БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАРКИНСОНИЗМА Российский патент 2005 года по МПК A61K35/30 A61K35/48 A61P25/16 

Изобретение касается получения культуры генетически немодифицированных нейрональных стволовых клеток и способа лечения паркинсонизма.

Проблема нейродегенеративных заболеваний стала в последние годы особенно острой в связи с увеличением продолжительности жизни в развитых странах, например в США более 2 млн. человек страдают нейродегенеративными заболеваниями.

Нейродегенеративные заболевания обусловлены дегенерацией определенных отделов центральной нервной системы (ЦНС), в результате чего происходит дисбаланс в синтезе нейромедиаторов и, как следствие, - нарушение координации движений, умственных и мыслительных способностей.

В частности, при одном из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний, болезни Паркинсона, происходит дегенерация нейронов дофаминэргической системы, в первую очередь - нигростриатной. Дегенерация дофаминэргических нейронов черной субстанции приводит к нарушению синтеза дофамина в стриатуме, а в конечном итоге - к выраженным двигательным расстройствам и нарушению координации движений.

Попытки лечения паркинсонизма методами медикаментозной терапии и классической нейрохирургии не приносят желаемых результатов, давая лишь кратковременный положительный эффект. С середины 80-х годов разрабатывается новая технология лечения нейродегенеративных заболеваний - нейротрансплантация. Было показано, что стереотаксическое введение клеточной суспензии вентрального мезенцефалона плодов человека в нигростриатную систему больного по заранее рассчитанным координатам приводило к улучшению общего состояния и показателей двигательной активности больных. С помощью позитронно-эмиссионной томографии по включению меченого 6-L-(18F)-ДОФА было продемонстрировано усиление метаболизма дофамина в нигростриатной системе больных уже через несколько месяцев после операции, что, очевидно, обусловлено дифференцировкой трансплантированных нейронов и их интеграцией с мозгом реципиента (Угрюмов М.В. и др., 1996). Однако при более длительных сроках наблюдения за прооперированными больными (от 3 до 6 лет) реальный положительный эффект нейротрансплантации составлял до 30%. Возможно, снижение положительного клинического эффекта трансплантации связано с недостаточным количеством трансплантированных и прижившихся эмбриональных нейронов в стриатной системе мозга реципиента. Важными условиями, влияющими на повышение выживаемости трансплантированных клеток в мозге реципиента и достижение желаемого функционального эффекта, являются:

- возраст донора (Ferry, 1989.; Dunnett, 1991);

- способ подготовки биотрансплантата (тканевые - в виде небольших кусочков ткани, суспензия эмбриональных клеток, клеточные культуры - нейрональные стволовые клетки, плюрипотентные свойства которых позволяют использовать их в качестве источника донорских клеток для трансплантаций при различных нейродегенеративных процессах, модифицированные линии клеток (модифицированные стволовые клетки костного мозга - Kohyama J. et al., 2001);

- оптимальные сроки трансплантации;

- место и способ введения биотрансплантата:

трансплантация в паренхиму мозга;

в заранее подготовленную в мозге хозяина полость;

в желудочки мозга;

эндолюмбальное введение.

Эндолюмбальная трансплантация значительно эффективнее и обладает рядом преимуществ по сравнению с другими способами введения пересаживаемого материала.

Из ликворологии известно, что ликвор, омывающий спинной мозг, стремится вверх к головному мозгу, а ликвор головного мозга течет вниз, на уровне продолговатого мозга они смешиваются и проникают в обоих направлениях. Это дает возможность предположить, что трансплантированные клетки, введенные эндолюмбально, по ликворным пространствам могут проникнуть в ствол, кору, желудочки мозга, а затем мигрировать в очаг поражения и направленно дифференцироваться в нейроны, астро- и олигодендроглию; ликворное (субарахноидальное) пространство является адекватным местом для трансплантированных клеток по причине достаточной доставки кислорода и питательных веществ, а также низкого давления ткани на трансплантат; наличие в ликворе широкого спектра ростовых/нейротрофических факторов, повышающих выживаемость трансплантированных клеток и стимулирующих их дифференцировку; содержание в ликворе широкого спектра нейрогормонов, гормонов, нейротрансмиттеров и нейромодуляторов, которые способны обеспечить физиологическую регуляцию трансплантированных нейронов даже в отсутствие нервных связей (Wood, 1982); при эндолюмбальной трансплантации отсутствует повреждение нервной ткани хозяина (ткани мозга, мозговые оболочки и кровеносные сосуды головного мозга) в процессе введения трансплантата, отсутствие механического повреждения гематоэнцефалического барьера и снижение или отсутствие реакции иммунного ответа на пересаженные клетки, что значительно уменьшает возможность посттрансплантационных осложнений.

Эффект операции может быть существенно улучшен за счет увеличения количества пересаживаемого материала, а также за счет предварительной обработки трансплантируемых нейронов ростовыми (нейротрофическими) факторами для повышения выживаемости и стимуляции их дифференцировки. Открытие роли нейрональных ростовых факторов в подавлении нейродегенеративных процессов (Tuszynski M.H. et al., 1998) предполагает использование ростовых факторов для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Известный способ лечения паркинсонизма, выбранный в качестве прототипа, недостаточно эффективен, ему присуще более медленное и слабо выраженное восстановление неврологических функций.

Задачей настоящего изобретения является создание биотрансплантата для эндолюмбального введения, содержащего нейрональные стволовые клетки, что позволило устранить побочные эффекты при их трансплантации и повысить эффективность лечения паркинсонизма.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

В качестве биотрансплантата используют лабораторную линию человеческих плюрипотентных НСК (патент №2191388 от 18.12.2002). Культура генетически немодифицированных НСК, полученная из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов 15-20 недель гестации, представляет собой суспензию клонов НСК, селективно размноженных в условиях культивирования до количества 10(7)-10(9) плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер.

Биотрансплантат содержит 50-500 млн. НСК и 2 мл физиологического раствора. Биотрансплантат предназначен для эндолюмбального одномоментного введения.

Для лечения паркинсонизма используют указанный биотрансплантат НСК. Пациенту предварительно вводят внутримышечно дексазон, затем одномоментно эндолюмбально биотрансплантат, содержащий 50-500 млн. НСК. В случае недостаточной эффективности процедуру повторяют через 12 месяцев.

Способ базируется на экспериментально доказанном факте повышенного антипаркинсонического действия нейрональных стволовых клеток. Биологический препарат способствует замещению клеток пораженных подкорковых ядер у пациентов с паркинсонизмом. Биологический препарат также оказывает выраженное нейромедиаторное действие на функции головного мозга. Биологический препарат также улучшает иммунологический статус больных.

Способ выполняется в следующей последовательности. Предварительно, за один час до трансплантации нейрональных стволовых клеток, пациенту с паркинсонизмом, внутримышечно вводится 12 мг официнального раствора дексазона с иммунносупресивной целью.

Далее пациенту с паркинсонизмом, в условиях малой операционной, с соблюдением всех правил асептики и антисептики, лежа в положении больного на правом боку, обрабатывают операционное поле 70 градусным спиртом. После чего, в промежутке между третьим и четвертым поясничными позвонками, одноразовой стерильной иглой для люмбальной пункции, производят прокол до появления ликвора. После этого измеряют ликворное давление и берут 5 мл ликвора на общий анализ. Затем через ту же иглу вводится 50-500 млн. стерильных живых нейрональных стволовых клеток в двух мл физиологического раствора однократно медленно в течение двух минут. Далее иглу извлекают и накладывают асептическую повязку.

Больному назначается постельный режим в течение суток. На вторые-третьи сутки наблюдают улучшение состояния больного, которое выражается в уменьшении скованности, тремора, постуральных расстройств. Оценивался неврологический статус, степень выраженности симптомов по шкале Хен иЯра, унифицированной шкале оценки состояния больного паркинсонизмом, степень выраженности депрессии по шкале Монтгомери-Асберга. Улучшение состояния больных позволило уменьшить дозы противопаркинсонических средств.

Через 1,5 месяца у больных наблюдалась новая фаза улучшения состояния больных в виде улучшения осанки, оживлении мимики, улучшении походки, почерка.

Конкретные примеры осуществления изобретения.

Пример 1.

Больная М., 63 года, в течение 7 лет страдает дрожательно-ригидной формой паркинсонизма. Медикаментозная терапия оказывала незначительный положительный эффект, который со временем уменьшился.

Неврологический статус: Сознание ясное. Картина гипомимии, шаркающая походка, маломодулированная речь, выражение изменен почерк.

Мышечный тонус повышен по пластическому типу, имеет место симптом "зубчатого колеса". Олигобрадикинезия, мелкоразмашистый тремор, более выраженный в руках. Больная получала Наком в дозе 3 таблетки в сутки, Паркопан в дозе 3 таблетки в сутки.

Больной произведена эндолюмбальная трансплантация нейрональных живых стволовых клеток, манипуляцию перенесла удовлетворительно.

Первый положительный эффект наблюдался в течение первых двух суток после манипуляции, повторный положительный эффект через 1,5 месяца, у пациентки уменьшилась ригидность, оживилась мимика, исчезла шаркающая походка, улучшился почерк, нормализовалась речь, уменьшился тремор рук. Манипуляция позволила снизить дозу Накома до 1 таблетки в сутки. Увеличилась длительность однократной дозы Накома с 3-х часов до нейротрансплантации до 6 часов после нее.

Пример 2.

Больная Б. 65 лет. Диагноз: Паркинсонизм, ригидно-дрожательная форма. Страдает данным заболеванием 12 лет. Медикаментозная терапия оказывала незначительный положительный эффект. Больная получала Мидантан по 1 т. три раза в сутки, Мадопар по 1 т. три раза в сутки.

В неврологическом статусе: Сознание ясное. Отмечается депрессивные явления. Резко выраженная гипомимия, монотонная тихая речь, шаркающая походка, "симптом прилипшей к полу пятки". Мышечный тонус равномерно повышен по пластическому типу, симптом "зубчатого колеса". Среднеразмашистый тремор в конечностях.

Больной была произведена эндолюмбально трансплантация нейрональных стволовых клеток, манипуляцию перенесла удовлетворительно.

Первоначальный положительный эффект наблюдался на вторые сутки после манипуляции, вторая фаза улучшения состояния больной отмечалась через два месяца после манипуляции. У больной значительно уменьшились явления ригидности, тремора, постуральных расстройств. Оживилась мимика, исчезла шаркающая походка, нормализовалась речь. Значительно уменьшились явления депрессии. Проведенная манипуляция позволила снизить дозу Мидантана до 1 т. в сутки, дозу Мадопара до 1 т. в сутки.

Эффективность способа

Результаты лечения по предложенному способу и прототипу представлены в табл. 1, где зафиксирован факт более быстрого улучшения функции головного мозга и сокращение сроков лечения.

Выводы: Лечение по предложенному способу более эффективно и вызывает более стойкий и длительный эффект по сравнению с прототипом, позволяет значительно снизить дозы принимаемых противопаркинсонических препаратов.

В предложенном изобретении решена задача более быстрого восстановления и улучшения функций пораженного мозга и сокращения сроков лечения.

Указанная задача решена тем, что при паркинсонизме назначают эндолюмбальное введение 150 млн. нейрональных стволовых клеток в двух мл. физиологического раствора одномоментно. В случае тяжелых форм паркинсонизма повторяют указанную процедуру через 12 месяцев.

Таблица 1.Способы
леченияЧисло больныхПоказатели достигнутых положительных результатов леченияДинамика СкованностьТреморПостуральные расстройстваАбс.В %Абс.В%Абс.В %Лечение по прототипу68375435514058Лечение по предложенному способу322990,723712784

Изобретение относится к биофармакологии и медицине. Биотрансплантат для лечения паркинсонизма содержит активный компонент: культуру генетически немодифицированных нейрональных стволовых клеток (НСК), полученную из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга 15-20 недель гестации и селективно размноженную в условиях культивирования до количества 10⁷-10⁹ плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер, при содержании НСК 50-500 млн., и 2 мл физиологического раствора. Способ лечения паркинсонизма включает введение пациенту эндолюмбально 50-500 млн. НСК в 2 мл физиологического раствора, одномоментно. Предложенный биотрансплантат и способ лечения паркинсонизма позволяют быстро восстановить и улучшить функции пораженного мозга и сокращают сроки лечения, а также обеспечивает более стойкий и длительный эффект. 2 с и 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Биотрансплантат для лечения паркинсонизма, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента он содержит культуру генетически немодифицированных нейрональных стволовых клеток (НСК), полученную из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга 15-20 недель гестации и селективно размноженную в условиях культивирования до количества 10 (7) - 10 (9) плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер.2. Способ лечения паркинсонизма, характеризующийся тем, что пациенту эндолюмбально, одномоментно вводят биотрансплантат по п.1.3. Способ по п.2, где пациенту вводят 50-500 млн. нейрональных стволовых клеток.4. Способ по п.2, где пациенту предварительно внутримышечно вводят дексазон.5. Способ по п.2, где в случае тяжелых форм паркинсонизма процедуру повторяют.