим композициям, содержащим активные вещества для похудения.

Активные вещества, присутствующие в этой косметической композиции, выбраны из антагониста рецепторов нейропептида Y, в дальнейшем обозначаемого как NPY, антагониста α2-рецепторов и индуктора продуцирования интерлейкина-6, в дальнейшем обозначаемого IL-6.

Антагонист NPY, антагонист α2 или индуктор продуцирования IL-6 может представлять собой непептидное соединение, пептид, клеточный или тканевый экстракт животного или растительного происхождения либо продукт, полученный при брожении, осуществляемом микроорганизмом, например бактерией или грибом.

Заявка на патент ЕР 838217 описывает косметическую композицию для похудения, которая содержит антагонист NPY и антагонист α2. Активные вещества в этой композиции получают при брожении, осуществляемом двумя микроорганизмами, депонированными в Национальной коллекции культур микроорганизмов (C.N.C.M.) Пастеровского института, где они были зарегистрированы под номерами I 1332 и I 1778 соответственно. В настоящем описании изобретения эти активные вещества обозначены как вещество А и вещество Б соответственно. Косметическая композиция для похудения, содержащая их, обозначается как композиция Am1.

Эта композиция для похудения Am1 действует на подкожную жировую ткань и регулирует высвобождение жира, запасенного в адипоцитах.

Композиция Am1 путем блокирования α2- и NPY-рецепторов позволяет очистить гипертрофированные адипоциты и избежать любого нового избыточного накопления в адипоцитах, давая возможность экспрессии β-рецепторов, чья пролиполитическая активность в норме маскируется антилиполитическими α2- и NPY-рецепторами, которые находятся в значительном избытке в подкожных жировых тканях. Композиция Am1, таким образом, позволяет эффективно воздействовать на отток жирных кислот, накопленных в адипоцитах.

Композиции по настоящему изобретению поддерживают эту активность, но и дополняют ее, с одной стороны, затормаживающим действием в отношении поступления жирных кислот, которое проявляет себя эффектом снижения продуцирования LPL (липопротеидлипаза), фермента, ответственного за поступление жирных кислот в клетку и, с другой стороны, на гиперплазию адипоцитов. Это неожиданное дополнительное действие получают от вещества, способного индуцировать продуцирование IL-6 адипоцитами. Это вещество продуцируется микроорганизмом, депонированным в C.N.C.M. Пастеровского института и зарегистрированным под номером I 1844. Это активное вещество в дальнейшем обозначается как вещество В.

Рассматриваемые в течение длительного времени исключительно в роли энергетического резерва, адипоциты за последние несколько лет продемонстрировали функции эндокринных и секреторных клеток (Ailhaund G. et al., Medecine/Science 1998, 14, 858-864). Лептин в полной мере иллюстрирует эту новую секреторную функцию адипоцита. Этот белок продуцируется именно зрелым адипоцитом. Он вовлечен в регулирование насыщения; считается, что он также вовлечен в регулирование жировых отложений. Таким образом, адипоцит ответственен за продуцирование факторов с аутокринной и паракринной активностью, которые должны регулировать физиологию жировой ткани.

В частности, совсем недавно было продемонстрировано, что на эндокринную функцию адипоцита влияют два специфических медиатора:

- лизофосфатидная кислота (LPA), липидный фактор, продуцирование которого опосредовано активацией α2-рецептора и функция которого состоит в рекрутинге новых адипоцитов (Valet P., et al., J. Clin. Invest. 1998, 101(7), 1431-1438);

- IL-6, который является многофункциональным цитокином.

Вещество В известно как индуктор продуцирования IL-6 кератиноцитами. Способ его получения описан в международной патентной заявке WO 99/40896. Оно оказывает действие на старение кожи.

Ничто не могло указать на то, что это вещество (продуцируемое микроорганизмом I 1844) будет, кроме того, оказывать двойное действие на адипоциты.

Недавно исследования показали, что жировые клетки могут продуцировать IL-6, функция которого на уровне адипоцитов состоит в подавлении синтеза LPL, фермента, ответственного за поступление жирных кислот в жировую клетку (Greenberg A. S. et al. Cancer Research 1992, 52, 4113-4116).

Продуцирование IL-6 клетками подкожной жировой ткани положительно коррелирует с увеличением показателя массы тела (Mohamed Ali V. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997, 82, 4196-4200), но также и различается в зависимости от происхождения жировой ткани.

Так, у субъектов, страдающих ожирением, базальные адипоциты, собранные из сальниковой области, высвобождают в 2-3 раза больше IL-6, чем подкожные адипоциты (Fried S. К. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998, 83, 847-860).

Наконец, в дополнение к способности IL-6 снижать продуцирование LPL адипоцитами, IL-6 может также воздействовать, через ингибирование, на дифференциацию клеток-предшественников адипоцитов (Hauner H. et al., 8th International Congress on Obesity 1999, 47-53).

IL-6, следовательно, выступает как цитокин, который оказывает аутокринное действие (на LPL) и паракринное действие (на преадипоциты) для замедления развития подкожной жировой ткани.

Однако, как и все цитокины, IL-6 является плейотропным гликопротеином, другими словами, он проявляет различные действия в зависимости от клетки, которая его продуцирует. Так, на уровне адипоцита IL-6 будет оказывать действия совершенно другого типа по сравнению с теми, что уже известны для кератиноцитов.

В частности, в адипоците IL-6, синтезированный этой клеткой, по принципу обратной связи регулирует содержание и, следовательно, активность фермента, ответственного за поступление жиров.

Таким образом, композиции по изобретению дают возможность регулировать явления поступления и оттока жирных кислот, включая накопление и гипертрофию адипоцитов. Она также позволяет воздействовать на гиперплазию адипоцитов.

Известно, что образование новых адипоцитов у людей происходит в течение всей жизни индивидуумов. Так, "спящие" жирные клетки были выделены у пожилых людей, независимо от их пола (Ailhaud G. et al. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 1992, 16(2), 517-521; Spielgelman В et al. Cell 1996, 87, 377-389; Hauner et al. J. Clin. Invest. 1989; 84, 1663-1670).

Развитие жировой ткани происходит в результате увеличения размера адипоцитов, сопутствующего избыточному накоплению жирных кислот, а также в результате рекрутинга новых жировых клеток, получающихся при размножении и дифференциации клеток-предшественников адипоцитов - преадипоцитов (Valet P. et al. J. Clin. Invest. 1998, 101 (7), 1431-1438).

Такой рекрутинг новых адипоцитов опосредуется растворимыми факторами, продуцируемыми гипертрофированными адипоцитами: в частности LPA - посредством стимуляции α2-рецептора, и IL-6 - вследствие его способности к регуляции дифференциации преадипоцитов.

Следовательно, блокирование α2-рецептора является таким, чтобы дать возможность, параллельно с его полезным воздействием на липолиз, подавления высвобождения LPA, преимущественно с ингибированием рекрутинга новых адипоцитов.

IL-6 ограничивает созревание преадипоцитов до дифференцированных адипоцитов. Стимуляция адипоцитами продуцирования этого цитокина индуктором IL-6 усиливает это свойство.

Комбинация вещества Б, ингибитора рецептора, и вещества В, индуктора IL-6, следовательно, такая, что обеспечивает повышенную и новаторскую эффективность в отношении гиперплазии жировых клеток. Добавление вещества А к этой комбинации дает возможность получить композицию для похудения, которая действует по нескольким механизмам действия, а именно на гипертрофию и гиперплазию.

Были проведены исследования, чтобы продемонстрировать действие активного вещества, полученного из микроорганизма 11844, или вещества В, на зрелые адипоциты и на дифференциацию адипоцитов.

Приготовили косметическую композицию для похудения по изобретению, которая содержит вещества А, Б и В и которая в дальнейшем обозначается как Аm2.

Эффект похудения от Аm2 был предметом клинических исследований.

Биологические действия вещества В in vitro изучали на мышиной линии 3T3-L1. Эта линия преадипоцитов, обычно культивируемая в среде DMEM (минимальная эссенциальная среда Дульбекко), обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой, обладает свойством дифференцироваться в зрелые адипоциты в присутствии индукторов, таких как инсулин и индометацин (Slicker L. J. Biochem. Biophys. Res. Com. 1998, 251, 225-229). Через восемь - десять суток после индуцирования дифференциации клетки 3T3-L1 проявляли свойства зрелых адипоцитов. Этот переход от стадии незрелой клетки к стадии функционального адипоцита можно оценить морфологически по появлению внутрицитоплазматических везикул накопления липидов, которые видны под микроскопом или которые можно обнаружить биохимически, измеряя продуцирование лептина, гормона насыщения, продуцируемого исключительно зрелыми адипоцитами.

Влияние вещества В на активность адипоцитов оценивали на двух уровнях. С одной стороны, измеряя способность этого активного агента изменять продуцирование IL-6 адипоцитами и, с другой стороны, оценивая его действие на дифференцировку в зрелые адипоциты.

1 - Действие вещества В на продуцирование IL-6 зрелыми адипоцитами 3T3-L1

Зрелые адипоциты 3T3-L1 (собранные через 10 суток дифференциации, индуцированной комбинацией инсулина (5 мкг/мл) и индометацина (125 мкмоль), стимулируют веществом В в количестве 1% (об./об.) в течение 24 часов.

Затем с культуры отбирают супернатант, и содержание в нем IL-6 определяют при помощи ELISA (иммуноферментного твердофазного анализа) согласно инструкции поставщика (R&D System, Abingdon, GB). Количество секретированного IL-6 сравнивают с количеством секретированного IL-6 контрольной культуры, обработанной только растворителем вещества В (смесью этанол/вода (50/50), разведенной 1/100 в культуральной среде), или культуры, стимулированной эталонным индуктором IL-6, TNF-α (фактор некроза опухолей), в количестве 50 нг/мл (Fried S. К. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998, 83, 847-860). На Фиг.1 показано, что вещество В стимулирует продуцирование IL-6 адипоцитами 3T3-L1 с коэффициентом около пяти по сравнению с контрольной культурой с растворителем (43 пг/мг против 9 пг/мл соответственно), что составляет 83% действия, полученного с эталонным индуктором (52 пг/мл).

Полученные результаты показывают, что, с одной стороны, вещество В распознает адипоциты как мишень для индукции и что, с другой стороны, под действием вещества В, базальное продуцирование IL-6 адипоцитами увеличено с коэффициентом 5, что составляет 83% максимального действия, полученного с положительным контролем.

Такое увеличение делает возможным, принимая во внимание известные свойства IL-6, предусмотреть, во-первых, снижение синтеза фермента, ответственного за поступление жирных кислот, LPL, и затем, как следствие, снижение поступления жирных кислот.

2 - Действие вещества В на дифференциацию адипоцитов

Цель данного второго исследования заключалась в определении действия вещества В на образование новых адипоцитов.

Влияние вещества В на дифференциацию преадипоцитов 3T3-L1 в зрелые адипоциты исследуют, с одной стороны, путем оценки синтеза гормона лептина, маркера дифференциации адипоцитов и, с другой стороны, наблюдая под микроскопом за образованием внутрицитоплазменных липидных везикул, других индикаторов функциональной трансформации в зрелые адипоциты. Во всех случаях, вещество В вводят в культуру в количестве 1% (об./об.) в начале процесса дифференциации (индуцированной как указано выше) и выдерживают до конца процесса. Синтез лептина оценивают каждые двое суток с помощью анализа ELISA (R&D System, Abingdon, GB).

На Фиг.2 показано, что в присутствии вещества В продуцирование лептина остается на чрезвычайно низком уровне в течение всех 10 суток эксперимента, и оно заметно ниже (≤200 пг/мл), чем продуцирование, наблюдаемое в контрольной культуре, в которой, как и ожидается, наблюдается увеличение уровня лептина со вторых суток после индукции дифференциации и возрастание до максимального плато 1200-1400 пг/мл начиная с шестых суток. Ингибирование синтеза лептина веществом В составляет первый показатель блокирования процесса дифференциации адипоцитов.

Второй дается в эксперименте, отраженном на Фиг.3, которая показывает, что через 10 суток дифференциации контрольные клетки обнаруживают морфологию зрелых адипоцитов, содержащих крупные липидные везикулы, которые занимают практически все цитоплазматическое пространство (А), в то время как те же клетки, обработанные веществом В, остаются на очень незрелой стадии с несколькими редкими везикулами, которые намного меньше по размеру (Б).

С помощью модели 3T3-L1, обычно используемой в литературе для исследования функций адипоцитов, было показано, что вещество В обладает двойственным свойством: стимуляции, в зрелых адипоцитах, продуцирования IL-6 и ингибирования, для клеток-предшественников, превращения в зрелые адипоциты. Вещество В, следовательно, действует в прямом направлении, предотвращая созревание адипоцитов, и в обратном направлении, стимулируя, на уровне зрелых адипоцитов, продуцирование цитокина, который вовлечен в ограничение накопления жирных кислот.

Эти результаты подтверждают уникальное свойство этого вещества индуцировать продуцирование IL-6 адипоцитами, чья аутокринная функция (в отношении продуцирующих клеток) и паракринная функция (в отношении клеток вблизи этих продуцирующих клеток) проявляется как в отношении поступления жирных кислот в зрелые адипоциты, так и в отношении рекрутинга новых адипоцитов путем прекращения дифференциации преадипоцитов.

Были проведены предварительные клинические исследования с композициями для похудения по изобретению, которые содержат 3 активных вещества (в дальнейшем - Аm2).

С композицией Аm2 были проведены два клинических исследования.

Первое относится к измерению толщины подкожной жировой ткани, и во втором применяют измерение сантиметром.

1) Измерение толщины подкожной жировой ткани.

Целью данного исследования является оценка клинической эффективности новой композиции Аm2, содержащей 3 активные вещества.

Использованный протокол описан ниже.

Количество субъектов: 61 здоровая женщина-доброволец, разделенные на 2 группы (31 субъект, применяющий композицию для похудения Аm2, содержащую 3 активные вещества, 30 субъектов - композицию для похудения Am1).

Продукты дважды в сутки наносят на бедра целиком при круговом массаже, который прекращают после полного проникновения продукта.

Оценку эффективности делают за период времени 2 месяца путем измерения толщины подкожной жировой ткани в моменты времени Т₀, Т_{28 суток}, T_{56 суток}. Использовали метод эхографии.

Место для измерения идентифицировали путем маркировки кожи или по высоте, на которой установлен зонд.

Для облегчения вертикальной идентификации и чтобы избежать какого-либо перемещения или сжатия тканей во время измерения, эхографический зонд помещают на устойчивое приспособление, которое можно подогнать по высоте и независимо от оператора.

Последовательно получают три изображения на уровне идентификационной метки. На каждом изображении производят 3 измерения толщины. Все 6 измерений, полученные таким образом, позволяют получить точность ± 1 мм.

Эти измерения дополняются контролем массы субъектов, включенных в испытание, и анализом самооценок.

Значимость результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента для спаренных групп. Критерий применяют как к неисправленным значениям, так и к колебанию этих параметров в ходе испытания (значение выражено в отношении Т₀).

Независимо от рассматриваемой группы средняя масса оставалась стабильной в течение всей продолжительности исследования и, следовательно, вряд ли ответственна за колебания в измерении толщины подкожной жировой ткани бедер.

Выбранные условия исследования не дают возможности подтвердить значительный эффект похудения для композиции Am1: через 1 месяц применения наблюдалось уменьшение подкожной жировой ткани на 0,8% и через 2 месяца наблюдается уменьшение на 2,6%.

Композиция Аm2 дает возможность получить очень значительный эффект похудения с 28-х суток применения (р<10^-5): уменьшение подкожной жировой ткани, наблюдаемое с композицией Аm2, составляет -2,2% через 1 месяц и -4,3% через 2 месяца применения.

2) Измерение сантиметром.

Использовали протокол, приведенный ниже.

Количество субъектов: 39 женщин-добровольцев, разделенных на 2 группы: 20 получали композицию Am1 и 19 - композицию Аm2.

Продукты применяли дважды в сутки в течение 2 месяцев.

Оценку эффективности похудения осуществляли сантиметром в моменты времени Т₀, Т_28суток и T_56суток на уровне бедер (3 см ниже складки ягодиц) справа и слева.

Независимо от рассматриваемой группы средняя масса остается по существу постоянной на протяжении всего исследования и, следовательно, вряд ли ответственна за колебания замеров толщины подкожной жировой ткани различных исследуемых областей.

В таблице 1 представлены значимые результаты, полученные при измерении сантиметром.

Таблица 1
Результаты, полученные при измерении сантиметром. % субъектовИнтервал уменьшенияКОМПОЗИЦИЯ1 месяц2 месяца1 месяц2 месяцаКомпозиция Am130451-0,2 см1-2,0 смКомпозиция Аm272731-3,5 см1-2,5 см

Композиция Am2 имеет лучшую активность похудения против Т₀, чем композиция Am1, через один месяц применения.

Сравнение результатов, полученных после этих двух исследований, дает возможность установить заметное превосходство композиции Am2 перед ее плацебо, а также выявляет лучшее действие композиции Am2 по сравнению с композицией Am1.

Таким образом, несмотря на общую часть способа действия посредством веществ А+Б и их эффективность в отношении липолиза, сила полезных действий, получаемых с новой формулой Аm2, повышена за счет действия вещества В на поступление жирных кислот в адипоциты.

Комбинация этих действий, подкрепленная активностью в плане рекрутинга новых адипоцитов, дает возможность снизить важность имеющейся жировой ткани и предотвратить ее развитие.

При приготовлении композиций по настоящему изобретению, составленные таким образом экстракты смешивают с водными или неводными растворителями и с подходящими разбавителями, которые совместимы с местным применением, а также с активными компонентами этой композиции. Подходящие растворители и/или разбавители следует выбирать по их способности транспортировать активный компонент экстракта по изобретению в подкожный жировой слой.

Эти композиции обычно содержат эксципиенты или добавки, выбранные из ингредиентов, обычно используемых в предназначенных для местного применения композициях, в зависимости от требований конкретных рассматриваемых препаратов.

Они могут содержать, например, загустители, агенты, уменьшающие раздражение, смягчающие агенты, стабилизаторы, консерванты, агенты, предупреждающие вспенивание, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, красители и/или пигменты и отдушки.

Они также могут содержать другие активные компоненты, которые либо могут оказывать действие такого же типа, например продукты, которые вносят вклад в регулирование липолиза/липогенеза, или продукты, полезные в композиции для местного применения такого типа, такие как стимуляторы синтеза коллагена, ингибиторы коллагеназы или эластазы и сосудозащищающие агенты.

Косметические композиции по настоящему изобретению содержат вещества А, Б или В в количествах от 0,00001% до 5% по отношению к общей массе композиции, в форме смеси с эксципиентами, обычно используемыми для приготовления косметических препаратов, которые нужно наносить на кожу.

Указанные количества могут изменяться в пределах, указанных выше, в зависимости от активности, свойственной включенным в композицию компонентам. Предпочтительно, компоненты А, Б и В присутствуют в количествах от 0,0001% до 2%.

Предпочтительной формой композиций по изобретению является жидкость, которую наносят местно при помощи клейкого носителя, далее называемой "пластырь", причем этот пластырь дает возможность регулируемой диффузии активных компонентов.

Композиции по настоящему изобретению имеют хорошую стабильность, и их можно хранить в течение периода, необходимого для использования, при температурах между 0°С и 60°С без выпадения в осадок компонентов или разделения фаз либо снижения активности, которые могут ставить под угрозу их применение.

Эти композиции очень хорошо переносятся; они не обладают фототоксичностью, и нанесение их на кожу в течение длительных периодов не влечет за собой никакого побочного действия.

После первых применений кожный рельеф становится гладким, кожа становится более тонизированной и плотной. После применения в течение одного месяца появляется эффект похудения, вид "апельсиновой корки" визуально уменьшается, и фигура становится более худой.

Изобретение относится к фармацевтической химии, в частности к косметической композиции для похудения, содержащей, по меньшей мере, одно соединение, индуцирующее продуцирование IL-6 адипоцитами, в форме смеси с антагонистом NPY и/или антагонистом α2 и с эксципиентом для косметического препарата. Изобретение обеспечивает эффективность оттока жирных кислот, накопленных в адипоцитах, и обладает затормаживающим действием в отношении поступления жирных кислот, что приводит к эффекту похудения, при этом композиция имеет хорошую стабильность при хранении без снижения активности, не обладает побочными действиями. 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Косметическая композиция для похудения, содержащая по меньшей мере один компонент, индуцирующий продуцирование IL-6 адипоцитами, антагонист α2 и антагонист NPY в форме смеси с эксципиентом для косметических препаратов.2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что компонент, индуцирующий продуцирование IL-6 адипоцитами, выбран из непептидного синтезированного соединения, пептида, клеточного или тканевого экстракта животного или растительного происхождения и продукта, полученного при брожении, осуществляемом микроорганизмом.3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что компонент, индуцирующий продуцирование IL-6 адипоцитами, представляет собой продукт, полученный при брожении, осуществляемом микроорганизмом, выбранным из бактерий и грибов.4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что компонент, индуцирующий продуцирование IL-6 адипоцитами, может быть получен при брожении, осуществляемом штаммом Rhodotorula sp.5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что компонент, индуцирующий продуцирование IL-6 адипоцитами, может быть получен при брожении, осуществляемом штаммом Rhodotorula sp., депонированным в Национальной коллекции культур микроорганизмов (C.N.C.M.) Пастеровского института под номером I 1844, или одним из его мутантов-продуцентов.6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанные компоненты антагонист α2 или антагонист NPY выбраны из непептидных синтезированных продуктов, клеточных или тканевых экстрактов животного или растительного происхождения и продуктов, полученных при брожении, осуществляемом микроорганизмами.7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что компоненты антагонист α2 или антагонист NPY могут быть получены при брожении, осуществляемом микроорганизмами, выбранными из бактерий и грибов.8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что компонент антагонист α2, может быть получен при брожении, осуществляемом штаммом Bacillus licheniformis, депонированным в C.N.C.M. Пастеровского института под номером I 1778, или одним из его мутантов-продуцентов.9. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что компонент антагонист NPY может быть получен при брожении, осуществляемом штаммом Streptomyces sp., депонированным в C.N.C.M. Пастеровского института под номером I 1132, или одним из его мутантов-продуцентов.10. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что антагонист NPY, антагонист α2 и индуктор продуцирования IL-6 получены при брожении, осуществляемом соответственно штаммами I 1132, I 1778 и I 1844, депонированными в C.N.C.M. Пастеровского института.11. Композиция по п.1 для регуляции липолиза/липогенеза в коже.