Биологически активное средство, обладающее антимутагенным действием Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61K36/9066 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности, к биологически активным средствам, обладающим антимутагенным действием, и может быть использовано для снижения негативных последствий действия ионизирующей радиации, а также радиомиметиков -радиотоксинов.

Известно лекарственное средство, обладающее антимутагенным действием на основе водного экстракта из листьев крапивы двудомной, корней одуванчика лекарственного, травы хвоща полевого, цветков календулы лекарственной, семян льна посевного, взятые с равным соотношении (Патент RU №2258528, МПК А61К 35/78, Опубл. 20.08.2005 Бюл. №23).

Недостатком предложенного средства является то, что препарат оказывает антимутагенное действие не на все звенья мутагенеза, в частности, на антиоксидантную систему организма и на содержание свободных (токсических) радикалов в клетке, что объясняется слабым потенциалом синтеза антиоксидантных ферментов: супероксидимутазы, катал азы и пероксидазы.

До недавнего времени основным источником антимутагенов - агентов, снижающих уровень индуцированных и спонтанных мутаций, служили растения, некоторые морские животные и соединения, полученные химическим путем. Оказалось, что клетки многих исследованных пропионовокислых бактерий, а также выделяемые ими в среду внеклеточные соединения белковой природы, более чем на 90% снижают вредное воздействие веществ, вызывающих внутригенные мутации, которые могут приводить к образованию поврежденных белков, либо к полному отсутствиюих синтеза. Обнаружение антимутагенных свойств пропионовых бактерий открывает новые области их применения как профилактических средств, которые могут быть использованы в пищевых продуктах для людей и в кормах для животных (Vorobjeva L.I., Khodjaev E.Y., Vorobjeva N.V., Propionic acid bacteria as probiotics, Microb. Ecol. Health Dis. 20 (2008) 109-112).

Штаммы P. shermani отличаются наиболее высокой антимутагенной активностью в отношении мутагенов, вызывающих как точковые мутации, так и мутации сдвига рамки считывания (9-аминоакридин) (Vorobjeva L.I., Iljasova O.V., Khodjaev E.Y., Ponomareva G.V., Varioukhina S.Y., Inhibition of induced mutagenesis in Salmonella typhimurium by the protein of Propionibacterium freudenreichii subsp.Shermani, Anaerobe 7 (2001) 37-44).

С этого момента появилось новое перспективное направление -изучение бактериального антимутагенеза.

Экстракты клеток и культуральная жидкость P. Freudenreichii обладают биоантимутагенными и десмутагенными свойствами (антиканцерогенными) (Vorobjeva L.I., Khodjaev E.Y., Cherdinceva Т.А., Antimutagenic and reactivative activities of dairy propionibacteria, Lait 75 (1995) 473-487; Vorobjeva L. Physiological peculiarities of propionibacteria - present facts and prospective applications // Sci Progress. - 2000. - V. 83. - N 3. - P. 277-301).

Что касается пропионовокислых бактерий, то эти микроорганизмы просто поразили лабильностью своего метаболизма. В результате его изучения у пропионовокислых бактерий установлены функционирующая цепь переноса электронов (ЦПЭ), кислородное, фумаратное, нитратное дыхание, система антиокислительной защиты. Исследования продемонстрировали, что пропионовокислые бактерии экипированы как для анаэробной, так и для аэробной жизни. Оказалось, что анаэробные представители семейства образуют значительные количества супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, ферментов, характерных для аэробного метаболизма, и могут сегодня рассматриваться как самыеперспективные источники антиоксидантов ферментативной природы Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - М: СпецЛит., 2009. - 772 с).

Каталаза, пероксидазы, супероксиддисмутаза (СОД), система ДНК-репарации, а также различные субстраты, участвующие в нейтрализации свободных радикалов, составляют антиоксидантную ферментную систему микроорганизмов. На основании изложенного можно сделать вывод, что антиоксидантная ферментная система дружественных нам бактерий также играет огромную роль в защите клеток нашего организма от постоянных и многочисленных атак свободными радикалами кислорода. Антиоксидантные ферменты (АОФ) микроорганизмов, препятствуя запуску процессов цепного окисления, предотвращают в т.ч. и процессы разрушения ДНК свободными радикалами, которые в свою очередь провоцируют процессы мутации (мутагенез) (Воробьева Л.И. и др. Антимутагенное действие супероксиддисмутазы индуцированный ацидом натрия мутагенез у Salmonella typhinutium // генетика. - 1993. - №29. - №5. С. 760-767).

Итак, передовой линией защиты от токсического действия производных О₂ является ферменты: супероксиддисмутаза захватывающая молекулы О₂-, каталаза и пероксидаза, улавливающие H₂O₂. Они сводят до минимума концентрацию в клетке О₂- и H₂O₂ и не дают им возможности взаимодействовать с образованием гидрольного радикала ОН*, превосходящего супероксидный радикал O₂- по окислительной активности и токсичности.

1. Супероксиддисмутаза (СОД) является одним из главных ферментов антиоксидантной системы. Супероксиддисмутаза катализирует превращение супероксидного радикала О₂-, который образуется первым из активных форм кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи, в менее токсичную перекись водорода (Н₂О₂) и кислорода (О₂):

2О₂^-+2Н⁺→Н₂О₂+О₂

_{Скорость этой реакции в 10 000 раз выше, чем химического дисмутирования. Дисмутирование супероксида О2^- в перекись водорода Н2О2 с помощью СОД часто называют первичной защитой, т.к. этот фермент предотвращает дальнейшее образование свободных радикалов.}

Перекись водорода (Н₂О₂) - наиболее стабильный из промежуточных продуктов восстановления О₂ и наименее реакционноспособный. Однако, из перекиси водорода может образоваться весьма сильный окислитель Супероксид-анион О₂^- может взаимодействовать с Н₂О₂ с образованием гидроксидного радикала ОН*, превосходящего О₂^- по окислительной активности и токсичности:

О₂^-+Н₂О₂+Н⁺переходит в О₂+H₂O+Н*

Источником возникновения ОН могут служить также реакции одноэлектронного окисления перекиси водорода, катализируемые железосодержащими соединениями, всегда имеющимися в клетках:

Н₂О₂+Fe²⁺переходит в Fe³⁺+ОН^-+ОН*

Иными словами, избыточное накопление перекиси водорода Н₂О₂ очень токсично, особенно для нефагоцитирующих клеток. Накопление пероксидов и генерация свободных радикалов может приводить к повреждению мембран (рак, атеросклероз).

Поэтому каталаза и пероксидаза сводят до минимума концентрацию в клетке супероксидного радикала О₂^- и перекиси водорода Н₂О₂ и не дают им возможности взаимодействовать с образованием гидроксильного радикала ОН* (Курбанов А.И. Внутриклеточное антиоксидантные ферменты Candida albicaus при фагоцитозе макрофагами // Проблемы медицинской микологии. - 2005. Т7. - №2. - С. 105-106).

Некоторые микроорганизмы симбионтной микрофлоры, участвующие в биосинтезе антиоксидантных ферментов, нейтрализуют свободные радикалы и тем самым помогают устранить причины разрушения ДНК, провоцирующие мутагенез и замедлить процесс старения.

Бактерии, как источник антимутагенов, представляют несомненный интерес, как профилактические пищевые добавки для активации, естественны систем репарации и для создания медицинских препаратов нового типа с антимутагенными свойствами. Устранение свободных радикалов в клетке, способных вызывать повреждения ДНК, тесно связано с системой репарации (Moussavi М., Adams М.С., An in vitro study on bacterial growth interactions and intestinal epithelial cell adhesion characteristics of probiotic combinations, Curr. Microbiol. 60 (2010) 327-335).

2. Пероксидазы (peroxidases, лат.Per - сверх и греч. oxys - кислый) -группа окислительно-восстановительных ферментов класса оксидоредуктаз, использующих в качестве акцептора электронов перекись водорода (Н₂О₂).

Простетической группой пероксидаз (т.е. небелковым и не производным от аминокислот компонентом, ковалентно связанным белком) является протогем, т.е. пероксидазы - сложные белки-гемопротеиды, активным центром которых является железо гема. Ферменты этого типа широко представлены у растений, а также встречаются в молоке, лейкоцитах, тромбоцитах и тканях, продуцирующих эйкозаноиды.

Пероксидазы найдены в тканях человека и животных, в бактериях и растениях. Субстратами пероксидаз служат полифенолы, ароматические амины, аскорбиновая кислота и т.д., а донаторами кислорода, наряду с Н₂О₂, могут быть органические перекиси.

Н₂О₂+RH₂→2H₂O+R, где RH₂ - аскорбиновая кислота, хиноны, цитохром С, глутатион. В эритроцитах и некоторых других тканях присутствует глутатионпероксидаза, содержащая Se в качестве простетической группы. Этот фермент защищает мембраны и гемоглобин от окисления пероксидами (Mycobakterium tuberculosis catalosis and peroxidase activities and resistance to oxidative killing in human monocytes// C.Manca, S.Paul et.al.//Inffec. Immun.-1999.-V. 67.-P. 74-79).

3. Фермент-каталаза - это фермент, являющийся гемопротеином (4 гема) и катализатором в реакции разложения перекиси водорода, при которой образуются вода и молекулярный кислород:

Н₂О₂+Н₂О₂=О₂+2H₂O.

Эта реакция напоминает пероксидазную, только вместе RH₂ используется Н₂О₂.

Каталазу находят в крови, костном мозге, слизистых оболочках, печени, почках, т.е. в клетках, где происходит интенсивное окисление с образованием Н₂О₂, также является радикалом и оказывает повреждающее действие, в клетке происходит ее постоянная инактивация ферментом каталазой. Каталаза катализирует расщепление перекиси водорода Н₂О₂ до молекул воды и кислорода и может разложить 44 000 молекул Н₂О₂ в секунду.

Биологическое значение каталазы заключается именно в разложении перекиси водорода, которая образуется в клетках при воздействии ряда флавопротеиновых оксидаз, чем обеспечивается действенная защита клеточных структур от разрушения, которое осуществляет перекись водорода. Если вследствие генетических причин, возникает дефицит каталазы, развивается акаталазия. Это наследственная болезнь, клиническими проявлениями которой являются изъявления слизистой носа и полости рта, а в некоторых случаях явно выраженное выпадение зубов и атрофические изменения альвеолярных перегородок (Брудастов Ю.Н. и др. Активность каталазы и супероксиддисмутазы Staphylococcus aureus при их переспектировании в микроорганизме // Журнал Микробиол.-2001.-№2.-е. 13-16).

Известно, также лекарственное средство фитогенного происхождения - куркума, обладающая радиозащитным, антиоксидантным, противоопухолевым и антимутантным эффектом (Xu P., Yoo Y., Guo P. et al. Curenmin protect rat heat mitochondriae against anoxia - reoxygenation induced oxidative injinry // Can.J.Physiol. Pharmacol.-2013.-Sep. 91 (9). P. 715-723; Кароматов И.Д. Противовоспалительные, антиоксидантные, иммуномодулирующие свойства куркумы // Электрон Научный журнал «Биология и интегративная медицина».-2018.-№2.-С. 117-131).

Куркума - многолетнее растение семейства имбирных, родом из юго-западной Индии. Уникальный химический состав куркумы делает эту специю очень полезной для организма при множестве различных заболеваний. Это замечательное растение уже около 4 000 лет используется в качестве лекарственного средства при многих заболеваниях и расстройствах здоровья.

Из куркумы выделено более 100 компонентов. Наиболее изученным активным веществом этого лекарственного растения является куркумин. Важно знать, что в подавляющем большинстве случаев исследований куркумы, исследовали не саму пряность, а именно куркумин. Когда говорят о преимуществах этой специи, скорее всего речь идет о преимуществах куркумина.

В составе куркумы присутствуют:

- куркумор - активное вещество, способное подавлять рост злокачественных образований в матке, коже и молочной железе;

- цинеол - окись метана, моноциклический терпен обладает антипаразитарным свойством, благотворно влияет на работу желудка и уничтожает патогенную микрофлору;

- тумерон - ароматическое вещество, которое вместе с цинеолом выводит из организма паразитов и подавляет рост болезнетворных бактерий.

В состав куркумы входят витамины группы В (B₁, В₂, В₃, В₆, В₁₂), С, Е и К, макроэлементы калий, кальций, магний, фосфор, натрий и микроэлементы: железо, марганец, медь, селен, цинк.

Куркума обладает: противовоспалительным действием - ингибирует молекулы, участвующие в воспалении. Регулирует факторы транскрипции, цитокины, протеинкиназы, молекулы адгезии, ферменты, связанные с воспалением, что позволяет предположить его потенциал в профилактике илечении воспалительных заболеваний; противоопухолевым (показана способность куркумина вызывать апоптоз раковых клеток без цитоксического действия на здоровые клетки), а также антибактериальным, антидепрессивным (ингибирует моноаминоксидазу) и гепатопротекторным действием.

Как показали опыты, очищенный куркумин, по некоторым показателям (защита от инкорпорированного облучения), значительно уступает неочищенному (нативному) варианту куркумы.

Вышеизложенное находит свое подтверждение результатами исследований в радиационной фармакологии, согласно которых радиозащитный эффект (РЗЭ) ряда препаратов (грубых вытяжек малоочищенных экстрактов и соков из растительного сырья) может быть связан с влиянием на организм не только одного, но и многих компонентов биологически активных веществ, находящихся подчас во взаимодополняющем или усиливающим взаимодействии, сбалансированных природой биогенных соединений (Ю.Б. Кудряшов, Е.Н. Гончаренко. Современные проблемы противолучевой химической защиты организмов // Материалы Вс. конференции с международным участием «Проблемы противолучевой защиты», г. Москва 16-17 ноября 1998 / Радиационная биология, радиоэкология, 1999. - Т. 39. - №2-3. - С. 197-211).

Кроме того, установлено, что пищевые волокна, флавоноиды, микро- и макроэлементы растений оказывают существенное влияние на синтез белка (всасывание, накопление и выведение радиоэлементов из организма) (В.Н. Корзун и др. Растительные волокна - блокаторы радиостронция и радиоцезия // Материалы IV Съезда по радиационным исследованиям. - М., 2001. - С.453).

При этом известно, что содержание куркумина в сырой куркуме составляет всего 2-5%, т.е. отход составляет 95-98%, что ведет к значительной потере биологически активных компонентов во время очистки технологического сырья.

Следовательно, применение куркумы в натуральном виде является более эффективным и целесообразным, чем в очищенном виде - куркумина, поэтому мы изыскивали возможность ее применения в нативном виде, для парентерального введения. При этом возникла проблема с растворимостью куркумы, поскольку она в воде, спирте не растворяется, что исключает возможность парентерального введения препарата.

На сегодняшний день имеется огромное количество положительных результатов использования куркумы в качестве радиационной защиты организма, подтверждающих, что механизм радиопротекторного действия связан со снижением радиоиндуцированного стресса.

Другим важнейшим для клиники свойством куркумы является противоопухолевое и антимутагенное действие (Aggawal D.R., Kumar А., Bharti А,С.Anticancer protential of curonmin: preclinical and clinical studies //Anticancer Res.,- 2003.-V. 23.-P. 363-398). Результаты многочисленных исследований в области онкологии показали, что основным механизмом действия куркумы в онкогенезе, мутагенезе и радиотоксикозе является ингибирование факторов транскрипции NF-KB (Orr W.S., Denbo I.W.Saab K.R. et al. Curancumin potentiates rhabdomyosarcoma radiosensitivity by supressing NF- u В antivity//PLoS One - 2013,-V. 8.-203-208).

Однако, что весьма важно, биодоступность остается проблемой для куркумы. Был предложен способ получения биологического препарата-радиопротектора путем выращивания бифидобактерий (B.bifidum) на среде Блаурокка в анаэробных условиях, удаления микробных клеток центрифугированием, растворения в супернатанте порошка куркумы до получения 0,5%-ной суспензии, однократное подкожное введение которого защищало более 70% летально облученных животных от радиационной гибели (Патент RU №2760551, МПК А61К 36/9066, Опубл. 29.11.2021. Бюл. № 34). Несмотря на высокую радиозащитную эффективность известного препарата, и хотя и решена основная проблема - повышение биодоступностикуркумы, однако, его недостатком является слабая антиоксидантная и антимутагенная защита.

Новой технической задачей является расширение арсенала средств из природных источников биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной и антимутагенной активностью.

Поставленная задача решается новым биологически активным средством, обладающим антимутагенным действием на основе культуральной жидкости бифидобактерий, в которой растворен порошок куркумы в концентрации 0,5%, отличающееся тем, что в состав дополнительно входят: клеточная биомасса пропионовокислых бактерий и культуральная жидкость пропионовокислых бактерий, наночастицы бентонита, взятых в следующем соотношении: культуральная жидкость бифидобактерий, содержащая 0,5% порошка куркумы - 49 частей, культуральная жидкость пропионовокислых бактерий, содержащая 1×10¹² КОЕ/см³ 49 частей, наночастицы бентонита, внесенные в среду культивирования пропионовокислых бактерий из расчета 0,5 г/л - 2 части.

Состав заявляемого средства предложен на основании данных изученной научной информации и результатов, полученных экспериментальным путем.

Биологически активное средство, обладающее антимутагенными свойствами, получают следующим образом.

В качестве источника культуральной жидкости используют коммерческий препарат «Бифидумбактерин сухой», изготовленный на предприятиях ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова.

На 1-м этапе работы получают культуральную жидкость бифидобактерий. Для этого во флаконы емкостью 400-500³ см с питательной средой Блаурокка засевают культуру В. bifidum в дозе 1×10⁸ КОЕ/см³ и выращивают в течение 72 часов при температуре 37°С. Культуральную жидкость трех-суточной культуры бифидобактерий освобождают от биомассы центрифугированием при числе оборотов 3 500 об/мин в течение10 минут, центрифугат удаляют, а супернатант используют в качестве суспензиообразующей жидкости для растворения фитопрепарата - куркумы.

Для получения суспензии куркумы используют порошок куркумы производства компании «Проксима» (Россия, г. Новосибирск) ГОСТ ISO 5562-2017, который взвешивают по 0,5; 1,0;1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0; 4,5; 5,0 г, вносят во флаконы емкостью 200 см и заливают культуральной жидкостью В. bifidum в количестве 99,5; 99,0; 98,5; 98,0; 97,0; 96,5; 95,0 см³ соответственно, получая при этом 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,5%; 3,0%; 3,5%; 4,0%; 5,0% -ные суспензии куркумы соответственно. Полученные смеси куркумы и культуральной жидкости тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 часов, контролируя степень оседания порошка куркумы на дно флаконов. Степень суспензеобразования оценивают визуально и микроскопически. Устанавливают, что за указанные экспозиции оседания порошка на дно флаконов не происходит, поскольку в указанных соотношениях компонентов образуется стабильная суспензия куркумы. Результаты микроскопирования показывают, что размеры суспензиеобразующих частиц порошка куркумы составляют 60-90 мкм, что вполне допустимо для использования суспензии куркумы в виде инъекционной жидкости.

Для получения второго компонента предлагаемого средства, культуральной жидкости пропионовокислых бактерий, использовали коммерческий препарат - пропионовокислые бактерии Propionibacterii shermani, изготовитель ООО «Пропионикс».

Для наращивания биомассы пропионовокислых бактерий, во флаконы емкостью 400-500 см³ с питательной средой, содержащей (в граммах) сыворотку творожную - 1000,0; магний хлористый - 0,3; натрий лимоннокислый трех-замещенный - 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5; аскорбиновую кислоту - 0,1 и агар микробиологической - 1,3; засевают культуру P.shermani в дозах 3×10⁶, 8×10⁶, 1×10⁷ КОЕ/см³ и выращивают в течение 24 ч при температуре 30±1 °С. Поистечении указанной экспозиции в культуральной среде определяют концентрацию микробных клеток путем титрования и спектрофотометрирования микробной суспензии по оптической плотности.

Результаты исследований показали, что с увеличением дозы инокулята (посевной дозы) интенсивность нарастания биомассы увеличивается. Так, при увеличении посевной дозы с 3×10⁶ до 8×10⁶ значение оптической плотности резко возрастает с 4,1 до 6,0, что соответствует концентрации микробов 8×10⁸ до 3×10¹⁰ КОЕ/см³.

Поскольку между концентрацией метаболитов в культуральной жидкости и концентрацией (урожаем) биомассы существует прямо пропорциональная зависимость, которые описывается уравнением

Dp/dt=qpx,

где рх - концентрация биомассы,

a qp - удельная скорость образования продукта

(Pirt S. I. Principals of Microbe and Cell Cultivation.-Oxford, London, Edinnburg, Melbourne: Brackwell Scientific Publications, 1975, 312p.).

Следовательно, количество образованного продукта, в том числе антиоксидатного фермента супероксиддисмутазы (СОД), прямо пропорционально образованной биомассе, возникала необходимость использования активаторов роста и метаболизма пропионовокислых бактерий в растущей культуре.

При проведении этих исследований мы исходили из того, что при ферментации творожной сыворотки, входящей в основной компонент питательной среды для культивировании P. shermani, в присутствии бентонита происходит наибольший выход биомассы и метаболитов, в njv числе - СОД (hats:market jandex propionix ru/ propionovokislye - bakteri), наши исследования были направлены на изучение влияния бентонита на выход биомассы и на синтез антиоксидантного фермента - супероксидисмутазы.

Поскольку термохимическая обработка бентонита не обеспечивает его высокую сорбционную активность из-за слабой дисперсности частиц (размерчастиц составляет 0,01 - 0,0009 мм), для повышения дисперсности термоактивированного природного минерала, его подвергали ультразвуковой обработке на установке УЗУ-0,25 при частоте 18,3 кГц, выходной мощности установки 80 Вт и амплитуде колебаний ультразвукового волновода 5 мкм (Патент RU №2731521, МПК G01N 33/33, Опубл.03.09.2020 Бюл. №23).

Результаты микроскопирования обработанного ультразвуком бентонита показали, что размеры частиц составляют от 75 до 85 нм.

Для проверки дисперсности наночастиц бентонита, последний вносили во флаконы емкостью 200 см³, содержащие питательную среду для выращивании пропионовокислых бактерий в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 г/л, тщательно перемешивали и оставляли на 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12 часов, контролируя время и степень оседания порошка бентонита на дно флаконов. Степень суспензиобразования оценивают визуально и микроскопически. Устанавливают, что за указанные экспозиции оседание порошка на дно флакона не происходит, поскольку в указанных соотношениях компонентов образуется дисперсная среда с взвешиванием наночастицами бентонита в культуральной жидкости.

Для изучение влияние наночастиц бентонита на выход биомассы Р. shermani и на синтез антиоксидантного фермента - супероксиддисмутазы, во флаконы с соответствующей питательной средой, содержащей вышеуказанные количества наночастиц бентонита, засевали пропионовокислые бактерии в оптимальной дозе инокулята - 8×10⁶ КОЕ/см³, выращивали при (30±1)°С в течение 24 ч. По истечении указанной экспозиции в культуральной среде определяли концентрацию микробных клеток путем титрования и спектрофотометрическим методом по оптической плотности культуры, а также параллельно исследовали уровень синтеза антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что внесение в среду культивирования пропионовокислых бактерий наночастиц бентонита в количестве 0,2 г/локазывает стимулирующее действие на рост и развитие бактерий, достигая концентрации 1×10¹² КОЕ/см³, что на 3 и 4 порядка выше, чем в контроле 2 (аналог 2) и контроле 1 (аналог 1). Увеличение дозы бентонита до 0,3 и выше не оказывает стимулирующего действия минерала на метаболизм бактерий. Концентрация бактерий с увеличением дозы бентонита имеет тенденцию к уменьшению.

Таким образом, для наращивания биомассы пропионовокислых бактерий наиболее оптимальный концентрацией бентонита является 0,2 г/л питательной среды.

Увеличение концентрации микробных клеток в питательной среде под влиянием стимулятора роста природного минерала-бентонита, происходила реципрокная активизация ферментных систем в частности супероксиддисмутазы, концентрация которой на фоне добавления в питательную среду природного минерала - бентонита в количестве 0,2 г/л, оказывало стимулирующее действие на метаболизм фермента, увеличивая его синтез в 1,88 раза (Р<0,001) ив 1,42 раза (Р<0,01) по отношению к контролю 1 (аналог по патенту №2 258 528) и к контролю 2 (аналог по патенту №2 760 551).

В результате исследований установлено, что внесение в среду культивирования P. shermani наночастиц бентонита в количестве 0,2 г/л позволяет не только получить более высокую биомассу пропионовокислых бактерий, но и увеличение биосинтеза антиоксидантного фермента - супероксиддисмутазы.

Исследование влияния композиции на частоту эритроцитов с микроядрами в периферической крови у белых мышей проводили методом микроядерного анализа (Ильинских Н.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая стабильность / Н.Н. Ильинских, В.В. Новицкий, Н.Н. Ванчулова, И.Н. Ильинских. - Томск, 1992. - 272 с). Для установления оптимального количественного сочетания компонентов было разработанонесколько прописей композиции (табл. 1), из которых впоследствии выбран оптимальной вариант.

Результаты скрининговых исследований показали, что исследуемые варианты композиции проявили разный уровень антимутагенной активности.

Критериям отбора служила антимутагенная активность культуральных жидкостей бифидобактерией с куркумой и культуральной жидкости и клеток пропионовокислых бактерий, выращенных в среде, содержащей наночастицы бентонита.

Результаты испытаний представлены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что облучение мышей гамма-лучами в дозе 1 Гр вызывает достоверное повышение эритроцитов с микроядрами в периферической крови до 4,95% (Р<0,05) в первый день после облучения, в дальнейшем, на 5 сутки после воздействия мутагена, данный показатель снижается до 4,01% (Р<0,05). На этом фоне введение культуральных жидкостей бифидобактерий с куркумой и пропионовокислых бактерий с наночастицами бентонита перед облучением приводило к уменьшению числа микроядер в пределах от 3,75 (в контроле 4,95) до 1,79% (в контроле 4,33) (Р<0,05).

Наиболее активным в результате эксперимента можно считать композицию №5, которая при дозе 50 мл/кг снизила в первые дни после облучения кластогенную активность радиации в виде уменьшения количества микроядер до 1,77% (Р<0,05), на третьи и пятые сутки снижение числа микроядер под влиянием композиции из культуральных жидкостей использованных микроорганизмов по варианту №5 составляло 1,67 и 1,79% (Р<0,05) соответственно. Близкий уровень антикластогенной активности был установлен для композиции №1 в дозе 75 мл/кг, чье антикластогенное действие более выражено на ранних сроках эксперимента. Остальные варианты композиций (2, 3, 4, 6) показали в эксперименте близкие уровни активности, выраженные в способности снижать число микроядер в эритроцитах в пределах до 2,39% (в контроле 4,95) (Р<0,01).

После анализа полученных данных был сделан вывод о том, что композиционный препарат, состоящий их смеси культуральной жидкости и пропионовокислых бактерий с наночастицами бентонита №5 обладает выраженными антимутагенным свойством, что подтверждается в его способности снижать частоту индуцированных ионизирующим излучением микроядер в периферической крови мышей.

Для изучения острой токсичности предлагаемого средства, проводили эксперименты на 10 беспородных белых мышах-самцах средней живой массой 18-20 г. Композицию вводили в желудок через зонд в дозах от 0,25 до2,5 мг/кг. При наблюдении в течение 14 сут. у животных не отмечали изменений поведенческих реакций, признаков диареи, каких-либо других токсических патофизиологических проявлений. Гибель животных не наступала. Следовательно, композицию из культуральных жидкостей бифидобактерий с куркумой и пропионовокислых бактерий с наночастицами бентонита, согласно ГОСТ 12.1.007-76 (Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности) можно отнести к 4 классу: «вещества малоопасные».

Кроме того, было изучено влияние композиции на цитогенетические и кариологические последствия воздействия кластогенных факторов на ядерные структуры клеток животных в условиях in vivo и in vitro.

Изучение хромосом проводили при увеличении 10, 90, используя микроскоп МБИ-6. Для анализа отбирали метафазы с учетом предложений Н.П. Бочковым (Генетика человека (наследственность и патология) / Н.П. Бочков. - Медицина, 1978, 377 с.). При анализе кариотипа во всех случаях, на каждый срок и вид эксперимента, а также в контроле использовали группу из 10 белых мышей, у каждого животного изучена не менее 100 метафаз. Из структурных нарушений хромосом учитывали хроматидные и хромосомные разрывы, ацентричные одиночные и парные фрагменты и обмены. Кроме того, учитывали аномалии в числе хромосом: анеуплодные (гипо- и гиперплоидные) и полиплоидные клетки.

В результате исследований установлено, что наиболее значительное уменьшение числа клеток с нарушениями в структуре и числе хромосом наблюдается при введении предлагаемой композиции в течение 7, 14 и 28 сут. Так, если вводить предлагаемые средства в течение 7 сут до облучения, то число клеток с нарушениями в структуре хромосом после облучения составляет 3,5±0,7%, а число клеток с изменениями числа хромосом 3,6±0,5%, т.е. снижается до уровня, близкого к контрольному (Р<0,05).

Таким образом, был сделан вывод, что предлагаемое средство -композиция из культуральной жидкости бифидобактерий с куркумой ипропионовокислых бактерий с наночастицами бентонита и витамином А (использованный нами в качестве препарата сравнения) обладает антимутагенным свойством против поражений, вызываемых в цитогенетическом аппарате клеток костного мозга, облучаемых гамма-лучами белых мышей. Механизм действия предлагаемого нами препарата против мутагенного действия гамма-лучей может быть разносторонним: антиоксидантное, иммуномодулирующее, антиаллергическое, иммунопротекторное, радиопротекторное, противоопухолевое, антидепрессивное, метаболизмстимулирующее и, как следствие, влияющее на митотический цикл и обмен белков, а через это - на ферментативную активность клеток и аппарат деления.

Как упоминалось выше, основным механизмом действия куркумы, входящей в состав композиции, является ингибирование фактора транскрипции NF-kB, участвующего в мутагенезе и онтогенезе, так и формировании радиорезистентности (Aravindan N., Veeraghavan J., Madhusoodhunan R. et al. Curcumin regulates low-linear energy transfer γ radiation-induced NF-kB-dependent telomerase activity in human neuroblastoma cells // Int. J. Radiut Oncol. Biol. Phys. - 2011. - V. 79. - P. 1206-1215).

Вторым важнейшим компонентом, индуцирующим антимутагенную активность предлагаемого средства, является пропионовокислые бактерии. В результате исследований установлено, что культуральная жидкость и клетки пропионовокислых бактерий обладает антимутагенным действием в отношении мутагенеза, индуцированного ионизирующим излучением и химическими токсикантами. Это связано с тем, что пропионовокислые бактерии синтезируют значительное количество антиокислительных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы (Мохова И.Д. Анализ микрофлоры сыра на примере пропионовокислых бактерий: Выпускная квалификационная работа. - Белгород, 2017.-51 с). Присутствие этих ферментов позволяет клетке удалять супероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях при радиогенном или токсическом стрессе.

Открытие антимутагенеза у бактерий открывает большие перспективы их использования, как способы культивирования бактерий имеют определенные преимущества перед культивированием, сбором лекарственных растений (как у аналога).

Бактерии можно выращивать на дешевых средах за короткое время путем направленного регулирования их метаболизма. В связи с особенностями метаболизма бактерий, их защитные соединения могут экскретироваться - что есть еще одно преимущество бактерий перед другими источниками антимутагенов и радиопротекторов.

Таким образом, показано, что пропионовокислые бактерии способны на биосинтез соединений, обладающих защитой от экзогенных и эндогенных мутагенов, что делает их привлекательными для создания пищевые добавок и лечебно-профилактических средств против стрессоров различной этиологии.

Доминирующими биологически активными веществами предлагаемого средства на основе куркумы и пропионовокислых бактерий являются: эфирные масла, полисахариды, флавоноиды, пропионовые кислоты, куркумоды, витамины, микроэлементы.

Известно, что в куркуме, кроме куркумина, содержатся важнейшие нутриенты: витамины В₁, В₂, В₃, В₆, B₁₂, С, Е, К, холин, фолат, макроэлементы: железо, марганец, медь, селен, цинк. В составе куркумы содержатся: куркумор-вещество, подавляющее рост клеток злокачественных опухолей, цинеол-терпены, обладающие антистрессорным, антирадикальным действиями, тумерон-антипаразитарный и антибактериальный агент, а также запускают процессы нейтрогенеза и стимулирует (до 80%) рост и созревание стволовых клеток костного мозга-детерминантов выживаемости облученного организма. Кроме того, в куркуме содержатся: эфирные масла, пищевые волокна, фенолы, флавоиды, полифенолы, крахмал, полисахариды, иммуномодуляторы. Благодаря своему уникальному химическому составукорни куркумы обладают-антиоксидантными, противовоспалительными, иммуномодилирующими, антибактериальными, противопаразитарными, гепато-, ренопротекторными, противоаллергическим, антимутагенным, действиями [(электронный журнал «Биология и интерактивная медицина», февраль (19) 2018.-№2)].

При этом стало известно, что сырая куркума оказывает более выраженное биологическое действие, чем очищенный куркумин (cM.CT.H.A.Abu-Rizq, М.Н. Mansour, M.Afzal Curcuma longa attenuates tetrachloride- induced oxidative stress in T-lymphocyte subpopulation// method mol.biol.,2015. - V. 1208. - P. 159-170).

Классические пропионовокислые бактерии относятся к наиполезнейшим микроорганизмам и способы к синтезу практически важных веществ: большинства аминокислот, значительного количества жирных кислот, экзополисахаридов, липидов и фосфолипидов, полифосфатов, коньюгированной линоленовой кислоты, ферментов, витамина К2, а также витаминов группы В:В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В3 (пантотеновая кислота), В6 (пиридоксин), В9 (фолиевая кислота), В6, (пиридоксин), большое количество (сверхсинтез) витамина В12. Биосинтез витамина В12 происходит параллельно накоплению биомассы ПКБ (Poonam.Multifaceted attributes of dairy propionibacteria: are view/ Poonam, S.D. Pophaly, S.K.Tomar, S.De, R.Singh//Worid J, Microbiol. Biotechnol.-2012.-V. 28. №11. - P.3081-3095).

Пропионовые бактерии могут также за счет ассимиляции азота (NH₄)₂SO₄ синтезировать все аминокислоты. Биосинтез белков пропионовыми бактериями сопровождается созданием пула из 15 аминокислот: цистина, гистидина, аргинина, аспарата, глутаминовой кислоты, глицина, серина, треонина, β-аланина, тирозина, валина, метионина, пролина, фенилаланина и лейцина. Известно, что бактерии содержат пептидазы, при участии которых обеспечивают себя незаменимыми аминокислотами и осуществляют реакции трансаминирования, могут растина любой из 20 аминокислот, внесенной в среду в качестве единственного источника азота.

Известно, что положительная роль пропионовокислых бактерий как пробиотиков обусловлена образованием ими пропионовой кислоты (СН₃СН₂СООН), минорных органических кислот, бактериоцинов, ферментов и витаминов. Эти уникальные микроорганизмы обладают мощными иммуномодулирующими и антимутагенными свойствами, они приживаются в кишечнике людей и способны к снижению генотоксического действия ряда химических соединений и УФ-лучей. В отличие от других пробиотиков у пропионовокислых бактерий установлен значительный синтез корриноидов, гемсодержащих антиоксидантных ферментов: каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (СОД). Известно, что молочные пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот, выдерживают низкую рН (2.0) кислотность желудка, ингибируют активность β - глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы - ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей (Holo Н, Faye Т, Brede DA, Nilsen Т, Oregard I, Langsrud T, et al. Bacteriocins of propionic acid bacteria. Lait 2002; 82: 59-68).

Бактерии приживаются в кишечнике людей и животных и снижают генотоксическое действие различных химических соединений и ультрафиолетовых лучей. Впервые продемонстрированная индукция антимутагенеза у пропионовокислых бактерий (Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. 288 с.) служит дополнительным указанием на необходимость создания более тесной связи жизнедеятельности пропионовокислых бактерий и людей.

Пропионовокислые бактерии могут способствовать уменьшению факторов риска для развития рака, в частности, благодаря способности связывать и элиминировать из организма канцерогенные соединения, такие как микотоксины, особенно афлатоксин В1, цианотоксины, такие какмикроцистин - LR, растительные лектины, такие как concanavalin А и jacalin, а также являются эндокринными разрушителями (El-Nezami H.S., Chrevatidis A., Auriola S., Salminen S., Mykkanen H., Removal of common Fusarium toxins in vitro by strains of Lactobacillus and Propionibacterium, Food Addit. Contam. 19 (2002) 680-686; Halttunen Т., Collado M.C., El-Nezami H., Meriluoto J., Salminen S., Combining strains of lactic acid bacteria may reduce their toxin and heavy metal removal efficiency from aqueous solution, Lett. Appl. Microbiol. 46 (2008) 160-165).

Органические токсины, приведенные выше, связаны, в частности, с колоректальным раком. Тяжелые металлы тоже несут в себе много вредного воздействия на почки, провоцируют другие виды онкологических болезней. Все это свидетельствует о том, что молочные пропионовокислые бактерии, как минимум, уменьшают всасывание канцерогенных соединений в кишечнике и препятствуют появлению и развитию раковых заболеваний.

Кроме того, эти бактерии могут быть использованы в качестве детоксирующей добавки к пище, загрязненной высоким уровнем такого рода канцерогенными соединениями, которые очень трудно удалить из продуктов. Выраженные антимутагенные свойства классических молочных пропионовкислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii по предотвращению мутаций вызванных самыми различными мутагенными агентами. Положительной действие здесь также достигается и за счет синтеза P. freudenreichii (P. Shermanii) соединений с полезными физиологическими и антиканцерогенными свойствами через изомеризацию линолевой кислоты (трансформирование в конъюгированную форму)(Воробьева Л.И. Внеклеточный белок пропионовокислых бактерий ингибирует индуцируемые мутации у штаммов Salmonella typhimurium / Л.И. Воробьева, Е.Ю. Ходжаев, Г.М. Пономарева // Микробиология. 2001. - Т. 70. - №1. - С. 31-35).

Учитывая, что пропионовокислые бактерии способны связывать и элиминировать из организма эндо- и экзо-токсины, а также тяжелые металлы.

Для усиления этой способности у бактерий, в предлагаемой композиции, мы использовали адсорбент - наночастицы бентонита, которые не только связывают экотоксиканты, радиоиндуцированные токсические соединения - радиотоксины, но и обладают свойством адсорбировать токсические метаболиты как in vivo (в организме), так и in vitro (в среде культивирования микроорганизмов, в частности, пропионовокислых бактерий, вследствие, чего внесения обработанной ультразвуком бентонита (наночастицы) индуцирует наибольший выход биомассы и метаболитов их, в частности, антиоксидантного фермента-супероксиддисмутазы (СОД).

Таким образом, предлагаемое средство, содержащее комплекс биологически активных веществ из куркумы и пропионовокислых бактерий, может применяться как антимутагенное средство.

Изобретение относится к биотехнологии. Биологически активное средство, обладающее антимутагенным действием, включающее культуральную жидкость бифидобактерий, в которой растворен порошок куркумы в концентрации 0,5%, - 49 частей; культуральную жидкость и биомассу пропионовокислых бактерий - 49 частей, наночастицы бентонита с размерами частиц от 75 до 85 нм, внесенные в среду культивирования пропионовокислых бактерий из расчета 0,2 г/л, – 2 части. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной и антимутагенной активностью, из природных источников. 3 табл.

Биологически активное средство, обладающее антимутагенным действием на основе культуральной жидкости бифидобактерий, в которой растворен порошок куркумы, в концентрации 0,5%, отличающееся тем, что в состав дополнительно входят культуральная жидкость и клеточная биомасса пропионовокислых бактерий, а также наночастицы бентонита, взятые в определенном соотношении, части:

культуральная жидкость бифидобактерий, содержащая 0,5% порошка куркумы, - 49;

культуральная жидкость и биомасса пропионовокислых бактерий, содержащая 1×10¹² КОЕ/см³, - 49;

наночастицы бентонита с размерами частиц от 75 до 85 нм, внесенные в среду культивирования пропионовокислых бактерий из расчета 0,2 г/л, - 2.