СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ РЕТИНОПАТИИ Российский патент 2005 года по МПК G09B23/28 A61K35/18 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для моделирования ретинопатии, специфически связанной с одним из главных звеньев патогенеза ретинопатии сосудистой природы. Развитие и лечение сосудистых заболеваний глазного дна (центральная инволюционная хориоретинальная дистрофия, диабетическая и гипертоническая ретинопатия, ретинопатия недоношенных) в настоящее время остается еще нерешенной социальной и медицинской проблемой. В последнее время наметилась тенденция к увеличению распространенности сосудистых заболеваний глазного дна, одним из компонентов которых является ретинопатия. По классическому представлению (2) патологический процесс при ретинопатии связан с нарушением микроциркуляции в сетчатке. Вследствие этого повышается проницаемость сосудистой стенки с выходом в ткань сетчатки элементов крови, образованием кровоизлияний, микроаневризм и развитием процессов неоваскуляризации. Первичное поражение капиллярной системы глаза вызывает гипоксию сетчатки, что приводит к ряду необратимых изменений в ткани сетчатки.

Известен способ моделирования ретинопатии путем введения в полость глаза (стекловидное тело) животного химического вещества - 0,1 мл 2,7% раствора пуромицина (1). Недостатком этого способа является нарушение только белкового синтеза в сетчатке, без возможности моделирования одного из главных звеньев патогенеза ретинопатии - микроциркуляторных нарушений в сетчатке.

В 1997 г. стало известно (3) о ранее не известных свойствах ферропротеинов (гемоглобин, миоглобин) блокировать серотониновые рецепторы гладкой мускулатуры. Это явление сопровождается нарушением автоматизма сократительной активности гладкой мускулатуры кровеносных сосудов и тканевой гипоксией. Многочисленными исследованиями на животных и здоровых добровольцах показано наличие серотониновых рецепторов в глазу: радужке и цилиарных отростках, амакриновых клетках, внутренних и наружных плексиформных слоях сетчатки и палочках (4, 5).

Учитывая вышеизложенное, нами была поставлена задача разработать способ моделирования, ретинопатиии максимально приближенным к течению заболевания у человека.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение адекватной модели ретинопатии.

Технический результат достигается за счет нарушения микроциркуляции сетчатки, появления экстравазатов и угнетения электрической активности сетчатки как в центральной ее области, так и на периферии в результате блокады аутогемоглобином серотониновых рецепторов, находящихся в кровеносном русле сетчатки, фоторецепторах и нервном аппарате периферического отдела зрительного анализатора.

Способ осуществляется следующим образом. У кролика породы Шиншилла из краевой вены уха забирают 3,0 мл крови; затем ее центрифугируют в течение 10 минут при скорости 1000 оборотов в минуту, после чего супернатант удаляют, а эритроцитарную массу распределяют в стерильные одноразовые шприцы по 0,5-0,7 мл и помещают для разрушения эритроцитов в морозильную камеру (t=-17°С на 24 часа). Перед введением замороженную эритроцитарную массу размораживают при комнатной температуре, при этом она превращается в гемолизат - \лаковую кровь\, содержащий высвободившийся из эритроцитов гемоглобин. Полученный таким образом гемолизат вводят животным внутривенно по 0,5-0,7 мл ежедневно в количестве 10 инъекций.

Адекватность модели ретинопатии оценивали офтальмоскопически через день в течение 30 дней и электроретинографически. Для оценки функционального состояния сетчатки регистрировали электроретинограмму (ЭРГ) известным способом с помощью электрода - контактной линзы, накладываемой на предварительно анестезированный глаз кролика. Референтный и заземляющий электроды в виде игольчатых электродов закреплялись в скальпе животного. При регистрации ганцфельд ЭРГ (ГФ-ЭРГ) стимуляцию глаза проводили вспышками белого света с энергией на уровне роговицы 1 мкДж/см² и угловым размером стимула 110 градусов. По амплитудным и временным параметрам \а\ и \в\- волн ГФ-ЭРГ оценивалась функциональная активность всей сетчатки. Выполнялась ритмическая ЭРГ (РЭРГ) на низкие (12 Гц) и высокие (32 Гц) частоты стимуляции, позволяющая раздельно оценить нейрональную активность скотопической и фотопической систем сетчатки (энергетическая экспозиция вспышек равна 0,136 мкДж/см²). Указанные электрофизиологические исследования проводились в динамике (4 глаза, 36 исследований). Сначала оценивались исходные показатели \а\ - и \в\ волн ЭРГ и РЭРГ. Указанные исследования проводили до введения эритроцитарного аутогемолизата животным, сразу после окончания курса и спустя 2 недели после окончания курса введения гемолизата.

Предпринятые нами исследования показали, что на четвертые сутки введения эритроцитарного аутогемолизата офтальмоскопически во всех обследованных глазах (4 глаза, 2 кролика) отмечено расширение вен сетчатки; на 6 и последующие сутки - появление экстравазатов в виде геморрагий различной формы и плазморрагий округлой формы желтоватого цвета. Подавляющая часть экстравазатов сохранилась спустя 2 недели после окончания курса введения аутогемолизата. Электрофизиологические исследования выявили следующее: 1) В норме (до введения эритроцитарного аутогемолизата значения \а\- и \в\-волн ГФ-ЭРГ составили 57,2±6,8 мкВ и 186,5±14,0 мкВ; РЭРГ на 12 Гц и 32 Гц - 92,8±5,2 мкВ и 13,6±0,7 мкВ, соответственно. Сразу после окончания курса внутривенного введения эритроцитарного аутогемолизата отмечено резкое угнетение ретинального электрогенеза: величина всех биопотенциалов сетчатки снизилась до микро - ЭРГ. Амплитуда \а\-волны ЭРГ угнеталась в среднем с 57,2 мкВ до 4,2 мкВ, то есть составляла лишь 7% от исходного уровня. Еще большей депрессии (до 2,6% от нормы) подверглась \в\-волна общей ЭРГ, характеризующая нейрональную активность сетчатки и функцию глиальных клеток Мюллера: с 186,5 мкВ до 4,9 мкВ. РЭРГ на низкие и высокие частоты стимуляции также снизились до 6-7% от исходных значений. Спустя 2 недели после окончания введения эритроцитарного аутогемолизата происходило частичное восстановление показателей ЭРГ, причем возрастание \в\-волны опережало восстановление других биопотенциалов сетчатки. Величина ответа возвращалась практически к нормальным значениям и в среднем по группе составила 173,0±8,0 мкВ. Амплитуды ритмических ЭРГ на все частоты стимуляции восстановились до 68-69% исходных величин (РЭРГ на 12 Гц возросла с 5,5±0,6 мкВ до 63,5±2,4 мкВ, РЭРГ на 32 Гц возросла с 0,9±0,04 мкВ до 9,4±0,07 мкВ). Функциональная активность наружных слоев сетчатки через 2 недели после введения эритроцитарного аутогемолизата оставалась существенно сниженной - \а\ волна ЭРГ повысилась лишь до 34% нормы.

Пример 1. Кролику весом 2,5 кг ежедневно внутривенно вводили эритроцитарный аутогемолизат, приготовленный по вышеописанному способу, по 0,5-0,7 мл в течение 10 дней. До введения эритроцитарного аутогемолизата на глазном дне обоих глаз офтальмоскопически не выявлено изменения калибра кровеносных сосудов, экстравазатов. На 4 сутки после введения этитроцитарного аутогемолизата отмечено расширение вен сетчатки, на 6, 8, 10 сутки появились небольшие геморрагии (округлые и штрихообразные) и плазморрагии - округлой формы, желтоватого цвета. После окончания курсового введения эритроцитарного гемолизата экстравазаты сохранялись в течение всего времени наблюдения - до 20 суток.

Электрофизиологические исследования: до введения эритроцитарного аутогемолизата значение \а\- и \в\- волн ГФ - ЭРГ на правом и левом глазу были равны 65,0; 63,0 мкВ и 175,0; 180,0 мкВ, соответственно. РЭРГ (на правом и левом глазу) на 12 Гц и 32 Гц - 90,0; 95,0 мкВ и 13,0; 14,0 мкВ, соответственно. Сразу после окончания курса внутривенного введения эритроцитарного гемолизата отмечено существенное угнетение ретинального электрогенеза: величина всех биопотенциалов сетчатки снизилась до микро- ЭРГ. Амплитуда \а\- волны ЭРГ снизилась до 3,5; 4,5 мкВ (на правом и левом глазу, соответственно); волна \в\- подверглась еще большей депрессии и составила 4,5 и 4,0 мкВ на разных глазах. Через 2 недели после окончания введения эритроцитарного аутогемолизата произошло частичное восстановление показателей ЭРГ, при этом возрастание \в\- волны опережало восстановление других биопотенциалов сетчатки, составив 150,0 и 160 мкВ (правый, левый глаз), волна \а\- 45,0 и 40,0 мкВ; величина РЭРГ на 12 Гц составила 60,0 и 65,0 мкВ; значения на 34 Гц, соответственно, составили 9,5 мкВ на правом и 10,0 мкВ на левом глазу. У данного кролика результаты исследований (офтальмоскопия, ЭРГ) показали, что спустя 2 недели после окончания курсового введения эритроцитарного аутогемолизата явления ретинопатии на обоих глазах сохраняются.

Таким образом в эксперименте на животных показано токсическое действие эритроцитарного аутогемолизата, содержащего гемоглобин, который блокирует серотониновые рецепторы, широко представленные в периферическом отделе зрительного анализатора и вызывает развитие ретинопатии.

Эффект внутривенного введения эритроцитарного аутогемолизата проявился очевидно как в блокаде серотониновых рецепторов микроциркуляторного русла сетчатки, так и резком угнетении ретинального электрогенеза с депрессией всех волн ЭРГ.

Через 2 недели после прекращения введения эритроцитарного аутогемолизата функциональная активность скотопической и фотопической системы сетчатки, определяемая с помощью ритмической ЭРГ восстановилась до 68-69% от нормы; \а\ - волна ЭРГ достигла лишь 34% от исходных значений. Офтальмоскопически, в течение всего периода наблюдения после окончания введения аутогемолизата определялись экстравазаты в виде геморрагий и плазморрагий. Т.о., полученные результаты эксперимента свидетельствуют о развившейся ретинопатии с нарушением микроциркуляторного русла сетчатки и стойким нарушением электрогенеза сетчатки кролика.

Источники информации.

1. Иванина Т.Н., Зуева М.В. SU 1517060 \Способ моделирования ретинопатии\, 23.10.89 г.

2. Многотомное руководство по глазным болезням. Медгиз 1962, том 3, книга 1, с.21-22.

3. Симоненков А.П., Федоров В.Д. Является ли хроническая серотониновая недостаточность основой диабетической и возрастной ангиопатией? Бюлл.Эксп.Биол.Мед., 1997; 123(1): с.103-110.

4. Osborn N.N., Chidlow G. Do beta-adrenoreceptors and serotonin 5-HT1A receptors have similar functionsin the control of intraocular pressure in the rabbit. Ophthalmologica 1996, 210(5), P.309-14.

5. Pootanakit К, Prior К., Hunter D.D. 5 - HT2a receptors in the rabbit retina - potential presynaptic modulators. Vis. Neurosci. 1999, 16(2), P.221-30.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для моделирования ретинопатии, специфически связанной с патогенезом сосудистой природы. Способ включает внутривенное введение кролику эритроцитарного аутогемолизата, получаемого замораживанием эритроцитарной массы, в количестве 0,5-0,7 мл один раз в сутки, в течение 10 суток. Причем замораживание эритроцитарной массы проводят при t=-17°С в течение 24 часов. Способ позволяет получить адекватную модель сосудистой ретинопатии, приближенную к ее течению у человека, за счет блокады аутогемолизатом серотониновых рецепторов в сосудах сетчатки и нервном аппарате периферического отдела зрительного анализатора. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ моделирования ретинопатии, отличающийся тем, что внутривенно кролику вводят эритроцитарный аутогемолизат, получаемый замораживанием эритроцитарной массы, в количестве 0,5-0,7 мл один раз в сутки в течение 10 суток.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что замораживание эритроцитарной массы проводят при t=-17°C в течение 24 ч.