ВАРИАНТ МАЛЬТОГЕННОЙ α-АМИЛАЗЫ Российский патент 2005 года по МПК C12N9/28 C12N15/56 

Область изобретения

Настоящее изобретение касается вариантов мальтогенной амилазы и способов создания таких вариантов.

Предпосылки изобретения

Мальтогенная α-амилаза (глюкан-1,4-α-мальтогидролаза, ЕС 3.2.1. 133) способна гидролизовать амилозу и амилопектин в мальтозу в ее α-конфигурации, а также способна гидролизовать мальтотриозу, равно как и циклодекстрин.

Мальтогенная α-амилаза палочки Bacillus (европейская патентная заявка 120693) доступна на коммерческой основе под торговой маркой новамил - Novamil^® (производится датской фирмой Novo Nordisk A/S): он широко используется в хлебопечении в качестве замедлителя черствения хлеба благодаря его способности подавлять ретроградацию крахмала. Novamil^® обладает рядом свойств, характерных для циклодекстринглюкантрансфераз (ЦДГТаз), включая гомологию аминокислотных последовательностей (B.Henrissat & A.Bairoch, 1996) и образование продуктов трансгликозилирования (C.Chris-tophersen et al., 1997, Starch, 50 [1], 39-45).

Цикломальтодекстринглюкантрансфераза (ЕС 2.4.1.19), также обозначаемая как циклодекстринглюкантрансфераза или циклодекстрингликозилтрансфераза, для краткости обозначаемая в данном тексте как ЦДГТаза, катализирует конверсию крахмала и сходных субстратов в цикломальтодекстрины за счет внутримолекулярной реакции трансгликозилирования, в результате чего образуются цикломальтодекстрины (или ЦМД) различной длины.

ЦДГТазы широко распространены, а в научной литературе эти ферменты подробно описаны у различных видов бактерий, включая Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Klebsiella, Micrococcus, Thermoanaerobacter и Thermoanaerobacterium. ЦДГТаза, вырабатываемая термоанаэробной бактерией Thermoanaerobacter sp., была описана у B.E.Norman & S.Т. Jorgensen, 1992, Denpun Kagaku, 39, 99-106 и в международной патентной заявке WO 89/03421/, а ее аминокислотная последовательность была представлена в международной патентной заявке WO 96/33267. Аминокислотные последовательности ЦДГТаз Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes и палочки Bacillus circulans доступны в Интернете (страницы SCOP или PDF) в виде файла 1CIU формата pdf, а аминокислотная последовательность ЦДГТазы В.circulans доступна в файле 1CDG.pdf.

У Y.Tachibana, 1997, J. Fermentat. & Bioeng., 83 [6], 540-548 описано клонирование и экспрессия ЦДГТазы. Варианты ЦДГТаз были описаны у Y.-H. Kim, 1997, Biochem. & Mol. Biol. Intern., 41 [2], 227-234; К.-A.Sin, 1994, J. Biotechnol., 32 [3], 283-288; D.Penlnga, 1995, Biochemistry, 34 [10], 3368-3376 и в международной патентной заявке WO 96/33267.

Недавно были опубликованы данные о третичной структуре некоторых ЦДГТаз. Hofman с соавт. (B.E.Hofman, Н.Bender & G.E. Schultz, 1989, J. Mol. Biol., 209, 793-800) и Klein и Schultz (C.Klein & G.E.Schultz, 1991, J. Mol. Biol., 217, 737-750) описана третичная структура ЦДГТазы, выделенной у Bacillus circulans штамма 8; Kubota с соавт. (M.Kubota, Y.Matsuura, S.Sakai & Y.Katsube, 1991, Denpun Kagaku, 38, 141-146) описана третичная структура ЦДГТазы Bacillus stearothermophilus штамма ТС-91; Lawson с соавт. (C.L.Lawson, R. van Montfort, B.Strokopytov, H.J. Rozeboom, K.H.Kalk, G.E. de Vries, D.Penninga, L.Dijkhuizen & B.W.Dijkstra, 1994, J. Mol. Biol., 236, 590-600) описана третичная структура ЦДГТазы Bacillus circulans.штамма 251; Strokopytov с соавт. (B.Strokopytov, D.Penninga, H.J.Rozeboom, K.H.Kalk, L.Dijkhuizen & B.W.Dijkstra, 1995, Biochemistry, 34, 2234-2240) описана третичная структура ЦДГТазы Bacillus circulans штамма 251, при том, что эта ЦДГТаза была соединена с акарбозой, являющейся эффективным ингибитором ЦДГТаз; и Knegtel с соавт. (R.M.A.Knegtel, R.D.Wind, H.J.Rozeboom, K.H.Kalk, R.M. Buitelaar, L.Dijkhuizen & B.W.Dijkstra, 1996, J. Mol. Biol., 256, 611-622) описана третичная структура ЦДГТазы Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes.

Краткое описание изобретения

Заявители осуществили модифицирование аминокислотной последовательности мальтогенной α-амилазы с целью получения вариантов, характеризующихся улучшенными свойствами, основываясь на третичной структуре мальтогенной α-амилазы Novamyl. Эти варианты обладают измененными физико-химическими свойствами, например измененным оптимумом рН, повышенной термостабильностью, увеличенной специфической активностью, измененными параметрами расщепления субстрата или повышенной способностью подавлять ретроградацию крахмала или зачерствение хлеба.

Таким образом, настоящее изобретение представляет способ создания варианта исходной мальтогенной α-амилазы, при том что такой вариант характеризуется по крайней мере одним измененным свойством по сравнению с упомянутой исходной мальтогенной α-амилазой, причем этот способ включает:

(1) анализ структуры мальтогенной α-амилазы с целью идентификации на основе оценки ее структурных параметров по крайней мере одного аминокислотного остатка или по крайней мере одного структурного сегмента в составе мальтогенной α-амилазы, который связан с изменениями указанного свойства;

(2) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы, который, по сравнению с исходным вариантом модифицирован по тому аминокислотному остатку или структурному участку, который был идентифицирован на стадии (1) в связи с изменением указанного свойства; и

(3) тестирование полученного в результате варианта мальтогенной α-амилазы на указанное свойство.

Свойством, которое может быть изменено с помощью указанных выше способов по настоящему изобретению, может быть, например, уровень стабильности, зависимость активности от величины рН, способность подавлять ретроградацию крахмала и зачерствение хлеба, уровень специфической активности или субстратная специфичность. Следовательно, данный вариант может, например, характеризоваться увеличенной термостабильностью или повышенной активностью при меньших значениях рН, а при оптимальном значении рН - повышенной способностью подавлять ретроградацию крахмала и зачерствение хлеба.

Еще ряд аспектов настоящего изобретения касается вариантов мальтогенной α-амилазы, ДНК, кодирующих такие варианты, и способов создания таких вариантов. Наконец, настоящее изобретение касается применения указанных вариантов в различных промышленных целях, в частности в хлебопечении.

Подробное описание изобретения

Мальтогенная α-амилаза

Мальтогенная α-амилаза - фермент, имеющий в Классификации ферментов (ЕС) номер 3.2.1.133. Ее каталитическая активность не зависит от наличия у субстрата нередуцирующей концевой части, а первичная каталитическая активность этого фермента приводит к гидролизу амилопектина и амилозы с образованием мальтозы и более длинных мальтодекстринов. Этот фермент способен гидролизовать амилозу и амилопектин с образованием мальтозы, находящейся в α-конфигурации, а также способен гидролизовать мальтотриозу и циклодекстрин.

Конкретно предпочтительной мальтогенной α-амилазой является амилаза, клонированная на материале палочек Bacillus в соответствии с описанным в европейской патентной заявке 120693 (здесь и далее она обозначается как Novamyl). Novamyl характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной аминокислотами 1-686 в SEQ ID NO: 1. Novamyl кодируется геном, выделенным из Bacillus штамма NCIB-11837, а нуклеотидная последовательность этого гена показана в SEQ ID NO: 1. Третичная структура Novamyl описана ниже.

В целом, предпочтительная мальтогенная α-амилаза обладает одним или несколькими из нижеперечисленных свойств:

(1) гомологичностью третичной структуры с таковой у Novamyl;

(2) аминокислотной последовательностью, характеризующейся по крайней мере 70%-ным уровнем идентичности с SEQ ID NO: 1, предпочтительно по крайней мере 80%-ным или 90%-ным, например 95%-ным или 98%-ным уровнем идентичности;

(3) кодирующей ее последовательностью ДНК, гибридизующей с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: l, или с последовательностью ДНК, кодирующей Novamyl Bacillus штамма NCIB-11837;

(4) наличием сайта связывания кальция, координационно эквивалентного осевому атому углерода в составе остатка аспарагина-77, атомам боковых цепей ОЕ1 и ОЕ2 из состава остатка Glu-102, атому боковой цепи OD1 из состава остатка Asp-79, атому OD1 из состава остатка Asp-76 и атому ОЕ1 из состава остатка Glu-101, и одной молекуле воды WAT-V21 (атом OWO);

(5) присутствием последовательности аминокислот «Pro-Ala-Gly-Phe-Ser» в положении, эквивалентном остаткам 191-195 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1; и структурная гомология с соответствии с отмеченным выше в п.(1) основывается на других параметрах гомологии последовательностей, на анализе гидрофобных кластеров или с помощью «обратного нанизывания» аминокислот (T.Huber & A.E.Torda, 1998, Protein Sci., 7 [1], 142-149), причем любой из этих методов указывает на наличие одинаковой четвертичной структуры по сравнению с Novamyl: при этом четвертичная структура характеризуется общей укладкой (фолдингом) или укладкой только доменов А, В и С, более предпочтительно включая домен D, а наиболее предпочтительно включая домен Е. С другой стороны, сопоставление структур Novamyl и мальтогенной α-амилазы может быть использовано для целей идентификации эквивалентных положений.

Установление сайта связывания кальция, на что указывалось выше в п. (4), основывается на положении кальций-связывающего сайта в трехмерной структуре Novamyl, что обсуждается далее в разделе «Сайты связывания кальция».

Определение «эквивалентного положения», на что указывалось выше в п.(5), основывается на сопоставлении нуклеотидных или аминокислотных последовательностей и анализе структурной гомологии с применением методов, известных в данной области техники.

Трехмерная структура мальтогенной α-амилазы

Novamyl был использован для установления трехмерной структуры, образуемой на основе настоящего изобретения.

Структура Novamyl была раскрыта в соответствии с данными рентгенографических методов, применяемых в кристаллографии, например, в соответствии с руководством G.К.Stout & L.H.Jensen, 1989, "X-Ray Structure Determination", J.Wiley & Sons Inc., NY.

Координаты установленной кристаллической структуры Novamyl при разрешении в 2,2 при использовании метода изоморфного замещения даны в стандартном для описания белков (PDB) формате (Protein Data Bank, Brookhaven Nat,. Lab., Brookhaven, CT). Используются следующие сокращения: СА обозначает ион кальция или α-атом углерода в составе осевой цепи полипептида; WAT обозначает воду или кальций; MAL обозначает мальтозу; HEX обозначает углеводную составляющую субстратного аналога; и SUL обозначает сульфатный ион.

Аминокислотные остатки в последовательности фермента обозначаются в данном тексте с использованием соответствующих 3-или 1-буквенных аббревиатур.

Пространственная структура указанной мальтогенной α-амилазы определяется пятью глобулярными доменами, обозначенными А, В, С, D и Е. Эти домены определяются аминокислотными остатками 1-132 и 204-403 (домен А), остатками 133-203 (домен В), остатками 404-496 (домен С), остатками 497-579 (домен D) и остатками 580-686 (домен Е), причем нумерация соответствует аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Свойства доменов А, В и С, представляющих конкретный интерес, описаны далее.

Домен А

Домен А является наиболее крупным доменом и содержит активный сайт, который включает кластер из трех аминокислотных остатков - D329, D228 и Е256, - пространственно расположенных на «дне» щели, имеющейся на поверхности данного фермента. Характер общей укладки домена А является типичным для тех α-амилаз, для которых определена структура: а именно он является β/α-8-цилиндром, включающим восемь расположенных по центру β-тяжей (пронумерованных от 1 до 8) и восемь фланкирующих их α-спиралей. β-Цилиндр был определен McGregor, (цит. выше). С-концевая часть 1-го β-тяжа соединена с 1-й спиралью через петлю, обозначенную как «петля 1», и такая структура обнаруживается во всех остальных петлях, хотя для этих петель демонстрируется некоторая изменчивость размеров и некоторые из них могут быть весьма протяженными.

Восемь расположенных по центру β-тяжей в β/α-8-цилиндре в существенной степени соответствуют известным структурам ЦДГТаз. Эта часть структуры, включая тесное окружение активного сайта, находящегося с С-конца данных β-тяжей, проявляет высокий уровень идентичности с ЦДГТазами.

С другой стороны, петли, обеспечивающие контакт между β-тяжами и α-спиралями, характеризуются высоким уровнем изменчивости по сравнению с известными структурами ЦДГТаз. Эти петли создают т.н. «структурный контекст» активного сайта, а большинство контактов с субстратом выявляется с участием аминокислотных остатков, расположенных в составе указанных петель. Отличительные свойства, такие как субстратная специфичность, связывание с субстратом, зависимость активности от рН, параметры расщепления субстрата и подобное, определяются конкретными аминокислотами и положениями, занимаемыми этими петлями. Домен А белка Novamyl включает два кальций-связывающих сайта, один из которых гомологичен кальций-связывающим сайтам ЦДГТаз; другой - уникален для Novamyl. Структура кальций-связывающего сайта обсуждается ниже в разделе «Кальций-связывающие сайты».

Домен В

Домен В, также обозначаемый как петля 3 β/α-8-цилиндра, составлен аминокислотными остатками 133-203 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Эта структура отчасти гомологична структуре домена В ЦДГТаз, а наиболее значимое отличие связано с присутствием 5-аминокислотной вставки, соответствующей положениям 191-195 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: I - эта вставка в других ЦДГТазах не обнаруживается. Эта вставка пространственно расположена вблизи активного сайта и в тесном контакте с соответствующим субстратом.

Домен С

Домен С в белке Novamyl составлен аминокислотными остатками 404-496 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Домен С полностью составлен (β-тяжами, которые образуют единую 8-нитевую плоскостную структуру, которая заворачивается (укладывается) назад за себя - соответственно, она может быть определена как структура «β-сэндвича». Одна из частей такой β-плоскости образует «интерфейс» с доменом А.

Кальций-связывающие сайты

Структура мальтогенной α-амилазы включает три кальций-связывающих сайта: следовательно, три иона кальция, как выявляется, присутствуют в данной структуре. Как и в большинстве из 13 других известных структур, один из ионов кальция - WAT-693 расположен между доменами А и В. Этот ион кальция координируется атомами осевого углеродного скелета из состава остатков Gln-184 и His-232, атомами боковых цепей OD2 и OD1 из состава остатка Asp-198, атомом OD1 боковой цепи остатка Asn-131 и тремя молекулами воды WAT-V1, WAT-V5 и WAT-V8.

Второй ион кальция находится в пределах домена А, и он типичен для структуры ЦДГТаз, но не известен в составе α-амилаз. Этот ион кальция (WAT-694) координируется углеродными атомами осевого скелета остатков Gly-48 и Asp-23, атомом OD2 боковой цепи остатка Asp-50, атомом OD1 боковой цепи остатка Asp-21, атомом OD1 боковой цепи остатка Asn-26 и атомом OD1 боковой цепи остатка Asn-27 и одной молекулой воды WAT-V62.

Третий ион кальция расположен в пределах домена А и является уникальным для Novamyl. Этот ион кальция (WAT-692) координируется с участием атома углерода осевого скелета остатка Asn-77, атомами ОЕ2 и ОЕ1 боковой цепи остатка Glu-102, атомом OD1 боковой цепи остатка Asp-79, атомом OD1 боковой цепи остатка Asp-76 и атомом ОЕ1 боковой цепи остатка Glu-101 и одной молекулой воды WAT-V21.

Сайт связывания субстрата

Участки петель, обсуждавшихся выше в связи с доменами А и В, представляют конкретный интерес с точки зрения взаимодействия с субстратом и реактивности активного сайта. В частности, в домене А это остатки 37-45 1-й петли, остатки 261-266 5-й петли, остатки 327-330 7-й петли и остатки 370-376 8-й петли; в домене В - остатки 135-145 3-й петли, остатки 173-180 и 188-196 3-й петли, причем положения этих остатков соответствуют аминокислотам в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.

Вне связи с какой-либо теорией, в настоящее время считается, что связывание субстрата и фермента обеспечивается предпочтительными взаимодействиями, происходящими в пространстве диаметром 4-6 , расположенном между молекулой субстрата и данным ферментом, такими как образование водородных связей и (или) наличие мощного электростатического взаимодействия. Следующие остатки в последовательности Novamyl (SEQ ID NO: 1) находятся в пределах расстояния 6 от субстрата, коим является HEX, и, следовательно, могут быть предположительно вовлечены во взаимодействия с упомянутым субстратом:

44, 89, 90, 92, 93, 127, 129, 132, 135, 177, 178, 188, 191, 194, 196, 226, 228, 229, 230, 231, 232, 256, 258-261, 288, 328, 329, 371, 372, 373, 376 и 690.

Следующие остатки последовательности Novamyl находятся на расстоянии в 4 от субстрата HEX и, следовательно, предположительно могут участвовать во взаимодействии с упомянутым субстратом:

90, 92, 93, 129, 132, 177, 188, 189, 190, 191, 196, 226, 228, 229, 231, 232, 256, 258, 259, 260, 261, 328, 329, 372, 376 и 690.

Достижение гомологии с Novamyl^®

Структура Novamyl® являлась моделью, выстроенной по параметрам структуры, описанной здесь в таблице 1. Аналогичным образом может быть выстроена структура других вариантов мальтогенных α-амилаз.

Модельная структура мальтогенной α-амилазы может быть выстроена с использованием программы «Homology» или аналогичных программ, например, программы «Modeller» (обе они предоставляются фирмой Simulations Inc., San Diego, CA). Базовым принципом является сопоставление последовательности мальтогенной α-амилазы с известной структурой той мальтогенной α-амилазы, структура которой уже была сконструирована ранее. Структурно консервативные участки затем могут быть определены на основании консенсусных последовательностей. На участках, характеризующихся отсутствием гомологии, могут быть внесены петлевые структуры или же последовательности могут быть делетированы с последующим связыванием необходимых остатков, для чего применяется, например, программа «Homology». Последующее уточнение и оптимизация получаемой структуры могут быть осуществлены с применением той же программы «Homology» или иной программы, предназначенной для молекулярного конструирования, например, программы CHARMm (Molecular Simulations).

Способы создания новых вариантов мальтогенной α-амилазы

В первом своем аспекте настоящее изобретение представляет способ создания варианта исходной мальтогенной α-амилазы, причем упомянутый вариант характеризуется по крайней мере одним измененным свойством по сравнению с указанной исходной мальтогенной α-амилазой, причем этот способ включает:

(1) анализ структуры мальтогенной α-амилазы с целью идентификации на основе оценки ее структурных параметров по крайней мере одного аминокислотного остатка или по крайней мере одного структурного сегмента в составе мальтогенной α-амилазы, который связан с изменениями указанного свойства;

(2) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы, который, по сравнению с исходным вариантом модифицирован по тому аминокислотному остатку или структурному участку, который был идентифицирован на стадии (1) в связи с изменением указанного свойства;

(3) тестирование полученного в результате варианта мальтогенной α-амилазы на указанное свойство.

Структурная единица, которая идентифицируется на стадии (1) способа по настоящему изобретению, может быть составлена единственным аминокислотным остатком. Однако обычно эта структурная часть включает более одного аминокислотного остатка и, как правило, она включает одну из указанных выше частей структуры мальтогенной α-амилазы, таких как домены А, В, С, D или Е, «интерфейс» (граничный участок) между любыми из этих доменов, кальций-связывающий сайт, петлевая структура, сайт связывания субстрата или подобное.

Структурные или функциональные аспекты могут основываться на анализе участвующих структур или структурных элементов с определением их вкладов в функционирование данного фермента. Например, анализ функциональной дифференцировки мальтогенной α-амилазы и различных ЦДГТаз может быть использован для оценки некоторых свойств Novamyl или для проявления таких отношений. Например, различия в параметрах или структуре петель, окружающих конкретный активный сайт, могут обусловливать дифференцировку степени доступности активного сайта для субстрата, а следовательно, и различия в уровне субстратной специфичности и (или) параметрах расщепления субстрата.

Более того, были идентифицированы (см. далее) участки мальтогенной α-амилазы, вовлеченные в связывание субстрата, а следовательно, например, в определение субстратной специфичности и (или) расщепления, связывании ионов кальция, что важно, например, с точки зрения зависимости данного фермента от кальция, и в подобное.

Модификация аминокислотного остатка или структурного участка обычно осуществляется путем подходящего модифицирования последовательности ДНК, кодирующей исходный рассматриваемый фермент. Такая модификация может быть заменой, делецией или вставкой аминокислотного остатка или структурной части.

Предназначенное к модифицированию свойство может быть стабильностью (например, термостабильностью), рН-зависимой активностью, субстратной специфичностью, специфической активностью или способностью подавлять ретроградацию крахмала или зачерствение хлеба. Следовательно, измененное свойство может являться измененной специфической активностью при данной величине рН и (или) измененной субстратной специфичностью, такой как измененный параметр расщепления субстрата или измененный параметр субстратного ингибирования.

На стадии (2) способа по настоящему изобретению предназначенная для идентификации часть данной структуры предпочтительно является частью, которая в составе пространственно уложенного фермента, который предположительно участвует в контактировании с субстратом (см. описание, приведенное выше в разделе «Сайт связывания субстрата») или вовлечен в обеспечение субстратной специфичности и (или) параметров расщепления, и (или) частью, которая контактирует с одним из ионов кальция, и (или) частью, влияющей на рН- или температурный профиль данного фермента, или частью, иным образом влияющей на свойства мальтогенной α-амилазы.

Далее описаны конкретные типы вариантов, которые были сконструированы с применением способа по настоящему изобретению.

Варианты по настоящему изобретению могут нести дополнительные модификации по отношению к описанным здесь модификациям. Предпочтительно такие варианты характеризуются более чем 70%-ным уровнем идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1, предпочтительнее более чем 80%-ным, в частности, более чем 90%-ным, особенно более чем 95%-ным, например более чем 98%-ным уровнем идентичности.

Варианты мальтогенной α-амилазы с измененной зависимостью активности от величины рН

Профиль зависимости активности фермента от величины рН может быть изменен путем изменения параметров рКа остатков на расстоянии 10 от остатков активного сайта в последовательности мальтогенной α-амилазы. Изменение рКа остатков активного сайта достигается, например, путем изменения электростатических взаимодействий или гидрофобных взаимодействий между функциональными группами боковых цепей аминокислот в составе данного аминокислотного остатка и остатков из ближайшего окружения. Для достижения повышенной активности при более высоком рН отрицательно заряженные остатки помещают рядом с аминокислотой-донором водорода, в то время как положительно заряженные остатки, помещенные рядом с нуклеофильной кислотой, обусловливают повышенную активность при низких значениях рН. Также снижение рКа может быть достигнуто подавлением доступности воды или повышением гидрофобности окружающей среды.

Следовательно, другой аспект настоящего изобретения представляет вариант исходной мальтогенной α-амилазы, причем этот вариант характеризуется измененным профилем зависимости активности от величины рН по сравнению с исходным вариантом, причем данный вариант может быть получен с применением следующего способа:

(1) идентификация аминокислотного остатка в пределах 15 от остатка активного сайта в составе мальтогенной α-амилазы в трехмерной структуре указанной исходной мальтогенной α-амилазы, в частности в 10 от остатка активного сайта, причем. указанный аминокислотный остаток предположительно вовлечен в электростатические или гидрофобные взаимодействия с остатком активного сайта;

(2) замена в данной структуре указанного аминокислотного остатка на аминокислотный остаток, в результате чего изменяется электростатическое и (или) гидрофобное окружение остатка активного сайта, и оценка согласованности данного аминокислотного остатка с данной структурой;

(3) необязательное повторение стадии (1) и (или) (2) вплоть до того момента, как будет идентифицирована аминокислотная замена, которая эффективно встроится в состав данной структуры;

(4) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы, как следствие осуществления стадий (1) и (2), и необязательно стадии (3), и тестирование указанного варианта на зависимость активности фермента от величины рН.

В предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы, характеризующийся измененным профилем зависимости активности от величины рН по сравнению с исходной мальтогенной α-амилазой, включает модификацию аминокислотного остатка, соответствующего одному или большему числу следующих остатков из состава последовательности SEQ ID NO: 1:

D127, V129, F188, А229, Y258, V281, F284, Т288, N327, М330, G370, N371 и D372,

L71, S72, V74, L75, L78, Т80, L81, G83, Т84, D85, N86, Т87, G88, Y89, Н90, G91, Т94, R95, D96, F97, I174, S175, N176, D178, D179,.R180, Y181, Е182, А183, Q184, К186, N187, F188, Т189, D190, А192, G193, F194, S195, L196.

В более предпочтительном варианте данный вариант включает модификацию, соответствующую одной или нескольким следующим модификациям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

D127N/L, V129S/T/G/V, F188E/K/H, A229S/T/G/V, Y258E/D/K/R /F/N, V281L/T, F284K/H/D/E/Y, T288E/K/R, N327D, M330L/F/I/D/E/K, G370N, N371D/E/G/K и D372N/V,

L71I, S72C, V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/S/ T/N/Q/K/H, G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L, T84S/A/N/D/G, D85A/T/S/N/G, N86 Q/E/D/Y/H/K, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, T189N/D/A/S/H/Y/G, D190E/Q/H/N/K, A192T/D/E/N/K, G193A/S/T, F194Y, S195N/D/E/R/K/G, L196I.

Сходные модификации могут быть внесены по эквивалентным положениям в состав других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес варианты характеризуются сочетанием одной или нескольких из перечисленных выше модификаций с любой из других модификаций, описанных в настоящей заявке.

Варианты мальтогенной α-амилазы с измененной стабильностью

Вариант с улучшенной (обычно - увеличенной) стабильностью может быть получен путем стабилизации связывания кальция, внесения пролина, замены гистидина на другую аминокислоту, внесения междоменной дисульфидной связи, удаления сайта дезамидирования, изменения контакта в водородной связи, заполнения внутренней полости в пространственной структуре одной или несколькими аминокислотами с более крупными боковыми цепями, внесения междоменных взаимодействий, изменения распределения заряда, кэпирования спирали или внесения солевого мостика.

Связывание кальция

Настоящее изобретение представляет вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется измененной стабильностью за счет измененной стабилизации связывания ионов кальция (Ca²⁺). Данный вариант фермента может характеризоваться измененной термостабильностью или измененной стабильностью в диапазоне рН, или он может обладать активностью мальтогенной α-амилазы в присутствии низкой концентрации ионов кальция. В настоящее время считается, что аминокислотные остатки, расположенные в пределах 10 от иона кальция, вовлечены в обеспечение способности связывать Ca²⁺ данным ферментом или играют в этом важную роль.

Аминокислотные остатки, обнаруженные на расстоянии до 10 от сайтов связывания Са²⁺ в составе последовательности мальтогенной α-амилазы, показанной в SEQ ID NO: 1, были установлены в соответствии с описанным в примере 2:

16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 40, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 87, 88, 89, 91, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 109, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 145, 150, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 174, 177, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 206, 210, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 237, 378 и 637.

С целью создания варианта в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения желательным является заменить по крайней мере один из перечисленных выше аминокислотных остатков, для которых определено участие в не являющемся оптимальным связывании кальция, на любой иной аминокислотный остаток, который бы улучшил аффинность по связыванию Са²⁺ полученным вариантом фермента. Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения представляется способ создания варианта исходной мальтогенной α-амилазы, причем указанный вариант характеризуется стабилизированным связыванием Са²⁺ по сравнению с указанным исходным вариантом, причем такой способ включает:

(1) идентификацию аминокислотного остатка на расстоянии до 10 от сайта связывания Са²⁺ в составе мальтогенной α-амилазы в модели трехмерной структуры указанной α-амилазы, для которого, исходя из структурных или функциональных характеристик, установлено влияние на не являющееся оптимальным взаимодействие с ионом кальция;

(2) конструирование варианта, в составе которого указанный аминокислотный остаток заменен на другой аминокислотный остаток, который, исходя из структурных или функциональных характеристик, как установлено, играет важную роль в обеспечении измененной аффинности по связыванию ионов Са²⁺;

(3) тестирование параметров Са²⁺-связывания полученным вариантом мальтогенной α-амилазы.

Замена аминокислотного остатка, связанного с не являющимся оптимальным взаимодействием с ионом кальция, на другой остаток может обусловливать изменение взаимодействия по связыванию иона кальция данным ферментом. Например, рассматриваемый аминокислотный остаток может быть подобран на основании одного или нескольких следующих соображений:

(а) с целью улучшения взаимодействия между ионом кальция и аминокислотным остатком, исходя из параметров структуры мальтогенной α-амилазы. Например, если рассматриваемый аминокислотный остаток подвергается воздействию внешнего растворителя, то предпочтительным может быть увеличение уровня прикрытия указанного аминокислотного остатка от этого растворителя таким образом, чтобы обеспечить стабилизацию взаимодействия между указанным аминокислотным остатком и ионом кальция. Это может быть достигнуто путем замены указанного остатка или аминокислотного остатка, находящегося в непосредственной близости от указанного остатка и участвующего в образовании данной «защиты», на аминокислотный остаток с более крупной боковой группой или на остаток, улучшающий «эффект прикрытия» каким-либо иным путем,

(б) с целью стабилизации сайта связывания кальция, например, за счет стабилизации структуры мальтогенной α-амилазы, например, стабилизации контактов между двумя или большим числом из пяти доменов, или стабилизации одного или нескольких отдельных доменов таким же образом. Это может быть достигнуто, например, путем обеспечения лучшей координации между боковыми цепями аминокислот, что может быть достигнуто, например, путем замены остатка аспарагина на остаток аспарагиновой кислоты и (или) остатка глутамина на остаток глутаминовой кислоты, находящихся в пределах 10 , а предпочтительнее - в пределах 3-4 от сайта связывания кальция,

(в) с целью улучшения координации между ионом кальция и кальций-связывающими остатками, например, за счет улучшения взаимодействия между данным ионом и координирующими остатками или повышения числа координаций боковых групп в результате замены координирующей молекулы воды на боковую цепь аминокислоты,

(г) замена молекулы воды на координирующий кальций аминокислотный остаток.

Предпочтительно аминокислотный остаток, предназначенный к модифицированию, находится в пределах 8 от иона Са²⁺, а предпочтительнее - в пределах 5 от иона Са²⁺. Аминокислотные остатки на расстоянии до 8 и до 5 , соответственно, могут быть легко установлены с применением того же самого метода, который использовали при установлении аминокислотных остатков на расстоянии 10 (см. пример 2).

В предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы, характеризующийся измененным связыванием ионов Са²⁺ по сравнению с исходной мальтогенной α-амилазой, несет замену аминокислотного остатка в соответствии с одним или несколькими нижеперечисленными остатками из состава аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

D17, А30, S32, R95, Н103, N131, Q201, I174 и (или) Н169,

V74, L75, L78, Т80, L81, Т87, G88, Y89, Н90, G91, Т94, R95, D96, F97, Y167, F168, Н169, Н170, N171, G172, D173, I174, S175, N176, D178, D179, R180, Y181, Е182, А183, Q184, К186, N187, F188, Т189.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену, соответствующую одной или большему числу следующих замен в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

D17E/Q, A30M/L/A/V/I/E/Q, S32D/E/N/Q, R95M/L/A/V/I/E/Q, Н103 Y/N/Q/D/E, N131D, Q201E, I174E/Q и H169N/D/E/Q,

V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/S/T/N/Q/K/H, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D/A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, Y167F/R/C, F168Y, H169N/Q/K, H170N/Q/K, N171D/E/ Q/H/R/K/G, G172A/T/S, D173N/S/T/Y/R/G, I174N/Q/L, S175T/A/N/D, N176 S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, T189N/ D/A/S/H/Y/G.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения в связи с изменением связывания Са²⁺ мальтогенной α-амилазой модифицируют частичную последовательность N28-P29-A30-K31-S32-Y33-G34 в соответствии с показанным в SEQ ID NO: 1.

Сходные замены могут быть внесены по эквивалентным положениям других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес модификации могут составлять произвольное сочетание одной или нескольких из перечисленных выше модификаций и любых других модификаций, описанных в данной заявке.

Другие замены

Варианты фермента, характеризующиеся улучшенной стабильностью, могут быть получены путем улучшения существующих или внесенных новых междоменных и внутридоменных контактов. Такая улучшенная стабильность может быть достигнута с помощью перечисленных далее модификаций.

Мальтогенная α-амилаза, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, может быть стабилизирована путем внесения одной или нескольких междоменных дисульфидных связей. Соответственно, в другом предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью и наличием по крайней мере одной «лишней» междоменной дисульфидной связи по сравнению с указанным исходным вариантом, причем указанный вариант включает модификацию в положении, соответствующем по крайней мере одному из следующих пар положений в последовательности SEQ ID NO: 1:

G326+S583; G618+R272; Т252+V433 и (или) А348+V487.

В более предпочтительном варианте данная замена соответствует по крайней мере одной из следующих пар:

G326C+S583C; G618C+R272C; Т252С+V433C и (или) А348С+V487C.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью и измененным междоменным взаимодействием по сравнению с указанным, исходным вариантом, причем указанный вариант включает замену в положении, соответствующем по крайней мере одному из следующих положений в последовательности SEQ ID NO: 1:

(i) F143, F194, L78;

(ii) A341, A348, L398, I415, T439, L464, L465;

(iii) L557;

(iv) S240, L268;

(v) Q208, L628;

(vi) F427, Q500, N507/ M508, S573; и

(vii) I510, V620.

В более предпочтительном варианте данная замена соответствует по крайней мере одной из следующих замен:

(i) F143Y, F194Y, L78Y/F/W/E/Q;

(ii) A341S/D/N, A348V/I/L, L398E/Q/N/D, I415E/Q, T439D/E/Q/N, L464D/E, L465D/E/N/Q/R/K;

(iii) L557Q/E/N/D;

(iv) S240D/E/N/Q, L268D/E/N/Q/R/K;

(v) Q208D/E/Q, L628E/Q/N/D;

(vi) F427E/Q/R/K/Y, Q500Y, N507Q/E/D, M508K/R/E/Q, S573D/E/N/Q; и/или

(vii) I510D/E/N/Q/S, V620D/E/N/Q.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью и наличием одного или нескольких солевых мостиков по сравнению с указанным исходным вариантом, причем указанный вариант включает замену в положении, соответствующем по крайней мере одному из следующих положений в последовательности SEQ ID NO: l.

N106, N320 и Q624.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену, соответствующую следующим заменам в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

N106R, N320E/D и (или) Q624E.

В другом варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью, причем указанный вариант включает замену в положении, соответствующем по крайней мере одному положению из следующих положений последовательности SEQ ID NO: 1:

К40, V74, S141, Т142, F188, N234, К249, D261, L268, V279, N342, G397, А403, К425, S442, S479, S493, Т494, S495, А496, S497, А498, Q500, К520, А555 и N595.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену, соответствующую одной или нескольким из следующих замен на пролин в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

V74P, S141P, N234P, К249Р, L268P, V279P, N342P, G397P, А403Р, S442P, S479P, S493P, Т494Р, S495P, А496Р, S497P, А498Р/ Q500P и (или) А555Р.

Другими предпочтительными заменами являются замены K40R, Т142А, F188I/L, D261G, К425Е, K520R и (или) N595I.

Аналогичным образом предпочтительным может быть то, чтобы один или несколько остатков гистидина, присутствующие в составе исходной мальтогенной α-амилазы, были бы заменены на иные, отличные от гистидина, остатки, такие как Y, V, I, L, F, М, Е, Q, N или D. Следовательно, в другом предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену аминокислотного остатка, соответствующую одному из следующих остатков в составе аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

Н103, Н220 и Н344.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену, соответствующую одной или нескольким из следующих замен в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

H103Y/V/I/L/F/Y, H220Y/L/M и H344E/Q/N/D/Y.

Предпочтительным может являться то, чтобы один или большее число остатков аспарагина или глутамина, присутствующие в составе исходной мальтогенной αа-амилазы, были бы заменены на остаток (остатки), на боковой цепи которого(ых) нет амида. Следовательно, в другом предпочтительном варианте Novamyl-подобный вариант включает замену аминокислотного остатка, соответствующую одному или нескольким следующим остаткам в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: I:

Q13, N26, N77, N86, N99, Q119, N120, N131, N152, N171, N176, N187, Q201, N203, N234, Q247, N266, N275, N276, N280, N287, Q299, N320, N327, N342, Q365, N371, N375, N401, N436, N454, N468, N474, Q500, N507, N513, Q526, N575, Q581, N621, Q624 и N664.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает замену, соответствующую одной или нескольким следующим заменам в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

Q13S/T/A/V/L/I/F/M, N26S/T/A/V/L/I, N77S/T/A/V/L/I, N86S/T/A/V /L/I, N99T/S/V/L, Q119T/S, N120S/T/A/V/L/I, N131S/T/A/V/L/I, N152T/S/V /L, N171Y/D/S/T, N176S/T/A/V/L/I, N187S/T/A/V/L/I, Q201S/T/A/V/L/I/F/M, N203D/S/T/A/V/L/I/ N234S/T/A/V/L/I, Q247S/T/A/V/L/I/F/M, N266S/T/A/V/ L/I, N275S/T/A/V/L/I, N276S/T/A/V/L/I, N280S/T/A/V/L/I, N287S/T/A/V/L/I, Q299L/T/S, N320S/T/A/V/L/I, N327S/T/A/V/L/I, N342S/T/A/V/L/I, Q365S/T/ A/V/L/I, N371S/T/A/V/L/I, N375S/T/A/V/L/I, N401S/T/A/V/L/I, N436S/T/A/ V/L/I, N454D/S/T/A/V/L/I, N468D/S/T/A/V/L/I, N474D/S/T/A/V/L/I, Q500 S/T/A/V/L/I/F/M, N507S/T/A/V/L/I, N513S/T/A/V/L/I, Q526D/S/T/A/V/L/I, N575S/T/A/V/L/I, Q581S/T/A/V/L/I/F/M, N621S/T/A/V/L/I, Q624S/T/A/V/L /I/F/M и N664D/S/T/A/V/L/I.

В другом варианте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется улучшенной стабильностью и улучшенными контактами в виде водородных связей по сравнению с указанным исходным вариантом, причем указанный вариант включает модификацию в положении, соответствующем одному или нескольким следующим положениям в последовательности SEQ ID NO:1:

I16, L35, М45, Р73, D76, D79, А192, I100, А148, A163+G172, L268, V281, D285, L321, F297, N305, К316, S573, А341, М378, А381, F389, А483, А486, I510, А564, F586, К589, F636, К645, А629 и (или) Т681.

В предпочтительном варианте эти модификации соответствуют одной или нескольким следующим заменам:

I16T/D/N, L35Q, М45К, P73Q, D76E, D79E/Y, A192S/D/N, I100T/S /D/N/E/Q, A148D/N/E/Q/S/T/R/K, A163Y+G172S/D/N, L268R/K, V281Q, D285R/K, L321Q, F297N/D/Q/E, N305K/R, K316N/D, S573N/D, A341R/K, M378R/K, A381S/D/N, F389Y, A483S/D/N, A486Q/E, I510R/K, A564S/D/N, F586S/D/N, K589S/D/Q/N, F636Y, К645Т, A629N/D/E/Q и (или) T681D/N/ E/Q/S.

Сходные замены могут быть внесены по эквивалентным положениям в состав других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес замены представляют собой любые сочетания одной или нескольких перечисленных выше замен с любыми другими модификациями, описанными в данной заявке.

Перед тем как приступить к конструированию варианта мальтогенной α-амилазы с целью достижения любой из поставленных выше задач, желательным является оценить будет или не будет представляемая аминокислотная модификация соответствовать структуре мальтогенной α-амилазы, например, исходя из параметров модели пространственной структуры исходной мальтогенной α-амилазы.

Варианты мальтогенной α-амилазы, характеризующиеся измененной термостабильностью и (или) измененным профилем зависимости ее активности от температуры.

Далее настоящее изобретение представляет вариант исходной мальтогенной α-амилазы, являющийся результатом замены, делеции или вставки одного или большего числа аминокислотных остатков, выполненных таким образом, чтобы получить вариант, характеризующийся измененной термостабильностью или измененным профилем зависимости ее активности от температуры.

Структура мальтогенной α-амилазы включает ряд уникальных внутренних полостей, которые могут содержать воду, и серию щелей. С целью повышения термостабильности конкретного полипептида желательным может являться снижение числа полостей и щелей, например, путем внесения одного или большего количества гидрофобных контактов, что предпочтительно достигается путем включения аминокислот с более крупными боковыми группами в непосредственной близости или в окружении такой полости. Например, предназначенные для модифицирования аминокислотные остатки - это те остатки, которые вовлечены в формирование этой полости.

Следовательно, в следующем аспекте настоящего изобретения представляется способ повышения термостабильности и (или) изменения зависимости активности фермента от температуры у исходной мальтогенной α-амилазы, причем данный способ включает:

(1) идентификацию внутренней полости или щели в составе исходной мальтогенной α-амилазы в пространственной структуре указанного полипептида;

(2) замену в составе такой структуры одной или большего числа аминокислотных остатков по соседству от данной полости или щели, идентифицированной на стадии (1), на другой аминокислотный остаток, который, исходя из структурных или функциональных параметров, определяется как обеспечивающий повышение гидрофобного взаимодействия и заполнение или сокращение размера данной полости или щели; и

(3) конструирование варианта исходной мальтогенной α-амилазы, определенной на стадии (2), и тестирование на термостабильность и (или) зависимость активности данного варианта от температуры.

Должно быть понятно, что полость или щель определяются аминокислотными остатками, окружающими указанные полость или щель, и что модифицирование указанных аминокислотных остатков существенно по заполнению указанных полости или щели или уменьшении их размера. Предпочтительным является то, чтобы модификация была заменой на остаток более крупной аминокислоты, например на такую, у которой боковая цепь имеет больший объем. Например, все аминокислоты - крупнее глицина, в то время как тирозин и триптофан крупнее фенилаланина. Конкретные аминокислотные остатки, определяемые далее, - это те остатки, которые в кристаллической структуре, как это было установлено, фланкируют рассматриваемую полость или щель.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения вариант мальтогенной α-амилазы с целью заполнения (как полного, так и частичного) полостей, расположенных внутри данной структуры, включает замену аминокислотного остатка, соответствующего одному или большему числу следующих остатков в составе аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

L5I, L75, L78, G88, G91, T94, V114, I125, V126, T134, G157, L217, S235, G236, V254, V279, V281, L286, V289, I290, V308, L321, I325, D326, L343, F349, S353, I359, I405, L448, Q449, L452, I470, G509, V515, S583, G625, L627, L628 и А670.

L71, S72, V74, L75, L78, Т80, L81, G83, Т84, D85, N86, Т87, G88, Y89, Н90, G91, T94, R95, D96, F97, Y167, F168, Н169, Н170, N171, G172, D173, I174, S175, N176, D178, D179, R180, Y181, E182, А183, Q184, К186, N187, F188, Т189, D190, А192, G193, F194, S195, L196.

В более предпочтительном варианте вариант мальтогенной α-амилазы включает одну или несколько замен, соответствующих следующим заменам в составе аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

L217 в сочетании с L75 (например, L217F/Y в сочетании с L75F/Y), L51W, L75F/Y, L78I, G88A/V/T, G91T/S/V/N, T94V/I/L, V114V/I/L, I125L/ M/F/Y/W, V126I/L, T134V/I/L/M/F/Y/W, G157A/V/I/L, L217V/I/M/F/Y/W, S235I/L/M/F/Y/W, G236A/V/I/L/M/F/Y/W, V254I/L/M/F/Y/W, V279M/I/L/F, V281I/L/M/F/Y/W, L286F, V289I/L/R, I290M/L/F, V308I/L/M/F/Y/W, L321I /M/F/Y/W, I325L/M/F/Y/W, D326E/Q, L343M/F/Y/W, F349W/Y, S353V/I/L, I359L/M/F/Y/W, I405M/L/Y/F/W, L448Y, Q449Y, L452M/Y/F/W, I470M/L/F, G509A/V/I/L/M/S/T/D/N, V515I/L, S583V/I/L/V, G625A/V/I/L/M/F/Y/W, L627M/F/Y, L628M/I/F/Y/W и A670V/I/L/M/F/Y/W.

L71I, S72C, V74I, L75N/D/Q/I/V, L78N/I, T80I/L/V/S/N/G, L81I/V/ S/T/N/Q/K/H, G83A/S/T/N/Q/E/D/R/H/L, T84S/A/N/D/G, D85A/T/S/N/G, N86Q/E/D/Y/H/K, T87S/I, G88A/S/T, Y89F, H90N/Q/K, G91A/S/T, T94N/D /A/M/V/I, R95K/Q, D96N/V/Q/I, F97Y, Y167F/R/C, F168Y, H169N/Q/K, H170N/Q/K, N171D/E/Q/H/R/K/G, G172A/T/S, D173N/S/T/Y/R/G, I174N/Q /L, S175T/A/N/D, N176S/T/H/Q/P, D178N/Q/E/K/H, D179Y/N/H, R180W, Y181R/F/C/L, E182D, A183S/C/G, Q184E, K186R, N187Q/E/L/F/H/K/V/L, F188Y/L/I/H/N, T189N/D/A/S/H/Y/G/ D190E/Q/H/N/K, A192T/D/E/N/K, G193A/S/T, F194Y, S195N/D/E/R/K/G, L196I.

Сходные замены могут быть внесены по эквивалентным положениям в составе других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес варианты являются сочетаниями одной или нескольких из перечисленных выше замен с любой другой модификацией, описанной в данной заявке.

Варианты мальтогенной α-амилазы с измененными параметрами расщепления субстрата

Одной из целей настоящего изобретения является изменение параметров расщепления мальтогенной α-амилазы. Следовательно, Novamyl гидролизует крахмал с образованием мальтозы (G2) и небольшого количества глюкозы (G1), но виртуально при отсутствии высших олигосахаридов (G3+).

Желательным может быть изменение параметров расщепления субстрата, например, таким образом, чтобы образовывать более высокие количества высших олигосахаридов, таких как мальтотриоза (G3), мальтотетраоза (G4) и мальтопентаоза (G5).

Вариант исходной мальтогенной α-амилазы, в котором параметры расщепления субстрата изменены по сравнению с упомянутым исходным вариантом, может быть сконструирован с применением способа, включающего:

(1) идентификацию участка связывания субстрата в составе исходной мальтогенной α-амилазы в модели ее трехмерной структуры, например, в сфере размером 4 от сайта связывания субстрата в соответствии с определением, данным выше в разделе «Сайт связывания субстрата»;

(2) замену согласно данной модели одной или большего числа аминокислотных остатков в составе субстрат-связывающего участка данной щели, идентифицированной на стадии (1), которые, как считается, вовлечены в контроль параметров расщепления исходного варианта, на аминокислотный остаток, который, исходя из структурных или функциональных соображений, обусловливает изменение параметров расщепления субстрата, или делецию одной или нескольких аминокислотных остатков в участке связывания субстрата, призванную обусловливать предпочтительные взаимодействия с субстратом, или добавление одной или нескольких аминокислот к участку связывания субстрата, призванное обусловливать предпочтительные взаимодействия с субстратом;

(3) конструирование варианта мальтогенной α-амилазы по результатам стадии (2) и тестирование параметров расщепления субстрата для данного варианта.

Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения представляется вариант исходной мальтогенной α-амилазы, который характеризуется измененным сайтом связывания субстрата по сравнению с указанным исходным вариантом, причем этот вариант включает модификацию в положении, соответствующем одному или нескольким следующим положениям в последовательности SEQ ID NO: 1:

V281 и (или) А629.

В предпочтительном варианте данный вариант включает модификацию, соответствующую следующему:

V281Q и (или) A629N/D/E/Q.

Сходные замены могут быть внесены по эквивалентным положениям в составе других мальтогенных α-амилаз. Представляющие конкретный интерес варианты являются сочетаниями одной или нескольких из перечисленных выше замен с любой другой модификацией, описанной в данной заявке.

Варианты мальтогенной α-амилазы, характеризующиеся улучшенной способностью подавлять ретроградацию крахмала и (или) зачерствение хлеба

Настоящее изобретение представляет варианты мальтогенной α-амилазы, обладающие улучшенной способностью подавлять ретроградацию крахмала и (или) зачерствение хлеба.

Предпочтительные варианты включают модификацию по одному или нескольким положениям, соответствующим следующим аминокислотным остаткам в последовательности SEQ ID NO: 1:

А30, К40, N115, Т142, F188, Т189, Р191, А192, G193, F194, S195, D261, N327, К425, К520 и N595.

В более предпочтительном варианте данный вариант включает одну или несколько модификаций, соответствующих следующим заменам в последовательности SEQ ID NO: 1:

A30D, K40R, N115D, Т142А, F188L, T189Y, Δ(191-195), D261G, N327S, К425Е, K520R и N595I.

Установление остатков в пределах 10 от ионов кальция.

Координаты были внесены в программу INSIGHT (BIOSYM Technologies). Приведенные пространственные координаты отображают связи между атомами. Показаны ионы, равно как и молекулы воды. Раздел программного пакета, нацеленный на формирование подуровней, был использован для получения подуровня в масштабе 10 вокруг ионов кальция для анализируемой структуры (команда ZONE). Все остатки, идентифицируемые по наличию атома в пределах обозначенного расстояния в 10 от иона кальция, были «отобраны» и перечислены с использованием команды LIST MOLECULE. Путем придания ионам имени «VAT CA» в координатном файле выстраивается сфера диаметром 10 вокруг всех атомов с именем «VAT CA». Конкретные остатки, идентифицированные таким путем, уже отмечались в разделе «Связывание кальция».

Установление полостей

Расшифрованная пространственная структура Novamyl, структурные координаты которой указывают на присутствие большого числа внутренних полостей и щелей. В анализе таких полостей обычно применяется программа Коннолли (В.Lee & F.M.Richards, 1971, J. Mol. Biol., 55, 379-400). В этой программе используется зонд с определенным радиусом для установления внешней и внутренней поверхностей конкретного белка. Наименьшая щель, выявляемая таким способом, равна по размеру радиусу зонда.

Для анализа расшифрованной структуры была использована модифицированная версия программы Коннолли, включенная в алгоритм программы INSIGHT. На первой стадии молекулы воды и ионы были удалены путем отделения этих атомов от выстроенной структуры. С использованием команды MOLECULE SURFACE SOLVENT площадь доступной для растворителя поверхности была подсчитана для всех атомов и остатков с использованием зонда с радиусом 1,4 и изображена графически вместе с изображением модели расшифрованной структуры. Внутренние полости после этого визуализуются в виде точечной поверхности, не имеющей связи со внешней поверхностью.

Параметры конкретных модификаций, призванных заполнить данные полости, были описаны выше в разделе, названном «Варианты, характеризующиеся измененной термостабильностью и (или) измененным профилем зависимости активности от температуры». На основании гомологии выстроенных структур и (или) данных сопоставления последовательностей могут быть сформированы мутации для гомологичных структур в составе мальтогенных α-амилаз.

Номенклатура модификаций аминокислот

Номенклатура, используемая в данном тексте для определения мутаций, по существу соответствует тому, что использовалось в международной патентной заявке WO 92/05249. Следовательно, обозначение F188H указывает на замену аминокислоты F (фенилаланин), находящейся в положении 188, на аминокислоту Н (гистидин). Обозначение V129S/T/G/V. обозначает замену V129 (валин в положении 129) на аминокислоты S, Т, G или V. Δ(191-195) обозначает делению аминокислот, находящихся в положениях 191-195. Обозначение 192-А-193 указывает на вставку А между аминокислотами в положениях 192 и 193.

Идентичность последовательностей полипептидов

Для целей настоящего изобретения уровень идентичности может быть легко определен в соответствии с методом, описанным у S.B.Needleman & С.D.Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443-445, при использовании следующих установок для сравнения полипептидных последовательностей: «gap penalty» - 3 балла, «gap extension penalty» - 0,1 балла. Расчеты могут быть осуществлены с применением программы GAP, входящей в состав пакета GCG (Program Manual Wisconsin Package, vers. 8 от 8 августа 1994 г.. Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI 53711, США).

Варианты по настоящему изобретению характеризуются уровнем идентичности аминокислот 1-686 последовательности SEQ ID NO: 1 по крайней мере 70%, предпочтительно по крайней мере 80%, например, по крайней мере 90% и, в частности, по крайней мере 95% или по крайней мере 98%.

Гибридизация

Подходящие условия эксперимента по установлению гибридизации между нуклеотидным зондом и гомологичной последовательностью ДНК или РНК включают предварительное замачивание фильтра, несущего фрагменты ДНК или РНК, которые предназначены для гибридизации, в буфере 5×SSC (буфер с хлоридом натрия и цитратом натрия: Sambrook et al., 1989) на 10 минут и прегибридизацию фильтра в растворе 5xSSC, 5х растворе Денхардта (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ультразвуковым облучением ДНК спермы лосося (Sambrook et al., 1989) с последующей гибридизацией в том же растворе, содержащем случайно праймированный (A.P.Feinberg & B.Vogelstein, 1983, Anal. Biochem., 132, 6-13) помеченный ³²Р-дЦТФ (специфическая активность метки > 1·10⁹ имп/мин на 1 мкг) зонд в течение 12 часов при примерно 45°С. Этот фильтр затем дважды промывают в течение 30 минут в 2×SSC, 0,5% SDS при по крайней мере 55°С (низкая степень жесткости), предпочтительно при по крайней мере 60°С (средняя степень жесткости), более предпочтительно при по крайней мере 65°С (средневысокая степень жесткости), более предпочтительно при по крайней мере 70°С (высокая степень жесткости) и даже более предпочтительно при по крайней мере 75°С (очень высокая степень жесткости).

Молекулы, которые гибридизуют с олигонуклеотидным зондом при таких условиях, выявляют путем экспонирования на рентгенографическую пленку.

Способы получения вариантов мальтогенной α-амилазы

Клонирование последовательности ДНК, кодирующей Novamyl-подобный полипептид

Молекула ДНК, кодирующая исходную мальтогенную α-амилазу, может быть выделена из любой клетки или микроорганизма, вырабатывающих рассматриваемую мальтогенную α-амилазу, с применением различных методов, известных в данной области техники, например из клеток палочки Bacillus штамма NCIB-11837.

Сначала должна быть сконструирована библиотека геномной ДНК и (или) кДНК, для чего используется хромосомная ДНК или пул мРНК того организма, который вырабатывает анализируемую мальтогенную α-амилазу. Затем, если аминокислотная последовательность α-амилазы известна, могут быть синтезированы гомологичные помеченные олигонуклеотидные зонды, которые используют для идентификации клонов, кодирующих мальтогенную α-амилазу, из состава геномной библиотеки, сформированной на материале анализируемого организма. С другой стороны, помеченный олигонуклеотидный зонд, включающий последовательности, гомологичные известному α-амилазному гену, могут быть использованы в качестве зонда для целей идентификации клонов, кодирующих мальтогенную α-амилазу, с применением условий гибридизации и промывки низкой степени жесткости.

Другой метод идентификации клонов, кодирующих мальтогенную α-амилазу, включает встраивание фрагментов геномной ДНК в состав экспрессирующего вектора, такого как плазмида, трансформацию негативных по α-амилазе бактерий полученной в результате библиотекой геномной ДНК и последующий высев бактерий-трансформантов на агаровые пластины, содержащие субстрат для мальтогенной α-амилазы: тем самым клоны, экспрессирующие активность мальтогенной α-амилазы, будут идентифицированы.

С другой стороны, последовательность ДНК, кодирующая данный фермент, может быть сформирована синтетическим путем с применением стандартных методик, например, фосфоамидатного метода, описанного у S.L.Beaucage & М.H.Caruthers (1981), или метода, описанного у Matthes et al. (1984). В фосфоамидатном методе олигонуклеотиды синтезируют, например, с применением автоматического синтезатора, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в состав подходящих векторов.

Наконец, последовательность ДНК может иметь смешанное «геномно-синтетическое» происхождение, являться смесью синтетической ДНК и кДНК-или смесью кДНК и геномной ДНК: их получают путем лигирования фрагментов синтетической ДНК, геномной ДНК или кДНК друг на друга, при том что эти фрагменты соответствуют различным фрагментам полноразмерной последовательности ДНК, для чего используются известные в данной области техники методы. Последовательность ДНК также может быть получена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфичных затравок, например, в соответствии с описанным в патенте США №4683202 или у R.K.Saiki et al. (1988).

Направленный (сайт-специфичный) мутагенез

После того, как была выделена последовательность ДНК, кодирующая мальтогенную α-амилазу, а также были идентифицированы желательные для модифицирования сайты, эти модификации могут быть внесены с применением синтетических олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды включают нуклеотидные последовательности, фланкирующие желательные для модифицирования сайты; мутантные нуклеотиды вносят в процессе синтеза этих олигонуклеотидов. В конкретном варианте метода одноцепочечный разрыв ДНК, предназначенный для последующего его заполнения последовательностью ДНК, кодирующей мальтогенную α-амилазу, создают в векторе, несущем ген мальтогенной α-амилазы. Затем синтетический нуклеотид, несущий желательную модификацию, отжигают на гомологичный участок данной одноцепочечной ДНК. Остающийся гэп затем заполняют с использованием ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова) и полученную конструкцию лигируют с использованием лигазы Т4. Конкретный пример применения данного метода описан у Morinaga et al. (1984). В патенте США №4760025 представляется внесение олигонуклеотидов, кодирующих множественные модификации, путем минимального изменения структуры кассеты. Однако даже большее разнообразие модификаций может быть внесено в любой момент времени в соответствии с методом Моринаги, поскольку могут быть внесены разнообразные олигонуклеотиды различной длины.

Другой метод внесения модификаций в последовательности ДНК, кодирующие мальтогенную α-амилазу, описаны у Nelson & Long (1989). Они включают 3-этапное формирование ПЦР-фрагмента, включающего желательную модификацию, внесенную с использованием синтезированной химическим путем цепи ДНК в качестве одной из затравок в реакциях ПЦР. На основе ПЦР-амплифицированного фрагмента ДНК-фрагмент, несущий данную модификацию, может быть выделен путем расщепления рестриктазами и снова встроен в состав экспрессирующей плазмиды.

Случайный мутагенез

Метод случайного мутагенеза эффективно применим в виде как локального, так и специфичного по участку случайного мутагенеза по крайней мере в отношении трех частей гена, транслирующегося в конечном счете в анализируемую аминокислотную последовательность, или же в отношении полноразмерного гена.

Случайный мутагенез последовательности ДНК, кодирующей исходную мальтогенную α-амилазу, может быть стандартным образом осуществлен с применением любого из известных в данной области техники методов.

В связи со сказанным выше, в следующем аспекте настоящего изобретения представляется способ создания варианта Novamyl-подобной α-амилазы, при том, что такой вариант характеризуется повышенной стабильностью при пониженном рН и низкой концентрации кальция по сравнению с исходной мальтогенной α-амилазы, причем этот способ включает:

(1) случайное мутирование последовательности ДНК, кодирующей исходную Novamyl-подобную α-амилазу;

(2) экспрессию мутантной последовательности ДНК, полученной на стадии (1), в клетке-хозяине;

(3) скрининг клеток-хозяев, экспрессирующих вариант Novamyl-подобной α-амилазы, который характеризуется измененными свойствами по сравнению с исходной Novamyl-подобной α-амилазой.

Стадию (1) описанного выше способа по настоящему изобретению предпочтительно осуществляют с использованием «легированных затравок» (т.е. затравок, содержащих «примеси»), как это описано здесь в рабочих примерах (см. далее).

Например, случайный мутагенез может быть осуществлен с использованием подходящего физического или химического мутагенного фактора, с использованием подходящего олигонуклеотида или путем включения последовательности ДНК-мишени в метод ПЦР-опосредованного мутагенеза. Более того, случайный мутагенез может быть осуществлен с использованием любого сочетания данных мутагенных факторов. Мутагенный фактор может быть, например, таким фактором, который индуцирует транзиции, трансверсии, инверсии, «спутывание», делеции и (или) вставки.

Примерами физических или химических мутагенных факторов, пригодных для' целей настоящего изобретения, являются ультрафиолетовое излучение (УФ), гидроксиламин, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG), O-метилгидроксиламин, азотная кислота, этилметансульфонат (ЭМС), бисульфит натрия, муравьиная кислота и аналоги нуклеотидов. При применении таких факторов мутирование обычно осуществляют путем инкубации последовательности ДНК, кодирующей исходный фермент, предназначенный к мутированию, в присутствии выбранного мутагенного фактора в подходящих для мутагенеза условиях, с последующим отбором мутировавшей ДНК, обладающей желательными свойствами.

В случае осуществления мутагенеза с использованием олигонуклеотида такой олигонуклеотид может быть «легирован» или «покрыт» тремя не соответствующими исходным нуклеотидами в процессе синтеза данного олигонуклеотида по положениям, которые должны быть изменены. Данный «легированный» или «покрытый» олигонуклеотид может быть сконструирован таким образом, чтобы кодоны нежелательных аминокислот удалялись. Данный «легированный» или «покрытый» олигонуклеотид может быть встроен в ДНК, кодирующую фермент мальтогенную α-амилазу с помощью любого из опубликованных методов, например, с применением ПЦР, ЛЦР или любой ДНК-полимеразы и лигазы, которые представляются подходящими.

Предпочтительно «легирование» осуществляют с применением «постоянно случайного легирования», при котором заданным является соотношение вариантов дикого типа и модификаций по каждому положению. Более того, «легирование» может быть направлено на обеспечение преимуществ для отдельных нуклеотидов и тем самым на предпочтительность внесения одного или нескольких конкретных аминокислотных остатков. «Легирование» может быть осуществлено, например, таким образом, чтобы обеспечить внесение 90% вариантов дикого типа и 10% модифицированных вариантов по каждому положению. Дополнительные аргументы в пользу выбора «легирующей системы» основываются на генетических соображениях и параметрах структуры белков. «Схема легирования» может быть осуществлена с помощью программы DOPE, которая, помимо прочего, обеспечивает исключение вероятности внесения стоп-кодона.

В случае применения метода ПЦР-опосредованного мутагенеза либо обработанный химически, либо необработанный ген, кодирующий исходную мальтогенную α-амилазу, вносят в ПЦР в условиях, которые обеспечивают повышение частоты неправильного включения нуклеотидов (Deshler, 1992; Leung et al., 1989, Technique, 1, 11-15).

Мутаторный штамм кишечной палочки E.coli (Fowler et al., 1974, Mol. Gen. Genet., 133, 179-191), дрожжей S.cereviseae или любого другого микроорганизма может быть использован для проведения случайного мутагенеза ДНК, кодирующей мальтогенную α-амилазу, например, путем трансформации мутаторного штамма плазмидой, несущей исходный фермент, культивирования этого мутаторного штамма, несущего данную плазмиду, и выделения мутировавшей плазмиды из клеток мутаторного штамма. Мутировавшая плазмида затем может быть использована для трансформации экспрессирующего организма.

Последовательность ДНК, предназначенная для мутирования, может присутствовать в геномной или кДНК-библиотеке, сформированной для организма, экспрессирующего исходную мальтогенную α-амилазу. С другой стороны, такая последовательность ДНК может присутствовать в составе подходящего вектора, такого как плазмида или фаг, который в таком случае может быть проинкубирован с мутагенным фактором или подвергнут его воздействию каким-либо иным способом.

Предлагаемая к мутированию ДНК также может присутствовать в клетке-хозяине, будучи либо интегрированной в геном упомянутой клетки, либо присутствуя в виде вектора, поглощенного этой клеткой. Наконец, предназначенная для мутирования ДНК может быть выделенной. Должно быть понятно, что подвергаемая случайному мутагенезу последовательность ДНК предпочтительно является или последовательностью кДНК, или геномной ДНК.

В некоторых случаях может быть стандартными путями осуществлена амплификация мутантной последовательности ДНК перед осуществлением стадии экспрессии (2) или скрининга (3). Такая амплификация может быть проведена в соответствии с методами, известными в науке, а предпочтительный в связи с данным случаем метод - это ПЦР-опосредованная амплификация с использованием олигонуклеотидных затравок, сформированных исходя из параметров нуклеотидной или аминокислотной последовательностей исходного фермента.

После инкубации с мутагенным фактором или иного его воздействия мутантную ДНК экспрессируют путем культивирования подходящей клетки-хозяина, несущего эту последовательность ДНК, в условиях, обеспечивающих такую экспрессию. Клеткой-хозяином, используемой для данной цели, может быть клетка, которая была трансформирована мутантной последовательностью ДНК, необязательно, находящейся в составе вектора, или клеткой, несущей последовательность ДНК, кодирующую исходный фермент, в процессе самого мутагенеза. Примеры подходящих клеток-хозяев таковы: грамположительные бактерии, такие как Bacillus subtilis, В. licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis. Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans или Streptomyces murinus, а также грамотрицательные бактерии, такие как Escherichia coli.

Мутировавшая последовательность ДНК может дополнительно включать нуклеотидную последовательность, кодирующую функции, обеспечивающие экспрессию данной мутировавшей последовательности ДНК.

Локальный случайный мутагенез

Случайный мутагенез может быть предпочтительно «сконцентрирован» в части рассматриваемой исходной мальтогенной α-амилазы. Это может иметь преимущества, например, тогда, когда некоторые участки данного фермента были идентифицированы, как играющие конкретную роль в обеспечении данного свойства этого фермента, а также в случае, когда модифицированный вариант, как ожидается, обеспечит в результате улучшенные свойства. Такие участки обычно могут быть идентифицированы тогда, когда расшифрована пространственная структура исходного фермента и в связи с конкретной функцией данного фермента.

Локальный (или специфичный по участку) случайный мутагенез обычно осуществляют с использованием методов ПЦР-опосредованного мутагенеза в соответствии с описанным выше или с применением любой другой методики, известной в данной области техники. С другой стороны, последовательность ДНК, кодирующая участок, предназначенный для модифицирования, может быть выделена, например, путем встраивания в состав подходящего вектора, и упомянутый участок может быть после этого подвергнут мутагенезу с использованием любого из методов мутирования, описанных здесь выше.

Для специфичного по участку случайного мутагенеза с точки зрения повышения стабильности связывания кальция у исходной мальтогенной α-амилазы мишенями могут быть выбраны кодоны по положениям в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1:

Остатки: участки:

16-33, 35-36, 40: 16-40

46-54, 56: 46-56

73-81: 73-81

87-89, 91, 93-96, 99-105, 109: 87-109

129-134, (145, 150): 129-134

167-172, 174, 177, 180-189: 167-189

196-202, 206-210: 196-210

228-235, 237: 228-237

378

637.

С точки зрения достижения улучшенного связывания субстрата, т.е. улучшения связывания с различными углеводами, такими как амилоза или амилопектин, получения вариантов мальтогенной α-амилазы, характеризующимся модифицированной, например, повышенной субстратной специфичностью, и (или) модифицированной, например, повышенной специфичностью по расщеплению, например, гидролизу субстрата, представляется, что следующие кодоны следующих участков аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, могут быть, в частности, выбраны мишенями для модифицирования с помощью локального, специфичного по участку мутагенеза:

70-97, 127-143, 174-198, 226-233, 255-270, 282-202, 324-331, 370-376.

Для специфичного по участку случайного мутагенеза с точки зрения изменения субстратной специфичности и (или) профиля зависимости активности от величины рН могут быть взяты в качестве мишеней следующие участки последовательности SEQ ID NO: 1: 70-97, 174-198.

Следующие участки могут являться мишенями с точки зрения повышения термостабильности: 70-109, 167-200.

Базовый метод случайного мутагенеза с использованием программы DOPE

Случайный мутагенез может быть осуществлен по следующим стадиям:

1. Выбор участков, представляющих интерес с точки зрения модифицирования исходного фермента.

2. Разграничение мутантных и немутантных сайтов в выбранном участке.

3. Выбор того типа мутаций, которые будут индуцированы, например, с точки зрения желательной стабильности и (или) путей конструирования данного варианта.

4. Выбор структурно подходящих мутаций.

5. Оптимизация соотношения выбора мутаций по стадиям 3 и 4.

6. Анализ распределения нуклеотидов с применением подходящего «алгоритма легирования».

7. Если это является необходимым, оптимизация желательных остатков с точки зрения реалий генетического кода: например, принятие во внимание особенностей генетического кода, например, обеспечение исключения стоп-кодонов; для специалиста будет ясно, что некоторые сочетания кодонов не могут быть использованы, поэтому их необходимо взаимоадаптировать.

8. Формирование затравок.

9. Проведение случайного мутагенеза с использованием этих затравок.

10. Отбор полученных в результате вариантов α-амилазы путем тестирования по желательным улучшенным свойствам.

Подходящие алгоритмы «легирования», необходимые для стадии 6, хорошо известны в данной области техники. Один из таких алгоритмов описан у D.Tomandl et al., 1997, J. Computer-Aided Mol. Design, 11, 29-38. Другим таким алгоритмом является программа DOPE (L.J.Jensen, K.V.Andersen, A.Svendsen & Т.Kretzschmar, 1998, Nuc l. Acids Res., 26, 697-702).

Экспрессия вариантов мальтогенной α-амилазы

Конструирование интересующего варианта осуществляется путем культивирования микроорганизма, несущего последовательность ДНК, кодирующего этот вариант, в условиях, эффективных для выработки данного варианта с последующим не являющимся обязательным выделением этого варианта из полученного в результате культурального бульона. Это описано в деталях ниже.

В соответствии с настоящим изобретением последовательность ДНК, кодирующая вариант, образующийся с применением способов, описанных выше, или методов, известных в науке, может быть экспрессирована в белок или полипептид с использованием экспрессирующего вектора, который обычно включает контрольные (регулирующие) последовательности, включающие промотор, оператор, сайт связывания на рибосоме, сигнал инициации трансляции и, что необязательно, генрепрессор или различные активаторные гены.

Рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий последовательность ДНК, кодирующую вариант мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению, может быть любым вектором, который может быть стандартным образом включен в стандартные процедуры рекомбинантной ДНК, а выбор такого вектора зачастую зависит от вида клетки-хозяина, в который его будут вносить. Следовательно, этот вектор может являться автономно реплицирующимся вектором, например вектором, который существует в виде внехромосомного элемента, а его репликация не зависит от репликации хромосомы, например, быть плазмидой, бактериофагом или экстрахромосомным элементом, минихромосомой или искусственной хромосомой. С другой стороны, такой вектор может быть вектором, который, в случае его внесения в клетку-хозяин, интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он встроился.

В этом векторе последовательность ДНК должна быть функционально соединена с подходящей промоторной последовательностью. Этот промотор может являться любой последовательностью ДНК, которая обеспечивает транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине и которая может происходить от генов, кодирующих белки, как гомологичные, так и гетерологичные для данной клетки-хозяина. Примерами подходящих промоторов для контроля транскрипции последовательности ДНК, кодирующей вариант мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению, особенно в случае клетки-хозяина бактериального происхождения, являются промотор lac-оперона E.coli, промоторы агаразного гена dagA Streptomyces coelicolor, промоторы α-амилазного гена (amyL) Bacillus licheniformis, промоторы гена мальтогенной амилазы (amyM) Bacillus stearothermophilus, промоторы α-амилазного гена (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, промоторы генов xylA и xylB Bacillus subtilis и т.п. Для контроля транскрипции в клетках-хозяевах грибковой природы примерами подходящих промоторов являются промоторы гена амилазы ТАКА A.oryzae, гена аспартопротеазы Rhizomucor miehei, гена нейтральной α-амилазы A.niger, гена стабильной α-амилазы A.niger, гена глюкоамилазы A.niger, гена липазы Rhizomucor miehei, гена щелочной протеазы A.oryzae, гена триозофосфатизомеразы A.oryzae или гена ацетамидазы A.nidulans.

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению также может включать подходящий терминатор транскрипции и, в случае эукариот, полиаденилирующие последовательности, функционально присоединенные к последовательности ДНК, кодирующей вариант мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению. Терминатор и последовательности полиаденилирования могут быть производными от тех же источников, что и промотор.

Этот вектор может дополнительно включать последовательность ДНК, обеспечивающую данному вектору способность реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются сайты начала репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.

Данный вектор также может включать селективный маркер, например ген, продукт которого комплементирует дефект клетки-хозяина, такой как гены dal В.subtilis или В.licheniformis, или ген, который детерминирует резистентность к антибиотику, такую как резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Более того, данный вектор может включать аспергилловые селективные маркеры, такие как гены amdS, argB, niaD и SC (маркер, детерминирующий резистентность к гигромицину), или же отбор может быть проведен с помощью котрансформации, например, в соответствии с описанным в международной патентной заявке WO 91/17243.

В то время как по ряду причин внутриклеточная экспрессия может быть предпочтительной, например, при использовании некоторых бактерий в качестве клеток-хозяев, в целом, предпочтительной является экспрессия за пределы клетки (т.е. секреция). В целом, упоминающиеся в данном тексте α-амилазы палочек рода Bacillus включают «предучасток», обеспечивающий секрецию экспрессированной протеазы в культуральную среду. Если желательно, этот «предучасток» (т.е. сигнальный сегмент) может быть заменен другим «предучастком» или сигнальной последовательностью, что выполняется стандартным образом путем замены последовательностей ДНК, кодирующих соответствующих «предучастков».

Процедуры, используемые для лигирования ДНК-конструкции по настоящему изобретению, кодирующей вариант мальтогенной α-амилазы, промотор, терминатор и другие элементы, соответственно, и для внесения их в состав подходящих векторов, несущих информацию, необходимую для осуществления репликации, хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989).

Клетку по настоящему изобретению, несущую либо ДНК-конструкцию, либо экспрессирующий вектор по настоящему изобретению в соответствии с определенным выше, преимущественно используют в качестве клетки-хозяина для выработки рекомбинантного варианта мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению. Эта клетка может быть трансформирована с использованием ДНК-конструкции по настоящему изобретению, кодирующей данный вариант, обычно путем интегрирования данной ДНК-конструкции (в одной или нескольких копиях) в состав хромосомы хозяина. Такое интегрирование обычно можно считать предпочтительным, потому что последовательность ДНК в этом случае с большей вероятностью будет стабильно поддерживаться в клетке. Интегрирование ДНК-конструкции в хромосомы клетки-хозяина может быть достигнуто с применением стандартных методов, например, с помощью гомологичной или негомологичной рекомбинации. С другой стороны, эта клетка может быть трансформирована с использованием экспрессирующего вектора в соответствии с описанным выше в связи с описанием различных типов клеток-хозяев.

Клетка по настоящему изобретению может быть клеткой высшего организма, такой как клетка млекопитающего или насекомого, но предпочтительно является клеткой микроорганизма, например бактериальной клеткой или грибковой (например, дрожжевой) клеткой.

Примерами подходящих бактерий являются грамположительные бактерии, такие как Bacillus subtilis, B.licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans или Streptomyces murinus, а также грамотрицательные бактерии, такие как E.coli. Трансформация бактерий может быть осуществлена, например, по методу трансформации протопластов или с использованием компетентных клеток с помощью известных подходов.

Дрожжи могут быть предпочтительно выбраны из видов родов Saccharomyces или Schizosaccharomyces, например Saccharomyces cerevisiae. Нитчатые грибы по преимуществу должны относиться к роду Aspergillus, например Aspergillus oryzae или Aspergillus niger. Грибковые клетки могут быть трансформированы с помощью такого процесса, как образование протопластов и трансформация этих протопластов с последующей регенерацией клеточной стенки с помощью известных подходов. Подходящая процедура трансформации клеток-хозяев аспергиллов описана в европейской патентной заявке ЕР 238023.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения представляется способ выработки варианта мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению, причем этот способ включает культивирование клетки-хозяина в соответствии с описанным выше в условиях, обеспечивающих выработку данного варианта, и выделение этого варианта из клеток и (или) культуральной среды.

Среда, используемая для культивирования клеток, может являться любой стандартной культуральной средой, пригодной для культивирования рассматриваемой клетки-хозяина и для обеспечения экспрессии варианта мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению. Подходящие культуральные среды доступны на коммерческой основе или могут быть приготовлены в соответствии с опубликованными прописями (например, в соответствии с описанным в каталогах Американской коллекции типовых культур-АТСС).

Вариант мальтогенной α-амилазы, секретируемый клетками-хозяевами, может быть стандартным образом выделен из культуральной среды с помощью хорошо известных процедур, включая отделение клеток от среды с помощью центрифугирования или фильтрования и осаждение белковых компонентов культуральной среды с помощью соли, такой как сульфат аммония, с последующим применением хроматографических процедур, таких как ионобменная хроматография, аффинная хроматография и подобное.

Тестирование вариантов мальтогенной α-амилазы.

Варианты мальтогенной α-амилазы, вырабатываемые с помощью любых способов, описанных выше, могут быть протестированы либо до, либо после очистки на их амилолитическую активность в скрининг-тесте, в котором измеряют способность данного варианта гидролизовать крахмал. Скрининг в соответствии со стадией 10 описанного выше метода случайного мутагенеза по настоящему изобретению может быть осуществлен стандартным путем с использованием теста на фильтрах по такой процедуре: микроорганизм, способный экспрессировать интересующую мутантную мальтогенную α-амилазу, инкубируют в подходящей культуральной среде и в условиях, благоприятных для секреции данного фермента, причем среда покрыта двумя фильтрами, включая белок-связывающий фильтр, помещаемый под другим фильтром, характеризующимся слабой способностью связывать белок. Микроорганизм выращивают на втором, т.е. на верхнем фильтре. После такой инкубации нижний белок-связывающий фильтр, на котором находятся ферменты, секретированные данным микроорганизмом, отделяют со второго фильтра, на котором находится данный микроорганизм. Белок-связывающий фильтр затем подвергают скринингу на желательную каталитическую активность и идентифицируют соответствующие им колонии микроорганизмов, присутствующие на втором фильтре. Первым фильтром, используемым для связывания каталитической активности, может быть любой связывающий белки фильтр, например нейлоновый или нитроцеллюлозный. Вторым фильтром, несущим колонии экспрессирующего организма, могут быть любой фильтр, который характеризуется низкой связываемостью белком или ее отсутствием вовсе, например целлюлозоацетатный или фильтр Durapore^ТМ.

Скрининг включает обработку первого фильтра, к которому прикреплен секретируемый белок, с использованием того субстрата, который позволяет выявлять α-амилазную активность. Каталитическая активность может быть выявлена с помощью красителя, флуоресценции, преципитации, рН-индикации, IR-поглощения или любого иного известного метода детекции каталитической активности. Детекционное соединение может быть иммобилизовано с использованием любого иммобилизующего агента, например агарозы, агара, желатина, полиакриламида, крахмала, фильтровальной бумаги, ткани или любого сочетания иммобилизующих агентов. Например, α-амилазная активность может быть выявлена с помощью помеченного красителем Cibacron Red амилопектина, который иммобилизуют на агарозу. На этом субстрате α-амилазная активность обусловливает появление зон на газоне, характеризующихся сниженной интенсивностью красного цвета.

Для целей скрининга вариантов на повышенную стабильность фильтр со связанными на нем вариантами мальтогенной α-амилазы может быть предобработан перед стадией детекции, описанным выше, с целью инактивации вариантов, которые не обладают повышенной стабильностью по сравнению с исходной мальтогенной α-амилазы. Эта стадия инактивации может включать, тем самым не ограничиваясь, инкубацию при повышенной температуре в присутствии забуференного раствора при любой величине рН в пределах 2-12 и (или) в буфере, содержащем другое соединение, для которого известно или предполагается обусловливание измененной стабильности, например, сурфактанты, EDTA, EGTA, компоненты пшеничной муки или любые другие подходящие добавки. Обработанные таким образом фильтры затем в конкретный момент времени быстро промывают в деионизованной воде и помещают на планшеты с целью выявления активности в соответствии с описанным выше. Условия выбирают таким образом, чтобы стабилизированные варианты проявляли повышенную каталитическую активность по сравнению с исходным вариантом после инкубации в детекционной среде.

Для целей скрининга вариантов с измененной термостабильностью фильтры со связанными на них вариантами инкубируют в буфере при данной величине рН (например, в диапазоне рН=2-12) при повышенной температуре (например, в диапазоне 50-110°С) в течение некоторого периода времени (например, в течение 1-20 минут) с целью инактивации практически всей исходной мальтогенной α-амилазы, промывают в воде, затем помещают непосредственно на детекционный планшет, содержащий иммобилизованный помеченный цибакроном красным амилопектин, и инкубируют до выявления активности. Сходным образом зависимая от рН стабильность может быть протестирована путем доведения рН буфера на описывавшемся выше этапе таким образом, чтобы исходная мальтогенная α-амилаза была инактивирована, что тем самым позволяет выявлять только те варианты, которые обладают повышенной стабильностью при анализируемой величине рН. Для целей скрининга вариантов, обладающих повышенной кальций-зависимой стабильностью кальциевые хелаторы, такие как этиленгликоль-бис-β-аминоэтиловый эфир N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), добавляют к инактивационному буферу в концентрации, которая обеспечивает инактивацию исходной мальтогенной α-амилазы, в условиях, которые дополнительно определяют, такие как рН буфера, температура или конкретная продолжительность инкубации.

Варианты по настоящему изобретению могут быть подходящим образом протестированы на гидролизующую крахмал активность данного варианта, например, путем культивирования клеток-хозяев, трансформированных последовательностью ДНК, кодирующей вариант, на содержащей крахмал агарозной пластине, и идентификации гидролизующих крахмал клеток-хозяев в соответствии с описанным выше. Дальнейшее тестирование в связи с измененными свойствами, включая специфическую активность, субстратную специфичность, параметры расщепления, термоактивацию, термостабильность, зависимость активности от величины рН или ее оптимум, зависимую от рН стабильность, зависимость активности от температуры или ее оптимум, трансгликозилирующую активность, стабильность и любой другой представляющий интерес параметр, может быть осуществлено на материале очищенных вариантов в соответствии с методами, известными в данной области техники, как это описано ниже.

Гидролиз β-ограниченного декстрина мальтогенной α-амилазой

Другой важный параметр в оценке субстратной специфичности вариантов мальтогенной α-амилазы может быть степенью, с которой такие ферменты способны гидролизовать крахмал, который был на уровне истощения обработан β-амилазой с экзогликозилазной активностью. Для скрининга вариантов, которые характеризуются параметрами гидролиза на таком субстрате, отличающимися от параметров, характерных для исходной мальтогенной α-амилазы, осуществляют следующий тест: β-ограниченный декстрин приготавливают путем инкубации 25 мл 1%-ного амилопектина в буфере Мак-Иллвейна (48,5 мМ цитрата натрия и 193 мМ фосфата натрия - рН=5,0) с 24 мкг/мл β-амилазы в течение ночи при 30°С. Негидролизованный амилопектин (т.е. β-ограниченный декстрин) осаждают 1 объемом 98%-ного этанола, промывают и снова растворяют в воде. 1 мл β-ограниченного декстрина инкубируют с 18 мкл фермента (при 2,2 мг/мл) и 100 мкл 0,2 М цитрато-фосфатного буфера (рН=5,0) в течение 2 часов при 30°С и анализируют с помощью ВЭЖХ в соответствии с описанным выше. Полный гидролиз β-ограниченного декстрина осуществляют в 2 М соляной кислоты при 95°С. Концентрацию восстановленных остатков измеряют с помощью методов, известных в данной области техники.

Аффинность по связыванию кальция

Нарушение пространственной укладки мальтогенной α-амилазы в результате нагревания или обработки денатурирующими агентами, такими как гуанидингидрохлорид, сопровождается снижением интенсивности флуоресценции, а утрата ионов кальция приводит к нарушению укладки («анфолдингу»). Следовательно, аффинность варианта мальтогенной α-амилазы в отношении кальция может быть измерена по уровню флуоресценции перед и после инкубации варианта (например, при концентрации 10 мг/мл) в буфере (например, 50 мМ HEPES - рН=7,0) с различными концентрациями кальция (например, в диапазоне 1-100 мМ) или EGTA (например, в диапазоне 1-1000 мМ) в течение достаточно длительного периода времени (например, 22 часа при 55°С).

Измеренная флуоресценция (F) объединяет вклады уложенной и неуложенной форм данного фермента. Следующее уравнение может быть выведено для описания зависимости F от концентрации кальция ([Са]):

F=[Ca]/(K_diss+[Са])(а_N-b_Nlog([Са]))+K_diss/(K_diss+[Са])(а_U-b_Ulog([Ca])),

где a_N - флуоресценция нативной (уложенной) формы данного фермента; b_N -линейная зависимость а_N от логарифма концентрации кальция (определяемой экспериментально); а_U - флуоресценция неуложенной (денатурированной) формы, и b_U - линейная зависимость а_U от логарифма концентрации кальция. K_diss - константа связывания кальция для равновесного процесса, определяемого следующим образом:

K_diss

N-Ca≪U+Са (N = нативный фермент; U = неуложенный фермент).

Действительно, процесс «раскручивания» пространственной структуры протекает медленно и является необратимым. Скорость «раскручивания» зависит от концентрации кальция, и такая зависимость для данного фермента представляет возможность определять аффинность по связыванию кальция данным ферментом. Путем определения стандартных условий реакции (например, 22 часа при 55°С) может быть осуществлено полноценное сравнение величин K_diss для различных вариантов мальтогенной α-амилазы.

Промышленное применение

Варианты мальтогенной α-амилазы по настоящему изобретению характеризуются ценными свойствами, которые могут обеспечивать преимущества в случае их промышленного применения в различных областях. В частности, данный фермент может иметь практическое значение для замедления или предотвращения ретроградации и, соответственно, зачерствения крахмалосодержащих пищевых продуктов, что является типичной проблемой хлебопекарской промышленности.

Данный вариант может быть использован для приготовления собственно хлеба, а также других хлебобулочных изделий в соответствии со стандартными технологиями, известными в данной области техники.

Можно считать, что модифицирование крахмальной фракции путем использования настоящего изобретения приведет к увеличению объемов продукции хлебопечения и улучшит их вкусовые качества, такие как аромат, осязательные свойства, вкус и цвет «корочки».

Вариант мальтогенной α-амилазы может быть использован в качестве единственного фермента или в качестве базовой каталитической активности в сочетании с одним или несколькими дополнительными ферментами, такими как ксиланаза, липаза, глюкооксидаза и другие оксидоредуктазы, или амилолитический фермент.

Варианты фермента по настоящему изобретению также найдут свое применение в качестве компонента моющих средств (детергентов), предназначенных для стирки, мытья посуды и чистки твердых поверхностей. Некоторые из вариантов, в частности, применимы в процессах производства линейных олигосахаридов или в выработке из крахмала подслащивающих веществ и этилового спирта, и (или) при химической чистке текстильных изделий. Условия для стандартных процессов конверсии крахмала, включая процессы ожижения и (или) осахаривание крахмала, описаны, например, в патенте США №3912590 и европейских патентных заявках №№252730 и 63909.

Далее настоящее изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами, которые не призваны в чем бы то ни было ограничить масштаб настоящего изобретения, заявленный в формуле изобретения.

Стандартизация мальтогенной амилазы в MANU

Одна «новая единица мальтогенной амилазы» (MANU) - это такое количество фермента, которое в стандартных условиях будет расщеплять 1 мкмоль мальтотриозы за 1 минуту. Под стандартными условиями понимается: наличие 10 мг/мл мальтотриозы, температура 37°С, рН=5,0, время реакции 30 минут.

Зависимость от величины рН определяют путем повторения такого измерения при одинаковых условиях, но при различных величинах рН.

Примеры

Пример 1

Конструирование варианта Novamyl, характеризующегося измененной зависимостью активности от рН

Novamyl экспрессируется в клетках сенной палочки Bacillus subtilis с плазмиды, обозначаемой здесь как pLBei110. Эта плазмида включает ген amyM, экспрессия которого обеспечивается собственным промотором, и полноразмерный ген, кодирующий амилазу Novamyl, такую же, как, например, у штамма DSM-11837. В составе этой плазмиды имеется сайт начала репликации (ori), происходящий от плазмиды pUB010, и маркерный ген резистентности к канамицину, необходимый для целей отбора. Плазмида pLBei010 показана на фиг.1.

Последовательности затравок

Сайт-специфичные мутации Novamyl конструировали с применением метода мегапраймеров, существо которого описано у Kammann et al., 1989. Вкратце, мутантную олигонуклеотидную затравку используют в реакции ПЦР вместе с подходящей затравкой, маркирующей концевой участок противоположной цепи ДНК, с получением предварительного ПЦР-продукта. Этот продукт затем используют в качестве «мегапраймера» вместе с другой затравкой, маркирующей концевой участок противоположной цепи ДНК, с получением двухцепочечного ДНК-продукта. Этот продукт конечной реакции ПЦР стандартным образом использовали для замены соответствующего ДНК-фрагмента в составе плазмиды pLBei010, применяя стандартные процедуры клонирования. Эти мутанты напрямую использовали для трансформации клеток Bacillus subtilis штамма SHa273, являющегося производным штамма 168 Bacillus subtilis и имеющего генный статус [apr^-, npr^-, amyE^-, amyR2^-], - его получали с помощью методов, известных в данной области техники.

Олигонуклеотидные затравки, использовавшиеся при конструировании описываемых вариантов, перечислены ниже:

Последовательность варианта (5'→3')

F188H: SEQ ID NO: 3

F188E: SEQ ID NO: 4

F284E: SEQ ID NO: 5

F284D: SEQ ID NO: 6

F284K: SEQ ID NO: 7

N327D: SEQ ID NO: 8

Последовательность варианта (3'→5'):

Т288К: SEQ ID NO: 9

T288R: SEQ ID NO: 10.

Варианты по остаткам аспарагина - F284, Т288 и N327 - были получены с использованием затравок А189 (SEQ ID NO: 11) и В649 (SEQ ID NO: 12), взятых в качестве концевых затравок.

Вариант по аминокислоте F188 - F188L - и вариант T189Y были получены с использованием затравок А82 (SEQ ID NO: 13) и В346 (SEQ ID NO: 14), взятых в качестве концевых затравок.

ПЦР-продукты, несущие желательные модификации, были очищены, расщеплены подходящими ферментами, разделены с помощью электрофореза в агарозном геле и экстрагированы с последующим осаждением в этанол в присутствии гликогена, ресуспендированием в воде и лигированием в состав плазмиды pLBei010, которая была предварительно расщеплена теми же подходящими рестриктазами, а полученную конструкцию использовали для трансформации клеток Bacillus subtilis штамма SHa273. Размеры полученных трансформантов определяли методом ПЦР колоний, а тестирование наличия вставки или удаление отдельных рестрикционных сайтов осуществляли путем рестриктазного расщепления. Дававшие позитивный ответ колонии проверяли путем прямого секвенирования ДНК в соответствии с известным в науке.

Ферментация

Мутантные клоны B.subtilis SHa273 культивировали в течение ночи на агаровых пластинах LB-Kana (10 мкг/мл) с крахмалом при 37°С. Колонии с такой пластины ресуспендировали в 10 мл бульона Luria. По 1/6 каждой такой суспензии высевали в 500-мл шейкерные колбы, содержащие по 100 мл культуральной среды PS-1 (среда на основе соевой муки и сахарозы), канамицин в конечной концентрации 10 мкг/мл и 100 мкл 5 М NaOH. Величину рН доводили до 7,5 добавлением едкого натра перед посевом. Культуры инкубировали в течение 5 дней при 30°С с перемешиванием при 270-300 об/мин.

Очистка фермента

Крупные частицы из культуральной среды удаляли путем флокуляции перед проведением аффинной хроматографии. В качестве катионного и анионного осадителей хлопьев (флокулянтов) использовали, соответственно, Superfloc C521 (American Cyanmide Co.) и Superfloc A130 (American Cyanmide Co.).

Суспензию культуры разбавляли в соотношении 1:1 деионизованной водой и рН доводили до приблизительно 7,5. При перемешивании добавляли 0,01 мл 50% (м/м) CaCl₂ в расчете на 1 мл разбавленной культуры. По 0,015 мл 20% (м/м) натрий-алюмината на 1 мл разбавленной культуры титровали с использованием 20%-ной муравьиной кислоты, поддерживая рН в диапазоне 7-8. При перемешивании добавляли 0,025 мл 10% (о/о) C521 на 1 мл разбавленной культуры, а затем добавляли 0,05 мл 1% (м/о) А130 на 1 мл разбавленной культуры до того момента, как наблюдалось завершение флокуляции. Полученный раствор центрифугировали при 4500 об/мин в течение получаса. Фильтрацию осуществляли с использованием фильтра с порами размером 0,45 мкм с целью исключения попадания крупных частиц и любых оставшихся бактерий. Отфильтрованный раствор хранили при -20°С.

Иммобилизация α-циклодекстрина на DSV-агарозу

100 мг α-циклодекстрина молекулярной массы 972,86 г/моль (Fluka, №28705) растворяли в 20 мл сочетающего буфера (0,5 М Na₂CO₃,_{рН=11). 10 мл DSV-агарозы (Mini-Leak, Medium -10-20 ммоль/л агарозы, активированной дивинилсульфоном - Kem-En-Тес) тщательно промывали деионизованной водой, затем высушивали при разрежении и переносили в раствор α-циклодекстрина. После перемешивания данной реакционной смеси в течение 24 часов при комнатной температуре гель промывали деионизованной водой и затем 0,5 М раствором KHCO3. Этот гель переносили в блокировочный буфер (20 мл 0,5 М КНСО3+1 мл меркаптоэтанола), перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем промывали деионизованной водой.}

Аффинная хроматография

Амилазные варианты очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием ВЭЖХ-системы Pharmacia FPLC. С целью доведения рН к фильтрату, полученному в результате флокуляции? добавляли 0,04 объема 1 М ацетата натрия (рН=5) и добавляли CaCl₂ при конечной концентрации 10^-10 М. Полученный раствор отфильтровывали и дегазировали. Колонку Pharmacia ХК16 приготавливали с использованием 10 мл иммобилизованного α-циклодекстрина, затем уравновешивали ее уравновешивающим буфером (25 мМ ацетата натрия - рН=5), которым колоночный объем промывали примерно 10 раз. Фильтрат загружали на колонку ХК16, которую затем промывали уравновешивающим буфером до тех пор, пока из промывочного буфера полностью не исчезал белок. Колонку промывали уравновешивающим буфером, содержащим 0,5 М NaCl, с целью вымывания неспецифического материала с последующей дополнительной 2-3-разовой промывкой колоночного объема уравновешивающим буфером. Все указанные промывки осуществляли при скорости потока 10 мл/мин. Специфически связанный материал элюировали с использованием раствора 2% α-циклодекстрина в промывочном буфере и отбирали с использованием коллектора для жидкостной хроматографии Pharmacia LCC-500+ при скорости потока 5 мл/мин.

Пример 2

Зависимость активности вариантов от величины рН

Варианты, сконструированные в соответствии с предыдущим примером, были протестированы на активность при различных значениях рН следующим образом.

Колориметрический глюкозооксидазнопероксидазный тест, выявляющий высвобождающуюся из мальтотриозы или амилопектина глюкозу, использовали для определения активности в градиенте рН для вариантов анализируемого фермента (Glucose/GOD-Perid^® Method, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Уровень активности оценивали в буфере с 25 мМ цитратфосфата, 0,1 мМ CaCl₂ при значениях рН 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 и 8,6. Величину рН в использованном буфере доводили с помощью едкого натра, а ферменты разбавляли в 25 мМ цитратно-фосфатном буфере (рН=5). Измерения проводили в двух повторностях с получением среднего значения. Все значения отнесены к величине рН, при которой наблюдается наивысший уровень активности.

Полученные результаты, суммированные в нижеприведенной таблице, указывают на то, что каждый из вариантов характеризуется измененным профилем зависимости его активности от рН по сравнению с исходным вариантом Novamyl. Наивысший уровень активности каждого варианта принят за 100% и активность этого же варианта, определяемая при других значениях рН, представлена процентом от максимальной величины.

МодификациирН 2,02,53,03,54,04,55,05,56,06,57,07,58,08,6Нет (исход.)0008478010095918066393530F188H100132977991008859393127F188E0002276289100937146282018T288R0008517794100867350342712N327D117276795100987733191150

Далее, некоторые варианты Novamyl были протестированы по их активности при рН=4,0 и 5,0, причем активность самого варианта Novamyl при том же рН была принята за 100%. Активность была определена по гидролизу мальтотриозы (10 мг/мл) при 60°С с добавлением 50 мМ ацетата натрия и 1 мМ CaCl₂. Полученные результаты выражены отношением между активностью при рН=5,0 и рН=4,0:

МодификациирН=5,0 / рН=4,0N131D0,24I174Q0,31G397P0,40H103Y0,40Δ262-2660,47S32Q0,53S32D0,55Т142А+D261G0,62G370N+N371G0,66S32N0,68N176S0,79D17E0,80нет (исходный)1,00Δ1911,39192-А-1931,61I174E1,80192-A-G-1931,90Δ1922,22

Полученные результаты показывают, что варианты с более высоким или более низким оптимумом рН могут быть получены в соответствии с настоящим изобретением.

Пример 3

Термостабильность вариантов

Инкубация при 80°С

Термостабильность ряда вариантов Novamyl была протестирована путем инкубации водного раствора при 80°С и при рН=4,3 и измерения остаточной амилазной активности через различные периоды времени. Исходный фермент - Novamyl - был использован для сравнения. Полученные результаты выражены величиной остаточной активности через различные отрезки времени, как проценты от исходной активности.

Модификации05 мин.10 мин.15 мин.20 мин.25 мин.Нет (исходный)100239310F188L+V336L+T525A1006349485247F188I+Y422F+I660V1007160514338N115D+F188L1007360514439A30D+K40R+D261G1003824151310T142A+N327S+K425E+
K520R+ N595I1004739251911F188L+D261G+T288P1006067666367K40R+F188L+D261G+
А483Т1005648403630Т288К10064311874

Представленные выше данные показывают отчетливо повышенную термостабильность для вариантов по сравнению с исходной амилазой.

Инкубация при 85°С с кальцием

Вариант Novamyl S32E был протестирован путем инкубации с 1 мМ ионов кальция при 85°С в течение 15 минут. Этот вариант продемонстрировал остаточную активность на уровне 48%, в то время как исходный фермент (Novamyl) характеризовался остаточной активностью 32% при тех же самых условиях.

DSC

Далее, термостабильность была протестирована с тем же вариантом Novamyl с помощью метода DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия) при рН=4,3 или рН=5,5. Опять-таки для сравнения была взята исходная амилаза. Полученные результаты выражены в величине температуры, обусловливающей денатурацию (Tm).

МодификацииTm при рН=4,3Tm при рН=5,5Нет (исходный вариант)79°С88°СN115D+F188L86°С92°СT142A+N327S+K425E+K520R+N595Iне определено93°С

Полученные результаты показывают отчетливое улучшение термостабильности у обоих вариантов.

Пример 4

Специфическая активность вариантов

Амилазная активность была определена путем колориметрических измерений после обработки таблетками Phadebas при рН=5,0 при 60°С. Результаты по двум вариантам Novamyl относительно самого Novamyl были следующими.

МодификацииОтносительная амилазная активностьНет (исходный вариант)100192-А-193110Δ(191-195)300

Специфическая активность была дополнительно протестирована путем воздействия на мальтотриозу при рН=4,0 при 60°С в методе MANU, описанном выше. Полученные результаты показывают, что варианты G370N и N371G характеризуются активностью в отношении мальтотриозы на уровне 106% по сравнению с Novamyl.

Пример 5

Подавление ретроградации

Эффективность Novamyl и вариантов Novamyl в подавлении ретроградации определяли следующим образом. 730 мг 50% (м/м) суспензии амилопектина 0,1М ацетата натрия при выбранном значении рН (3,7, 4,3 или 5,5) смешивали с 20 мкл образца фермента и полученную смесь инкубировали в закрытой ампуле в течение 1 часа при 40°С с последующей инкубацией при 100°С в течение 1 часа с целью застудневания образцов. Затем образец хранили в течение 7 дней при комнатной температуре с целью рекристаллизации амилопектина. Включали контрольный вариант, не содержащий фермент.

После хранения осуществляли дифференциальную сканирующую калориметрию образца путем сканирования в диапазоне от 5°С до 95°С при скорости сканирования 90°С в час. Область под первым эндотермическим пиком на получаемой термограмме бралась как отражение количества ретроградировавшего (т.е. рекристаллизовавшегося) амилопектина, а относительное подавление ретроградации определяли по доле сокращения этой области (в %%) по отношению к параметру контроля (без фермента).

В нижеприведенной таблице эффективность фермента выражена в виде отношения относительного подавления ретроградации к дозе фермента, выраженной как MANU/мл.

рнМодификацииMANU/млОтносительное подавлениеЭффективность3,7A30D+K40R+D261G0,230,381,73,7T142A+N327S+K425E+K520R+N
595I0,070,294,13,7Нет (исходный вариант)0,270,381,44,3N115D+F188L0,010,18184,3Нет (исходный вариант)0,270,431,65,5Δ(191-195)+F188L+T189Y0,020,1265,5Δ(191-195)0,020,1475,5Δ(191-195)0,050,316,25,5N115D+F188L0,010,39395,5T142A+D261G0,140,533,85,5Нет (исходный вариант)0,270,491,8

Полученные результаты показывают, что ряд вариантов являются более эффективными по сравнению с исходной амилазой с точки зрения подавления ретроградации.

Пример 6

«Противостояние» вариантов зачерствению

Хлеб изготавливали по технологии European Straight Dough или из кислого теста с добавлением ферментов или без этого, а булки выпекали в закрытых крышками емкостях, чтобы избежать влияния объема. Выпеченный хлеб оставляли остывать на 2 часа и анализировали его структуру. Затем оставшиеся булки упаковывали в пластиковые сумки и хранили при комнатной температуре для структурного анализа в течение 1, 4 и 7 дней.

Анализ структуры (тектуры) каждой булки проводили путем отрезания 4 кусков: необходимое для этого усилие определяли при 25% компрессии (Р1), при 40% компрессии (Р2) и после 30-секундной постоянной 40% компрессии (Р3). Величину Р1 принимали как показатель твердости корки, а отношение Р3/Р2 -как показатель эластичности мякишной части. Степень ретроградации через 7 дней определяли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии в соответствии с описанным в примере 7.

European Straight Dough (pH=5,5-6,0)

Вариант Novamyl (T142A+N327S+K425E+K520R+N595I) был протестирован при дозах в пределах 0-2 мг фермента на 1 кг муки, а для сравнения использовали исходный вариант фермента (Novamyl).

Полученные результаты показали, что при равных дозах тестируемый вариант обеспечивает лучшую эластичность (показатель Р3/Р2) по сравнению с исходным ферментом через два часа и через 1 день. Результаты, полученные спустя 7 дней, показали, что вариант при дозах 1-2 мг/кг обусловливает гораздо более мягкий мякиш хлеба (меньшую твердость - показатель Р1) по сравнению с исходным ферментом в той же дозировке. Следовательно, вариант характеризуется улучшенным действием против зачерствения при 7-дневном периоде хранения хлеба.

Кислая мука (рН примерно 4,5)

Вариант Novamyl (F188L+D261G+T288P) был протестирован на кислой муке, а исходный фермент (Novamyl) был взят для сравнения. Следующие результаты были получены по показателям твердости (Р1) через 7 дней хранения, эластичности (Р3/Р2) через 4 и 7 дней и степени ретроградации через 7 дней.

ФерментДоза, мг на кг мукиТвердость (Р1) через 7 днейНет02590 
Исходный1203131912131570Вариант1143631226

ФерментДоза, мг на кг мукиЭластичность, через 4 дняЭластичность, через 7 днейНет00,490,47 
Исходный10,510,5230,530,51130,530,51Вариант10,590,5730,570,58

ФерментДоза, мг на кг мукиРетроградация через 7 дней (относительно контроля)Нет0100% 
Исходный1100%363%1332%Вариант146%320%

Полученные результаты показывают, что анализируемый вариант обладает отчетливо улучшенным влиянием на структуру хлеба, оцениваемую по твердости корки и мягкости мякиша, при выпекании его из кислой муки при рН=4,5. Доза варианта в 1-3 мг/кг предпочтительнее дозы 13 мг/кг исходного фермента по всем использовавшимся в анализе параметрам, и эластичность (мягкость), достигаемая при использовании варианта, не может быть достигнута никакой дозой исходного фермента.

Пример 7

Параметры расщепления субстрата вариантами

Параметры расщепления в ходе гидролиза крахмала анализировали на материале двух вариантов и исходного фермента (Novarnyl).

Приведенные ниже результаты показывают долю (%) по весу каждого из олигосахаридов (G1-G8), образующихся после 24-часовой инкубации, в 1% (м/о) крахмале с использованием 50 мМ ацетата натрия, 1 мМ CaCl₂ при рН=5/0 при 50°С. Олигосахариды были идентифицированы и оценены количественно с использованием метода ВЭЖХ.

ОлигосахаридИсходный вариантΔ (191-195)N115D+F188LG8-1/7-G7- 2,6-G6-7,51,4G5-10,12,1G4-21,111,3G3-28,710,7G296,528,361,9G13,5-12,6

Полученные результаты показывают существенные изменения параметров расщепления субстрата. Novamyl через 24 часа в основном обусловливает образование мальтозы, в то время как высшие олигосахариды отсутствуют. Напротив, два тестированных варианта обусловливают выработку существенных количеств мальтотриозы и высших олигосахаридов.

Цитированная библиография

Klein, С., et al. Biochemistry 1992, 31, 8740-8746.

Mizuno, H., et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283,

Chang, C., et al., J. Mol. Biol. (1993) 229, 235-238,

Larson, S.B., J. Mol. Biol. (1994) 235, 1560-1584,

Lawson, C.L., J. Mol. Biol. (1994) 236, 590-600,

Qian, M., et al., J. Mol. Biol. (1993) 231, 785-799,

Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect. В, 47, 527-535,

Swift, H.J., et al., Acta Crystallogr. sect B, 47, 535-544

A. Kadziola, Ph.D. Thesis: "An alpha-amylase from Barley and its Complex with: a Substrate Analogue Inhibitor Studied by X-ray Crystallography", Department of Chemistry University of Copenhagen 1993.

MacGregor, E.A., Food Hydrocolloids, 1987, Vol.1, No.5-6, p.

B. Diderichsen and L. Christiansen, Cloning of a maltogenic α-amylase from. Bacillus stearothennophilus, FEMS Microbiol. letters: 56: pp.53-60 (-1988).

Hudson et al. Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publications,

Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, 1989.

S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp.1859-1869.

Matthes et al., The EMBO J. 3.1984, pp.801-805.

R.K. Saiki et al., Sdence 239, 1988, pp.487-491.

Morinaga et at., (1984, Biotechnology 2:646-639)

Nelson and Long. Analytical Biochemistry 180, 1989, pp.147-151

Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111.

R. Higuchi, B. Krummel, and R.K. Saiki (1988). A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucl. Acids Res. 16:7351-7367.

Dubnau et al., 1971. J. Mol.Beiol.56. pp.209-221.

Gryczan et al., 1978. J. Bacteriol, 134, pp.318-329.

S.D. Erlech, 1977, Proc. Natl/ Acad. Sci. 74, pp.1680-1682.

Boel et al., 1990, Biochemistry 29, pp.6244-6249.

Kammann, M Laufe, J Schetl, J and Gronnenbom, В (1989) Nudeic Acids Research 20:4937-4938.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в пищевой промышленности, в частности в хлебопечении. На основании анализа результатов определения трехмерной структуры мальтогенной α-амилазы Bacillus предложены модификации аминокислотной последовательности нативного фермента, отличающиеся повышенной по сравнению с исходной формой стабильностью. Полученные стабильные варианты ос-амилазы содержат, по крайней мере, одну аминокислотную замену в положении К40, V74, H103, S141, Т142, F188, Н220, N234, К249, D261, L268, V279, N342, Н344, G397, А403, К425, S442, S479, S493, Т494, S495, А496, S497, А498, Q500, К520, А555 и/или N595. Приобретаемая мутантными формами α-амилазы устойчивость к внешним воздействиям при сохранении ферментативной активности обеспечивает возможность эффективной замены нативного фермента. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Вариант мальтогенной α-амилазы с повышенной стабильностью, обладающий по меньшей мере 70%-ной идентичностью аминокислотной последовательности SEQ ID N0:l, который получен путем замены аминокислотного остатка по меньшей мере в одном положении указанной последовательности, выбранном из группы, включающей положения К40, V74, Н103, S141, Т142, F188, Н220, N234, К249, D261, L268, V279, N342, Н344, G397, А403, К425, S442, S479, S493, Т494, S495, А496, S497, А498, Q500, К520, А555 и N595, и последующего отбора вариантов, проявляющих более высокую стабильность, чем исходная форма.2. Вариант мальтогенной α-амилазы по п.1, в котором замена представляет собой K40R, V74P, H103Y/V/I/L/F, S141P, Т142А, F188I/L, H220Y/L/M, N234P, К249Р, D261G, L268P, V279P, N342P, H344E/Q/N/D/Y, G397P, А403Р, К425Е, S442P, S479P, S493P, Т494Р, S495P, А496Р, S497P, А498Р, Q500P, K520R, А555Р и/или N595/I.