Способ определения ангиотензина 11 Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 G01N33/535 

00

05

о

СП

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии, и может быть использовано при анализе ангиотензи- на II в биологических жидкостях.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.

На чертеже показана калибровочная кривая определения ангиотензи- на II.

Пример. А. Синтез конъюга- та ангиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином.

4 мг ангиотензина II и 22,2 мг кроличьего сывороточного альбумина растворяют в 200 мкл воды. приливают 200 мкл раствора -этил- 3(3-диэтиламинопропил)карбодиимида (0,4 мг/мл) и проводат реакцию при комнатной температуре и течение 30 мин при постоянном перемешивании.

По окончании реакции конъюгат диали- зуют против 0,15 М NaCl,

Б. Синтез конъюгата ангиотензина II с гемоцианином.

2,15 мг ангиотензина II и 15,6 мг гемоцианина растворяют в 250 мкл воды. Затем приливают 250 мкл раствора 1-этил-З(3-диэтиламинопропил)кар бо- диимида (0,47 мг/мл) и .проводят реакцию при кбмнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. По окончании реакции конъюгат диализуют против 0,15 NaCl.

В. Схема иммунизации.

В качестве антигена используют конъюгат ангиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином и конъюгат ангиотензина 11 с гемоцианином, смешанным с полым адъювантом Фрейнда 1:1 (об./об.). Иммунизацию проводят подкожно, внутримышечно в пятки задних лап кроликов (0,3 i-in смеси на

10

15

20

25

30

35

40

100 мкл водного раствора NaJ04 с концентрацией 21,4 мг/мл. Окислени пероксидазы проводят при комнатной температуре в течение 20 мин при постоянном перемешивании. Полученны раствор диализуют против 1 мМ аце ного буфера рН 4,7 в течение ночи при 4°С.

К окисленной пероксидазе добавл 2 мг ангиотензина II, растворенног в 510 мкл 14 мМ карбонатного буфер рН 9,6. Реакцию ковалентного связы вания пептида с ферментом проводят при комнатной температуре в течени 5 ч при постоянном перемешивании.

По окончании реакции в реакцион ную смесь при 4°С добавляют 50 мкл раствора NaBH с концентрацией 4 иг/мл.

По прошествии 2-х ч восстановле ный конъюгат помещают на диализ пр тив 1,5 л 0,01 М фосфатного 1буфер рН 7,4 при 4°С в течение 20-24 ч.

Полученный конъюгат ангиотензин II с пероксидазой хранят в 50% гли рина при -20°С.

Д. Определение содержания ангио тензина II в исследуемом образце.

К 100 мкл человеческой сыворотк крови больных и здоровых доноров в пластиковой пробирке приливают 400 мкл с 0,05М фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,01 М ЭДТА, 1 бычий сывороточный альбумин, 20 КШ/мл Гордокса, 100 мкл кроличьей антисыворотки, полученной про ангиотензина II, и 500 мкл конъюга ангиотензина II с пероксидазой и и кубируют при 4°С в течение 16-20 ч

В результате серологической реа ции образуется иммунный комплекс а тиген-антитело, который осаждают д бавлением 200 мкл бараньей антисыв

1фолика). В первые три инъекции кро- ротки против IgG кролика в 6%-ном

0

5

0

5

0

5

0

100 мкл водного раствора NaJ04 с концентрацией 21,4 мг/мл. Окисление пероксидазы проводят при комнатной температуре в течение 20 мин при постоянном перемешивании. Полученный раствор диализуют против 1 мМ ацетатного буфера рН 4,7 в течение ночи при 4°С.

К окисленной пероксидазе добавляют 2 мг ангиотензина II, растворенного в 510 мкл 14 мМ карбонатного буфера, рН 9,6. Реакцию ковалентного связывания пептида с ферментом проводят при комнатной температуре в течение 5 ч при постоянном перемешивании.

По окончании реакции в реакционную смесь при 4°С добавляют 50 мкл раствора NaBH с концентрацией 4 иг/мл.

По прошествии 2-х ч восстановленный конъюгат помещают на диализ против 1,5 л 0,01 М фосфатного 1буфера, рН 7,4 при 4°С в течение 20-24 ч.

Полученный конъюгат ангиотензина II с пероксидазой хранят в 50% глицерина при -20°С.

Д. Определение содержания ангиотензина II в исследуемом образце.

К 100 мкл человеческой сыворотки крови больных и здоровых доноров в пластиковой пробирке приливают 400 мкл с 0,05М фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,01 М ЭДТА, 1% бычий сывороточный альбумин, 20 КШ/мл Гордокса, 100 мкл кроличьей антисыворотки, полученной против ангиотензина II, и 500 мкл конъюгата ангиотензина II с пероксидазой и инкубируют при 4°С в течение 16-20 ч.

В результате серологической реакции образуется иммунный комплекс антиген-антитело, который осаждают добавлением 200 мкл бараньей антисыво

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии, пред- назначено для анализа ангиотензина II в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа. Для этого проводят синтез конъюгата ангиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином. По окончании реакции конъю- гат диализуют против 0,15 М NaCl. Также проводят синтез конъюгата ангиотензина -Ц с гемоцианином, смешанным с полным адъювантом Фрейнда 1:1. Иммунизацию проводят подкожно, в/мы- шечно. Первые 3 инъекции кроликам вводят конъюгатантиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином, последние 2 - конъюгат II с гемоцианином. Между инъекциями 2-х недельные перерывы. Отбор крови у кроликов через 7 дней после последней инъек- щш. Затем проводят синтез антиотен- зина II, меченого пероксидазой из эфена, выявление ангиотензина II ведут по активности пероксидазы в иммунном комплексе. i (Л

ликам вводят конъюгат ангиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином, в последние две - конъюгат ангиотензина II с гемоцианином. Межлу инъекциями двухнедельшле перерывы. Отбор крови у кроликов осуществляют через 7 дней после последней инъекции.

Г. Синтез ангиотензина II, меченного пероксидазой.

К 1,8 мг пероксидазы из хрена (,0), растворенной в 0,5 мл дистиллированной вода, приливают

0

5

растворе полизтиленгликоля в течение 30 мин при . После отделения осадка от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4°С и отмывки осадка 0,15 М раствором NaCl, содержащим 0,05% Твина, проводят регистрацию ферментативной активности нерастворимого иммунного комплекса. Для этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл субстратной смеси, содержащей 0,01% , 1 мг/мл аммонийной соли 2,2-азидо-ди-(3-этилбензтиазолин)

313

сульфокислоты в 0,01М цитратного буфера, рН 4,0. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 90 мин и регистрируют изменение оптической плотности при 414 им на спектрофотометре СФ-26.

Содержание ангиотензина II в не-: следуемой сыворотке определяют и| калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве исследуемого образца берут пробу с известным содержанием ангиотензина II и 100 мкл сыворотки, о тдиализовалной против 0,ООЗМ раствора ЭДТА, содержащего 0,15 М NaCl, в течение 48 ч при 4°С.

Полученные данные свидетельствуют о том, что предел детекции предлагае- мого способа значительно выше, чем у известного способа, что позволяет

Редактор М. Бандура Заказ 2490/46

Ц 2.5 $ 10 20

Составитель И. Башкаев

Техред М.Ходанич Корректор М.Максимишинец

Тираж 847Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

определить концентрации ангиотенэи- на II меньше 2 мг/мл.

Формула изобретенияСпособ определения ангиотензина II, включающий конкурентное взаимот действие между исследуемой пробой, меченным тест-антигеном и специфической антисывороткой с последующим отделением иммунного комплекса и вьг. явлением ангиотензина II по количест ву метки, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, используют антисыворотйу,

полученную путем последовательной иммунизации конъюгатом ангиотензина II с кроличьим сывороточным альбумином и конъюгатом ангиотензина II с гемоцианином, и выявление ангиотензина II ведут по активности перокси- дазы в иммунном комплексе.

ангиотензинй, пг/