ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИМУТАГЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области фармации, фармакогнозии, к лекарственным средствам, обладающим антимутагенным действием, и может быть использовано для снижения негативных последствий действия ионизирующей радиации, а также химических мутагенов.

Известны лекарственные препараты, обладающие аналогичным действием:

- растительного происхождения: водный и этанольный экстракты дудника лекарственного, водный экстракт крапивы двудомной, экстракт чеснока, масло облепихи крушиновидной, суспензионная культура женьшеня, экстракт радиолы розовой, экстракт элеутерококка колючего, экстракт на 70%-ном этаноле из фейхоа, экстракт шалфея лекарственного, глицирам, байкалинат-L-лизин, байкалинат-L-гистидин, экстракт полыни горькой [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7].

- полученные путем химического синтеза: цистофос, гаммафос, гумизол, димеркапрол, маннитол, томерзол, аспартам, новобиоцин, циклогексимид, пуромицин, празиквантель, ксимедон, йодантипирин, полигуацил, амиксин, ридостин, натрия оксибутират, лацидипин, бемитил, кофеин-бензоат натрия, аденозин, парааминобензойная кислота, токоферола ацетат, афобазол, аскорбилпальмитат, индометацин, бутилокситолуол, хлорамфеникол [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]. Одним из наиболее изученных в указанном отношении препаратов является йодантипирин, чей антимутагенный эффект в суммарной дозе 450 мг/кг превышает антимутагенное действие байкалинат-лизина (50 мг/кг), глицирама (50 мг/кг), ридостина (5 мг/кг), натрия оксибутирата (200 мг/кг), однако его применение может сопровождаться побочными реакциями, наличием противопоказаний к применению [15].

Наиболее близким к предлагаемому является лекарственное средство, содержащее водный экстракт из листьев крапивы двудомной [1]. Однако область его применения ограничена в связи с тем, что этот препарат оказывает антимутагенное действие не на все звенья мутагенеза, что, возможно, обусловлено недостаточным количеством входящих в него биологически активных веществ. В связи с этим имеется настоятельная необходимость в создании эффективного комплексного лекарственного средства, действие которого может быть направлено на все звенья мутагенеза [1, 6]. Таким требованиям могут отвечать средства в виде экстракционных препаратов из сложных лекарственных растительных сборов.

Новой технической задачей является расширение арсенала средств из природных источников биологически активных веществ, обладающих антимутагенной активностью. Поставленная задача решается новым лекарственным средством, обладающим антимутагенным действием на основе водного растительного экстракта из листьев крапивы двудомной, причем водный экстракт получен из сырья, в состав которого дополнительно входят цветки календулы лекарственной, семена льна посевного, трава хвоща полевого, корни одуванчика лекарственного, взятые в равном соотношении, вес.ч.:

корней одуванчика лекарственного (Radices Taraxaci officinalis) - 10 частей

листьев крапивы двудомной (Folia Urticae dioicae) - 10 частей

травы хвоща полевого (Herba Equiseti arvensis) - 10 частей

цветков календулы лекарственной (Flores Calendulae officinalis) - 10 частей

семян льна посевного (Semina Lini Usitatissimi) - 10 частей

Лекарственный растительный сбор с характерным запахом представляет собой смесь неоднородных частиц диаметром менее 6 мм (кусочков листьев, черешков, стеблей, ветвей, цветков, корней, семян) светло-зеленого, темно-зеленого, серовато-зеленого, серо-белого с темно-бурыми и желтыми вкраплениями, светло-коричневого, темно-коричневого, оранжевого, бледно-желтого, желто-коричневого оттенков цвета. При спектрофотометрическом анализе содержание суммы флавоноидов, в пересчете на кверцетин, составляет не менее 1%.

Состав предлагаемого лекарственного средства предложен на основании изучения банка данных литературы и результатов, проведенных экспериментальных испытаний.

Исследование влияния экстрактов лекарственных растений на частоту эритроцитов с микроядрами в периферической крови у мышей проводили методом микроядерного анализа [12].

Изучение результатов скрининговых исследований показало, что исследуемые экстракты проявили разные уровни антимутагенной активности. По данному признаку они были условно разделены на три группы.

К первой группе отнесены экстракты с низким уровнем антимутагенной активности, которые снижали число микроядер в эритроцитах до 3,83% (р<0,05) (в группе облученных животных без введения экстрактов число эритроцитов с микроядрами - 4,8%). В числе указанных источников сырья были представлены такие виды как - боярышник кроваво-красный, зверобой продырявленный, калина обыкновенная, клюква болотная, лабазник шестилопастной, можжевельник обыкновенный, рябина черноплодная, серпуха венценосная, хвощи болотный, зимующий, луговой, чага, чистотел большой, шиповник майский. Экстракты второй группы проявили более высокую активность, и снизили количество микроядер в эритроцитах в пределах до 2,95% (р<0,05). Такую активность проявили суммарные комплексы, полученные из сырья следующих видов: аир болотный, багульник болотный, донник лекарственный, лихнис халцедонский, лопух войлочный, мята перечная, облепиха крушиновидная, пижма обыкновенная, хвощ лесной, подорожник большой, полынь горькая, рябина обыкновенная, ряска малая, сушеница топяная, тмин обыкновенный, тысячелистник обыкновенный, черника обыкновенная, чеснок.

Наиболее выраженные антимутагенные свойства были установлены для экстрактов таких известных растений как: календула лекарственная (Calendula officinalis L.), крапива двудомная (Urtica dioica L.), лен обыкновенный (Linum usitatissimum L.), одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg.), хвощ полевой (Equisetum arvense L.).

Именно эффективность биологически активных комплексов растений последней группы послужила в дальнейшем основанием для составления на их основе сборов. При подборе компонентов сбора учитывались данные литературы о группах биологически активных веществ (БАВ), способных влиять на основные звенья мутационного процесса.

В дальнейшем для установления оптимального количественного сочетания компонентов было разработано несколько прописей сборов (табл.1), из которых впоследствии был выбран оптимальный вариант.

Критерием отбора служила антимутагенная активность водных экстрактов, полученных из сырья составленных сборов. Результаты испытаний представлены в таблице 2, из которой видно, что облучение мышей ионизирующей радиацией в дозе 1 Грей вызывает достоверное повышение числа эритроцитов с микроядрами в периферической крови до 4,96% (р<0,05) в первый день после облучения, в дальнейшем, на пятые сутки после воздействия мутагена, данный показатель снижается до 4,00% (р<0,05). На этом фоне введение водных экстрактов перед облучением приводило к уменьшению числа микроядер в пределах от 3,76 (в контроле 4,96) до 1,8% (в контроле 4,30) (р<0,05). Наиболее активным в результате эксперимента можно считать сбор №6, который при дозе 50 мг/кг, снизил в первый день после облучения кластогенную активность радиации в виде уменьшения количества микроядер до 1,82% (р<0,05). На третьи и пятые сутки снижение числа микроядер под влиянием водного экстракта из сбора №6 составляло 1,80 и 1,92% (р<0,05) соответственно. Близкий уровень антикластогенной активности был установлен для сбора №1 в дозе 100 мг/кг, чье антикластогенное действие более выражено на ранних сроках эксперимента. Остальные виды экстрактов из сборов лекарственного растительного сырья (№2, 3, 4, 5) показали в эксперименте близкие уровни активности, выраженные в способности снижать число микроядер в эритроцитах в пределах до 2,50% (в контроле 4,96) (р<0,01).

После анализа полученных данных был сделан вывод о том, что лекарственное средство - экстракт из сбора №6 обладает выраженными антимутагенными свойствами, что отмечается в его способности снижать частоту индуцированных ионизирующим излучением микроядер в периферической крови мышей.

При исследовании острой токсичности предлагаемого лекарственного средства проводили эксперименты на 10 беспородных белых мышах-самцах средней массой 18-20 г. Экстракт вводили в желудок через зонд в виде водного раствора в дозах от 5000 до 10000 мг/кг. При наблюдении в течение 14 суток у животных не отмечали изменений поведенческих реакций, признаков диареи, каких-либо других токсических патофизиологических проявлений. Гибель животных не наступила. Следовательно, экстракт из сбора согласно ГОСТ 121007-76 (Государственный стандарт на вредные вещества) можно отнести к 4 классу: "вещества малоопасные".

С целью выявления возможных механизмов антимутагенного действия разработанной прописи лекарственного средства, было изучено его влияние на изменение ДНК-репаративных процессов в культурах Т-лимфоцитов человека [16].

Активность репарационной системы ДНК исследовали с помощью метода сцинтилляционной радиометрии. Исследование проводили на культуре клеток Т-лимфоцитов человека, которые культивировали по общепринятой методике [17].

Результаты изучения последствий стимуляции ДНК-репарации УФ-облучением и введением 4-нитрохинолин-1-оксида, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что индекс стимуляции различен при введении витамина А и лекарственного средства. Если витамин А практически слабо влиял на этот показатель, преимущественно в сторону его снижения, то при введении лекарственного средства этот показатель был достоверно выше, чем в контроле: 5,7±1,1 при стимуляции УФ-лучами (в контроле 2,9±0,4) и 7,6±1,8 при стимуляции 4-нитрохинолин-1-оксидом - (в контроле 3,2±0,4). Таким образом, описанные данные позволяют предполагать, что именно способность к активации ДНК-репаративных процессов может лежать в основе антимутагенного эффекта предлагаемого лекарственного средства.

Кроме того, было изучено влияние лекарственного средства на цитогенетические и кариопатологические последствия воздействия кластогенных факторов на ядерные структуры клеток человека и животных в условиях in vivo in vitro.

Изучение хромосом проводили при увеличении 10×90, используя микроскоп МБИ-6. Для анализа отбирали метафазы с учетом предложений Н.П.Бочкова [18]. Для идентификации хромосом человека использовалась система классификации хромосом, принятая в 1971 году в Париже и дополненная в 1975 [19]. При анализе кариотипа во всех случаях, на каждый срок и вид эксперимента, а также в контролях использовали группу из 10 особей, у каждого животного и человека изучено не менее 100 метафаз. Из структурных нарушений хромосом учитывались хроматидные и хромосомные разрывы, ацентрические одиночные и парные фрагменты и обмены. Кроме того, учитывались аномалии в числе хромосом: анеуплоидные (гипо- и гиперплоидные) и полиплоидные клетки.

В результате было установлено, что наиболее значительное уменьшение числа клеток с нарушениями в структуре и числе хромосом наблюдается при введении лекарственного средства в течение 10, 15 и 30 сут. Так, если вводить лекарственное средство в течение 10 сут. до облучения, то число клеток с нарушениями в структуре хромосом после облучения составляет 3,6±0,9%, а число клеток с измененным числом хромосом - 3,6±0,6%, т.е. снижается до уровня, близкого контрольному (Р>0,05).

Таким образом, был сделан вывод, что предлагаемое лекарственное средство - экстракт из лекарственных растений и витамин А (выступавший в качестве препарата сравнения), обладают антимутагенными свойствами против поражений, вызываемых в цитогенетическом аппарате клеток костного мозга мышей облучением рентгеновскими лучами. Наиболее эффективно в этом отношении предлагаемое лекарственное средство. Механизм действия указанных препаратов против мутагенного действия рентгеновских лучей может быть чрезвычайно разносторонним: это и влияние на иммунную систему, и на обмен нуклеиновых кислот, и, как следствие, на митотический цикл, и на обмен белков, а через это на ферментативную активность клеток и аппарат деления.

Доминирующими биологически активными веществами лекарственного средства являются: полисахариды, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, витамины, микроэлементы.

Полисахариды лекарственного средства способны взаимодействовать с мутагенами вне клетки и снижать таким образом генотоксический эффект. Они способны ингибировать мутагенез и канцерогенез в кишечнике у крыс, вызванный азоксиметаном и диметилгидразином, сдвигая метаболизм в сторону детоксикации [6, 8, 21].

Флавоноиды обладают Р-витаминной активностью, проявляют себя как антиоксиданты, синергичные с аскорбиновой кислотой; способны связать тяжелые металлы, угнетают перекисное окисление липидов, блокируют связывание активных форм мутагенов с ДНК и угнетают свобонорадикальные реакции. Входящий в лекарственное средство рутин существенно снижает уровень клеток с хромосомными аберрациями у пациентов с анемией Фанкони и, следовательно, проявляет антимутагенную активность. Кверцитин и кемпферол, также входящие в состав лекарственного средства, способны уменьшать повреждающее ДНК действие пищевых мутагенов, являющихся производными индола и хиноксалина, в лимфоцитах [1, 6, 8, 21, 22].

Фенолкарбоновые кислоты лекарственного средства оказывают антиоксидантный эффект, что также вносит вклад в антимутагенное действие сбора.

Эскулетин и умбеллиферон, входящие в лекарственное средство кумарины, также обладают антимутагенными свойствами [1].

Дубильные вещества содержат большое число фенольных ОН-групп и способны образовывать прочные связи с белками и некоторыми биополимерами, а также связывать в организме бактериальные токсины и ядовитые соли Ag, Hg, Pb и снижать спонтанную, индуцированную мутабильность [1, 6, 22].

Витамины, содержащиеся в лекарственное средство, проявляют существенную антимутагенную активность. К ним следует отнести аскорбиновую кислоту, которая как сильный антиоксидант обладает выраженной способностью снижать действие мутагенов разных классов, - в первую очередь - свободных радикалов. Эпидемиологические наблюдения показывают обратную корреляцию между потреблением витамина С и риском заболевания раком [8]. Главный вклад в антимутагенное действие β-каротина, также вносит его антиоксидантная активность, способность к гашению липидных супероксидрадикалов и прерыванию свободнорадикальных процессов. Антимутагенный эффект бета-каротина в ряде случаев превосходит другие витамины. Поступающий с пищей он предотвращает химическую индукцию опухолей у грызунов [5, 6, 8].

Хлорофилл и его водорастворимый дериват хлорофиллин обладают выраженной способностью блокировать активацию промутагенов ферментами микросом, а также образовывать неактивные комплексы с мутагенами и нейтрализовывать свободные радикалы [1, 6].

Из химических элементов, представленных в лекарственном средстве, важный вклад в антимутагенез вносят селен, кальций и кобальт [23].

Таким образом, предлагаемое лекарственное средство, содержащее комплекс биологически активных веществ из листьев крапивы двудомной, корней одуванчика лекарственного, семян льна посевного, травы хвоща полевого и цветков календулы лекарственной может применяться как антимутагенное средство.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бариляк И.Р. Антимутагенные и генопротекторные свойства препаратов растительного происхождения / И.Р.Бариляк, А.В.Исаева // Цитология и генетика. - 1994 / №3. - С.3-17.

2. Гусейнов М.Б. Изучение антимутагенной активности экстракта из плодов фейхоа / М.Б.Гусейнов: Автореф. дис... канд.биол.наук. - Баку, 1992. -11с.

3. Салихова Р.А. Изучение антимутагенных свойств дудника лекарственного (angelica archahgelica L.) микроядерным тестом / Р.А. Салихова., Ш.Н. Дулатова., Г.Г, Порошенко. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - Москва, Медицина. - 1993. -№4. - С.371-372.

4. Стрельчук С.И. Противомутагенное действие экстрактов элеутерококка на растениях, обработанных этиленметансульфонатом / С.И.Стрельчук // Цитология и генетика. 1987. Т.21. №2. - С. 136.

5. Худолей В.В. Антимутагены и профилактика рака / Худолей В.В., Мизгирев И.В., Майорова И.Г.// Актуальные вопросы онкологии - Сборник научных трудов, посвященных пятнадцатилетию кафедры онкологии АГМИ. - Барнаул - 1992. - С.66-88.

6. Шлянкевич М.А. Использование пищевых продуктов и лекарственных растений для профилактики злокачественных опухолей / Шлянкевич М.А., Сергеев А.В., Голубева З.Ф. // Актуальные вопросы онкологии - Сборник научных трудов, посвященных пятнадцатилетию кафедры онкологии АГМИ. - Барнаул - 1992. С.109-140.

7. Lim-Sylianco C.Y., Concha J.A., Jocano A.P. Antimutagenic effect of expressions from twelve medicinal plants // Philip. J. Sci. - 1986. - 115, №1. - Р.23-30.

8. Дурнев А.Д. Модификация мутационного процесса в клетках человека / А.Д.Дурнев// Вестник РАМН. - 2001. - №10. - С.70-77.

9. Гончарова Р.И. Антимутагенез как генетический процесс / Р.И.Гончарова // Вестник РАМН. М. Медицина - 1993. - №1. - С.26-33.

10. Жанатаев А.К. Сравнительное изучение антимутагенной активности афобазола при различных режимах введения / А.К.Жанатаев, А.Д.Дурнев, С.Б.Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2000. Том 130, №11. - С.539-542.

11. Карпова О.А. Изучение антимутагенной активности гипоксена in vivo / О.А.Карпова, Л.В.Михина, А.А.Денисов, М.К.Кузьмич // Эксперим. и клин. фармакол. - 2002. - Т.65. - №3. С.54-56.

12. Ильинских Н.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность / Н.Н.Ильинских, В.В,Новицкий, Н.Н.Ванчугова, И.Н.Ильинских. - Томск, 1992. - 272 с.

13. Кулакова А.В. Изучение мутагенной и антимутагенной активности новых фармакологических препаратов, обладающих мембранотропными свойствами / А.В.Кулакова: Автореф.дис...канд.биол. наук. - Москва, 1998. - 23 с.

14. Нестерова Е.В. Модификация лацидипином кластогенного эффекта диоксидина in vivo / Е.В.Нестерова, А.Д.Дурнев, С.Б.Середенин // Эксперим. и клин. фармакол. - 2000. - Т.63. - №4. С.48-52.

15. Терновая С.В. Фармакологическая защита генома кроветворных клеток при действии циклофосфана в эксперименте / С.В.Терновая: Автореф.дис...канд.мед. наук. - Томск, 2001. - 24 с.

16. Засухина Г.Д. Репаративные механизмы клеток и проблемы окружающей среды / Г.Д.Засухина. - М.: Наука, 1979. - 183 с.

17. Chromosomal peripherations of leukocytes cultured from human peripheral blood / P.S.Moorchead, P.C.Nowell, W.J.Mellman et al. // Exp. Cell Res. 1960, v.20, p.613-616.

18. Бочков Н.П. Генетика человека (наследственность и патология) / Н.П.Бочков. - М., Медицина, 1978, 377 с.

19. Хромосомы человека (атлас). / А.Ф.Захаров, В.А.Бенюш, Н.П.Кулешов, Л.И.Барановская // М., Медицина, - 1982, 264 с.

20. Семенов В.В. Количественные и качественные критерии оценки эффективности антимутагенов в эксперименте / В.В.Семенов, И.А.Студенцова // Вестник РАМН. - Москва, Медицина. - 1993. - №3. - C.16-20.

21. Дурнев А.Д. Фармакологические проблемы поиска и применения антимутагенов / А.Д.Дурнев, С.Б.Середенин // Вестник РАМН. - Москва.: Медицина. - 1993. - №1. - С.19-25.

22. Stoner G.D., Mukhtar H. Polyphenols as cancer chemopreventive agents / Cell Biochemistry Supply 1995; 22: 169-80.

23. Bronzetti G., Aretini P., Ambrosini C., Cini M., Fiorio R., Caltavuturo L., Croce C.D, Panunzio M. Antimutagenesis studies of magnesium and calcium salts / Environmental Pathology Toxicology Oncology 2000; 19(4): 401-13.

Таблица 1
Количественное соотношение компонентов прописей сборовЛекарственноеМассовых частей растениярастениеСбор №1Сбор №2Сбор №3Сбор №4Сбор №5Сбор №6Календула лекарственная512341Одуванчик лекарственный451231Крапива двудомная345121Хвощ полевой234511Лен обыкновенный123451

Таблица 3
Уровень активности эксцизионных ДНК-репаративных процессов в культурах Т-лимфоцитов здоровых доноров после введения экстракта из лекарственных растений и витамина АПоказателиКонтрольБольныепосле введения витамина Апосле введения экстрактаИндекс стимуляции ДНК-УФ2,9±0,42,2±0,2*5,7±1,1*репаративной активности (в усл.ед.)4-НХО (4-нитрохинолин-1-оксид)3,2±0,42,0±0,3*7,6±1,8** - отмечены значения достоверно отличающиеся от контроля * - при р<0.05

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию препарата на природной основе в качестве антимутагенного средства. Лекарственное средство, обладающее антимутагенным действием на основе водного экстракта из листьев крапивы двудомной, отличается тем, что водный экстракт получен из сырья, в состав которого дополнительно входят корни одуванчика лекарственного, трава хвоща полевого, цветки календулы лекарственной, семена льна посевного, взятые в равном соотношении. Препарат снижает негативные действия ионизирующей радиации и химических мутагенов. 3 табл.

Лекарственное средство, обладающее антимутагенным действием на основе водного экстракта из листьев крапивы двудомной, отличающееся тем, что водный экстракт получен из сырья, в состав которого дополнительно входят корни одуванчика лекарственного, трава хвоща полевого, цветки календулы лекарственной, семена льна посевного, взятые в равном соотношении, вес.ч.:

Корни одуванчика лекарственного10Листья крапивы двудомной10Трава хвоща полевого10Цветки календулы лекарственной10Семена льна посевного10